Name: アメーバ共培養し、アメーバ濃縮アプローチによって新しい細胞内病原体の発見 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-27T23:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学ぶアメーバ共培養法による新規細胞内病原体の発見手法。環境・臨床試料からアメーバを用いて細菌を選択的に培養し、顕微鏡観察とゲノム解析で新種を同定する革新的な微生物学技術です。

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私たちは、Prを感謝します。有用な技術アドバイスやアメーバ共培養し、アメーバの濃縮についての興味深い議論についてベルナールラ·スコラ。我々はまた、我々の研究室で技術を実施する中で彼の助けのために博士ヴィンセントトーマスに感謝します。

1。アメーバの共培養 1.1サンプル調製<ol><li> 環境試料 <ol><li> 水サンプル 0.22μmの孔サイズの膜を通して水サンプル（1 L 500 ml）を絞り込む。そして、ページのアメーバ生理食塩水媒体中のPASのNaCl（120ミリグラム、 硫酸マグネシウム4mgの•7H 2 O、塩化カルシウム2•2H 2 Oの4ミリグラムのNa 2 HPO 4の142ミリグラム、およびKHの136ミリグラムで膜を振る蒸留水1 L 2 PO 4）。 </li><li> 固体サンプル 蒸留水またはPBS中の活性汚泥などの土壌や砂のサンプルおよび半固体のサンプルのような固体試料を再懸濁し、0.22μmの孔サイズの膜を介してそれらをフィルタリング。その後、PASで膜を振る。 </li><li> 高度内因性アメーバ原虫で汚染サンプル 第一の低速遠心分離（180×g）でのfoによってサンプルを沈降rは10分以上5μmの孔サイズの膜を介して濾過する。さらに1.1.1のように、上清（それぞれろ液）を処理する。 注：他の汚染除去技術は、さらに環境サンプルを除染するために使用され得る：30分間50℃で試料を加熱または酸性もしくは塩基性溶液で処理する14。 </li></ol></li><li> 臨床サンプル それらの物理化学的特性に応じて、臨床サンプルを処理する。大規模な不純物を除去するフィルタまたは遠心分離機の液体。固体試料を懸濁します。 、組織を用いるダウンスhomogeneiserまたはガラスビーズを用いて、例えば、それらを粉砕し、細胞内細菌を解放するために細胞を溶解すること。 </li></ol> 1.2アメーバ準備<ol><li> スープの準備 、プロテオースペプトン、100gの、酵母エキス10g、MgSO 4で •7H 2 4.9gのペプトン、酵母エキスおよびグルコース（PYGを含有するリッチ培地：次のメディアを調製O、クエン酸ナトリウム5gの•2H 2 O、Feの（NH 4）0.1gの2（SO 4）2•6H 2 O、KH 2 PO 4、のNa 2 HPO 4 1.97gの1.7gの•7H 2 Oグルコース45gを、蒸留水5中のLのCaCl 2 0.295 g）および、例えばアカントアメーバ種についてPAS等の非栄養培地。 </li><li> アメーバ文化 <ol><li> PYG培地30mlを含む細胞培養フラスコ中で25℃で、アメーバ（優先アメーバカステラーニ ATCC 30010またはA.多食亜目のLinc-AP1）を栽培しています。 </li><li>フラスコを激しく振盪により​​アメーバを収穫し、1,500 X gで10分間、細胞懸濁液を遠心分離。 PAS培地で2回ペレットを洗浄。 KOVAスライドに細胞を計数し、ミリリットル当たり5×10 5細胞の懸濁液を得るために音量を調整する。 </li><li>マイクロプレートにアメーバサスペンションを転送します。 12ウェル当たり1ミリリットルを使用する - と24-Wエルプレート、48ウェルプレートおよび96ウェルプレートを300μlの500μlの。 25℃で少なくとも2時間、マイクロプレートをインキュベートこれは、各ウェルの底にアメーバの沈降と添付が可能になります。 </li></ol></li></ol> 1.3共培養<ol><li> サンプル接種 <ol><li>希釈していない試料100μlを皮切りに、通常の10倍希釈系列で、1.1または1.2からのサンプルの段階希釈を2.3.3からプレートに接種。 </li><li>サンプル中の微生物が存在する可能性アメーバ芝生の上の堆積物に10分間1800×gでマイクロプレートを遠心分離する。これはアメーバによる接触や微生物の食作用を増大させる。 </li><li> 25°Cで45分間プレートをインキュベートし、新鮮なPASでメディアを置換することによりPASで三回洗浄する。または抗生物質を添加せずにPASのウェルあたり1ミリリットルを追加します（ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシンおよび/またはバンコマイシン）、バクテリオに応じて検索される他種。 </li><li>アメーバのシストを​​避けるために、加湿雰囲気中で32℃でマイクロプレートをインキュベートする。アメーバに侵入し、溶解する細菌の存在を検出するために、20倍の対物レンズで毎日各ウェルを観察します。 </li><li>溶解の場合は、約10 5アメーバ/ cm 2の単層に共培養液100μlを接種することによって、新鮮なアメーバにサブカルチャーを実行します。特に指定された細菌種を単離するために、これらの細菌（ レジオネラ属菌のためのすなわち BCYE寒天。）用に設計された特定の寒天培地にも接種する。 </li><li>溶解がない場合には、四から七日最初の接種後の共培養液100μlを取り、24穴プレートに900μLの新鮮アメーバ文化を接種する。アメーバの急速な溶解が細菌の増殖せずに観察された場合、ウイルスが存在する可能性があります。この場合は、0.22ミクロンで、上清をフィルター処理し、新鮮なアメーバに感染するために濾過サスペンションを使用しています。 </li></OL&gt; </li></ol> 1.4細菌の単離と特性評価<ol><li> 細菌の染色 マイクロプレート24ウェルにカバーガラス上に直接共培養を行う。培地を除去し、染色または免疫蛍光を行う。 <ol><li>修正されたロマノフスキー染色<ol><li>カバーガラスを乾燥させる。カバーガラスを固定液（2 mg / Lのファストグリーンメタノール中）で5回浸す。 </li><li>染色溶液中でカバースリップを5回浸すI（リン酸緩衝液pH 6.6で1.22グラム/ LエオシンG） </li><li>最後に、染色溶液II（リン酸緩衝液pH 6.6中1.1グラム/ Lのチアジン）でカバースリップを5回浸す。 </li><li>蒸留水でサンプルを洗浄します。乾燥させ、および顕微鏡によって観察する。 </li></ol></li><li>チールネルゼン染色<ol><li>カバーガラスを乾燥させる。チールフクシンでサンプルをカバーしています。蒸気が表示されるまで炎で色素を加熱します。 </li><li>少なくとも5分間、室温でクール蒸留水ですすいでください。 2分間のイソプロパノール中、3％の塩酸溶液でサンプルをカバーし、蒸留水ですすいでください。 </li><li>メチレンブルーで30秒間カバーし、蒸留水ですすいでください。乾燥させ、および顕微鏡22で観察します。 </li></ol></li><li>ヒメネス染色<ol><li> 10％塩基性フクシン（100ミリリットルの95％エタノール中で塩基性フクシンの10g）を100mlの4％水性フェノール及び蒸留水650mlを250mlのを混合することによって塩基性フクシンのストック溶液を調製する。使用前に48時間、37℃でインキュベートする。 </li><li>カバーガラスを乾燥させ、炎を通過させることにより固定する。新たに濾過塩基性フクシン2分間（0.1ml、10mlのMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.45で塩基性フクシンストック溶液4ml）でサンプルを覆う。 </li><li>水でサンプルをすすぎ、10秒間マラカイトグリーン（蒸留水中0.8％）でインキュベートする。水で再び洗浄し、マラカイトグリーンの染色を繰り返します。再び水ですすいでください。カバーガラスを乾燥させ、Mそれをountし、顕微鏡23で観察します。 </li></ol></li><li>免疫蛍光<ol><li> 10分間、4％メタノール中で5分間インキュベートすることにより、またはパラホルムアルデヒドでカバーガラスを固定します。 </li><li> PBSで3回洗浄し、室温で溶液（5％BSA、PBS中0.1％サポニン）をブロックの中で2時間インキュベートする。 </li><li>興味のある微生物に対して産生された抗体を含むブロッキング溶液中で1時間カバースリップをインキュベートする。 </li><li> PBS中で再び3回洗浄し、一次抗体に対する蛍光団にリンクされた二次抗体で1時間インキュベート。 PBSで3回洗浄、カバースリップをマウントし、蛍光顕微鏡で観察します。 </li></ol></li></ol></li><li> PCRによるDNA検出 アメーバ共培養の100〜200μLからDNAを抽出します。例えば、マイコバクテリア24種のような目的のために、16S rRNA遺伝子または特異的なプライマーを標的ユニバーサルプライマーを用いて微生物を検出する、レジオネラ25またはクラミジア 26のメンバー。 </li></ol> 2。アメーバ濃縮 2.1。試料調製ボルテックスにより、PAS中の固体や半固体試料を懸濁します。 10分間低速（180×g）で懸濁物を遠心分離する。これは、ペレットに自由生活アメーバの濃縮を可能にする。上清をアメーバ共培養し、アメーバ濃縮21用のペレットに使用することができます。 2.2。培地調製<ol><li> PASの100ミリリットルに寒天を1.5グラムを加え、121℃で培地15分オートクレーブペトリ皿に温培地を注ぎ、室温で固化してみましょう。 </li><li> 37℃で一晩、LBまたはチオグリコール酸ブロス中の大腸菌 （ATCC 25922）を育てるPBSで2回細菌を洗浄し、PAS培地で再懸濁します。 PASで10倍に希釈し、PAS寒天プレート上でこの希釈2-3ミリリットル広げて乾燥させます。 </li></ol>板の片面に試料の滴（又はフィルタの個数）を追加し、皿の中央に線を形成するペトリ皿上を流れてみましょう。 2.4。アメーバ成長とアメーバサブカルチャー<ol><li>毎日のペトリ皿を観察します。アメーバ移行フロントが検出された場合、移行前に寒天の小片を切り出し、Eの芝生で覆われ、新鮮なNNAペトリ皿に接種大腸菌 。 </li><li>所与アメーバ株の純粋培養物を得るために、試料の純度に応じて再接種を複数回繰り返す。 </li></ol> 2.5。アメーバや細菌特性評価<ol><li>細胞をこすり落とし、PASで再懸濁します。 </li><li> （例えば、アメーバおよび配列決定のために細菌の16SrRNA増幅、RESP。18S rRNAの）DNAを抽出し、PCRおよび配列決定によりアメーバおよび/または細菌内部共生の同一性を決定する。 </li> &lt;李は&gt;新鮮アメーバに接種し、試料中に存在する可能性細菌を検出するためにアメーバの共培養を行うために、PASでこれらの掻きセルを使用。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

アメーバ共培養及びアメーバ濃縮は、多くの新しい細菌やアメーバ種の単離を可能に効率的な方法である。これらの方法で得られた結果は、環境中で、最も興味深いことに、このような塩素化及びオゾン処理等の化学処理によって制御されると考えられる人工水中ネットワークにおけるアメーバとアメーバ耐バクテリアの両方のユビキタス存在を確認する。アメーバ共培養及びアメーバ濃縮は隔離し、栽培し、これらの潜在的に病原性の微生物をし、さらにその生物学と病原性を研究するために、純粋な文化の中で株を取得するために不可欠なツールです。最近では、この方法は、巨大なウイルス41のハイスループット分離のために適合させた。同様に、アメーバの共培養は、自動化された環境試料や、飲料水などの人工の水システムの微生物学的品質をテストするために日常的技術として使用される可能性があります。 アメーバ共培養することができアメーバの異なる種を用いて実施することができる。我々は通常、 アカントアメーバカステラーニまたはAを使用することを好む彼らはHartmannellaの虫垂</e...

分子診断の出現する前に、環境ニッチや臨床サンプル中に存在する微生物は、多くの場合、主にペトリ皿に寒天上に、別の選択培地上で培養することによって検出された。細菌コロニーとその代謝活性の表現型は、その後、種レベルで細菌の分類を可能にした。ブロスはまた、検出の感度を増加させるために使用されてもよい。しかし、両方の技術は、これらすべてのメディアにゆっくりか成長した細菌の回復を認めていない。これは、分子のアプローチは非常に広く、最近使用されている理由です。それにもかかわらず、DNAの検出は、細菌の生存には何の手掛かりを提供しません。また、逆に文化に、分子のアプローチをさらに特徴づけることができるひずみを生じない。 成長する固体培地またはその必要性細胞にあまり増殖する病原体を研究することは複雑である。これらの「成長させることは困難」細菌のほとんどは気難しいINTRです無細胞、細菌、頻繁に発見され、それがレジオネラ·ニューモフィラの場合と同様に大規模な流行、以下を特徴とする。この細菌は米国在郷軍人会の大会中に発生した発生後特徴付けられた。できるだけ多く182のような人が感染していたと29は、重症肺炎の1,2に死亡した。それは後にアメーバがこの細菌の自然宿主であることを示したし、そのホテルの空調システムにおけるプレゼンスと水ネットワークは、いわゆるレジオネラ病3の発生の原点にあったことだった。 アメーバは、世界中に存在し、土壌、大気、水、（4に概説されている）ヒトのボランティアの鼻粘膜から単離した。これらの「自由生活」アメーバは一般的な環境で自律的に分裂しているが、時折許容宿主5に侵入することがあります。 HYによる食作用およびその後のリソソーム消化を通して様々な微生物にアメーバフィードdrolases 6。多くの通性または偏性細胞内細菌は、消化に抵抗し、このように感染し、例レジオネラ 、 クラミジアに関連した細菌やマイコバクテリアに関してはアメーバに分ける（7に見直され、8）することができます。自由生活アメーバは、おそらくまだ発見されていない細胞内細菌のための重要な潜在的な貯水池を表しています。これはローザンヌに異なるグループは、様々な環境試料9月15日から、いくつかの新しい偏性細胞内微生物を分離するために許可されたアメーバの共培養及びアメーバ濃縮と呼ばれる二つの主要な技術を実装するために私たちのグループを主導した。 アメーバは細菌に放牧専門の食細胞であることから、食作用に抵抗し、これらの原生生物の内部で増殖することができる細菌は、人間の食細胞にコロニーを形成し、人間に向けた病原性かもしれません。これは、部分的なWaddlia町などの一部クラミジア関連細菌のために証明されたndrophila。 W·chondrophilaはアメーバではなく、哺乳動物の上皮細胞、マクロファージ、および魚類細胞株16〜18のようないくつかの細胞型だけでなく成長することができます。アメーバ共培養も大きく異なる細菌種21で汚染されているスツールを含む臨床サンプル19,20、細胞内細菌を検出するための関連が表示されます。 無菌メディアにアメーバの（b）の成長と大腸菌の細菌ローン上および（C）の選択および特性、ここで我々は、環境や臨床サンプルの（a）の治療を含む、アメーバの共培養及びアメーバ濃縮の主な手順を説明します細胞内細菌の。

<table><tbody><tr><td>グルコース・モノハイドレート</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu;m 細孔径</td><td>膜 メルク ミリポア、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>SCVPU11RE</td><td></td></tr><tr><td>プロテオース ペプトン</td><td>ベクトン・ディッキンソン、フランクリン・レイクス、ニュージャージー</td>州 <td>211693</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>ベクトン・ディキンソン、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ</td><td>ベクトン・ディキンソン、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>コバ・スライド・</td><td>ハイコー、インディアナポリス、インディア</td><td>ナ州87144</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養マイクロプレート</td><td>Corning Inc, Corning, NY</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Diff-Quik 染色キット</td><td>Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany</td><td>130832</td><td></td></tr><tr><td>Ziehl fuchsin</td><td>Fluka, St-Louis, MI</td><td>21820</td><td></td></tr><tr><td>basic fuchsin</td><td>Sigma, St-Louis, MI</td><td>857843</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Sigma</td><td>, St-Louis, MI</td><td>P1037</td><td>腐食性および変異原性</td></tr><tr><td>マラカイト緑色のシュウ酸塩</td><td>Fluka、セントルイス、ミシガン州</td><td>63160</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド16%溶液</td><td>電子顕微鏡科学、ハットフィールド、ペンシルバニア</td><td>州15710</td><td></td></tr><tr><td>サポニン</td><td>シグマ、セントルイス、ミシガン州</td><td>84510</td><td></td></tr></tbody></table>

アメーバ共培養し、アメーバ濃縮アプローチによって新しい細胞内病原体の発見

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

このようなレジオネラ、マイコバクテリアおよびクラミジア様生物などの細胞内病原体は、彼らは多くの場合、全く通常の細菌を培養するために使用されている選択培地上で悪いか成長しないために分離することは困難である。このため、これらの病原体の多くは、ごく最近になって発見されたり、重要な発生を、以下の通りであった。これらの病原体は、しばしば、宿主細胞として機能し、細​​菌の生存および増殖を可能アメーバ、関連付けられている。アメーバ共培養及びアメーバ濃縮：私たちは、臨床的または環境試料中の細胞内病原体の単離および特徴が存在できるように2つの技術のデモを提供するために、ここにいきたいと考えています。アメーバ共培養は、試料中に存在する細胞内細菌に感染して溶解することができるアメーバの芝生の上に調査したサンプルを接種することにより、細胞内細菌の回収を可能にする。アメーバ濃縮は、臨床的または環境試料中のアメーバの回復が存在できます。目だけでなく、これらのアメーバで特異的に成長している新たな細胞内細菌の新たなアメーバ種の発見につながることができている。一緒に、これら2つの技術がアメーバに増殖することができる新たな細胞内細菌を発見するのに役立ちます。なぜならアメーバ感染し、食作用に抵抗するそれらの能力のために、これらの細胞内細菌はまた、マクロファージによる貪食を逃れる可能性があり、従って、高等真核生物に対して病原性である。

アメーバ共培養及びアメーバ濃縮を使用して、環境、および/ ​​または病原性細菌の全範囲（ 表1）に発見された。 アメーバ共培養は、環境試料、水処理プラント、水分配システムを分析するために我々のグループ等で使用されていた。広範囲の微生物は、この技術を用いて単離することができた。アメーバ共培養により単離し、最も一般的な細菌は、水処理プラントからの水のネットワーク13,14,24,27,28から回収することができたマイコバクテリア属のメンバーである。 レジオネラ及びα-プロテオバクテリア種は、水処理プラントから単離することができるそして病院の水網14,24,28-31から。いくつかのクラミジア関連の種はまた、例えばエストレージlausannensis（ 図2B-C 12,15,32,33については、河川水と水処理施設から単離した。 <p claSS = &quot;jove_c...

アメーバ共培養は、選択的アメーバおよびマクロファージなどの食細胞に耐え細胞内病原体を成長させるために接着性アメーバを用いた細胞培養系である。したがって、新たな感染性病原体を発見するための重要なツールを表しています。アメーバ濃縮は、新たアメーバ種とそれらの特異的な細胞内細菌の発見を可能にする。

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

本実験の全体的な目的は、環境試料または臨床試料中に存在する、新たな潜在的細胞内病原体を単離することです。これは、目的の試料をAMEの培養液に接種し、アメーバへの侵入および増殖が可能な細菌を選別することで達成されます。次に、溶菌したアメーバ、または明確な細胞内増殖が観察されたアメーバをさらに解析し、微生物を種レベルで同定します。その後、アメーバ共培養法で細菌の増殖が得られなかった場合は、特定の細胞内細菌を含んでいる可能性のある内因性アメーバを検出するために、アメーバ濃縮を行います。この革新的な手法による結果として、新種の細菌や新規ウイルスの分離が得られており、これらは顕微鏡観察やゲノム解析などのアプローチを用いてさらに特性評価することが可能です。これらの手法の、共培養や哺乳類細胞培養などの他の既存の手法に対する主な利点は、絶対細胞内細菌の分離に適用できることや、複雑な微生物コミュニティを含む汚染しやすい試料に対してもこの手法を容易に適用できることです。私の研究室のBAテクニシャンであるSebastianに、手順のデモンストレーションをしてもらいましょう。水サンプルの試験では、500〜1000 mLのサンプルを孔径0.22 µmのメンブレンでろ過します。次に、そのメンブレンをPBS、アメーバ用生理食塩水、またはPASに入れ、振盪させます。土壌、砂、活性汚泥などの固形サンプルの場合は、蒸留水またはPBSで再懸濁させ、孔径0.22 µmのメンブレンでろ過してください。膜を激しく振り、30 mLのPYG培地を含むセルカルチャーフラスコを用いて25 °Cで一晩培養し、アメーバを回収します。フラスコを振り、細胞懸濁液を1500 Gで10分間遠心分離します。培地を用いてペレットを2回洗浄します。その後、covisスライドを用いて細胞数をカウントし、5 × 10⁵ cells/mLの懸濁液になるよう液量を調整します。懸濁液を24ウェルマイクロプレートの各ウェルに1 mLずつ分注し、25 °Cで少なくとも2時間インキュベートして、Abeをウェルの底面に沈降・付着させます。その後、未希釈の試料100 µLから開始します。フィルター後の水で再懸濁し、ろ過した土壌溶液、または培養液を10倍段階希釈し、各プレートに接種します。微生物による接触と食作用を促進するため、マイクロプレートをABI遠心機を用いて1800 Gで10分間遠心分離します。プレートを25 °Cで45分間インキュベートした後、PASSを用いて3回洗浄します。その後、抗生物質を含む、または含まないPASSを各ウェルに1 mLずつ加えます。次に、マイクロプレートを32 °Cの加湿状態でインキュベートします。アメーバの消失を防ぐため、20倍の対物レンズを用いて毎日各ウェルを観察し、細菌がアメーバに侵入して溶菌させていないかを確

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

微生物の真核生物では、永久に氷に覆われた南極湖沼における光合成由来の炭素とトップ捕食種のソースの両方があります。このレポートでは、南極の湖、ボニー湖から代謝的に汎用性の高い微生物の真核細胞を分離するために集積培養のアプローチを説明し、リブロース-1,5  -...

化学的に成層南極湖と炭素固定ポテンシャルの評価から微生物真核生物濃縮文化の確立

Source: Dubois, V., et al. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the procedure of co-culturing amoebae with mutant bacterial strains to evaluate their intracellular survival and identify virulence markers through differences in colony counts.

Detecting Bacterial Virulence Using Amoeba as a Host System

この手法は、収穫する方法を提供するものであり、哺乳動物細胞の感染に先立って自然原虫の宿主細胞にあらかじめ栽培されている細菌性病原体の細胞内増殖を正常化し、定量化する。このメソッドは、プライミング段階のための宿主細胞、ならびに標的細胞の種類の多種多様に対応するように変更することができます。...

原虫でプライミング細菌で扱いやすい哺乳動物細胞感染

細菌は、その微生物の隣人の生理機能に影響を及ぼす可能性があり、分泌された化合物を製造する。ここでは、固体培地上で枯草菌の蛍光転写レポーター株と土壌微生物を混合することにより、このような化学的に仲介される種間の相互作用の検出を可能にする共培養画面について説明します。...

化学的に媒介種間相互作用を検出するための共培養を使用して

ここでは、巨大ウイルスの新しいアスファルウイルス関連系統であるファウストウイルスの新しい遺伝子型の特性評価のためのウイルス分離における最新の進歩について説明します。このプロトコルは、ウイルス、特にアメーバに感染する巨大ウイルスのハイスループット単離に適用できます。...

用いた環境サンプルから新規Faustovirusesの単離のための迅速な戦略<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

(1)細胞内細菌性病原体を標的とする真核生物の細胞浸透性抗菌薬を同時に同定し、(2)真核生物の細胞毒性を評価するために、ハイスループットのリアルタイムアッセイが開発されました。その後、同じ技術のバリエーションをデジタル分注技術と組み合わせて、簡便で高解像度の用量反応、および 2 次元および 3...

高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

ここでは、提案する食細胞-結核菌 abscessusの相互作用を調査する 2 つのプロトコル: 細菌の細胞内の欠乏と RNA...

貪食細胞における細胞内のレプリケーションの結核菌 abscessusの病原性マーカーの同定

ここでは、ホストとしてD. キイロタマホコリカビ(アメーバ) を用いた浮遊性や表面に接続された細菌の病原性を測定するためのプロトコルを提案する.1 時間の期間にわたって病原性を測定し、ホストを殺すは、蛍光顕微鏡、画像解析を用いた定量化されます。緑膿菌を使用してこのプロトコルを示す.

アメーバを用いた急速なイメージに基づく細菌の病原性試験

本論文では、静止画、蛍光画像、高解像度透過電子顕微鏡画像を用いて研究されたクリプトコッカス細胞とアメーバの共培養を調製するためのプロトコルについて詳しく述べたい。次に示すように、定量的データがこのような定性的情報を補完する方法について説明します。...

クリプトコッカスの研究における顕微鏡技術と蛍光読解の補完的利用-アメーバ相互作用

このプロトコルで提示される共培養相互作用アッセイは、安価で高いスループットとシンプルです。これらのアッセイは、共培養における微生物相互作用を観察し、相互作用パターンを同定し、ヒトおよび環境病原体に対する関心のある微生物株の阻害可能性を特徴付けるために使用することができる。...

微生物相互作用の調査のための高スループット共培養アッセイ

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化イメージング質量分析 による...

イメージング質量分析 による 寒天上および感染組織内で増殖した細菌コロニーの微生物連携の検討

学ぶアメーバ共培養法による新規細胞内病原体の発見手法。環境・臨床試料からアメーバを用いて細菌を選択的に培養し、顕微鏡観察とゲノム解析で新種を同定する革新的な微生物学技術です。

アメーバ共培養し、アメーバ濃縮アプローチによって新しい細胞内病原体の発見

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