昆虫に行動可塑性を調査するためのテングザルの拡張レスポンスプロトコル：基本、生物医学および農業研究への応用

本手順の全体的な目的は、ミツバチにおける食物に対する単純な反射反応の行動条件付けの実装方法を示すことです。まず、ミツバチを捕獲してハーネスで固定し、少量の糖液を給餌し、拘束状態に慣れさせます。次に、ショ糖で触角を刺激した際に十分な動機付けを示す個体を選択し、条件付けを行います。

条件付けの間、条件反応を誘発するために、臭いの提示とショ糖による報酬を対提示させます。次に、非強化試行を行い、反応の有無、反応潜時、および反応時間を測定します。最終ステップは、条件付けおよびテスト試行のデータ解析とグラフによる提示です。

この手法は、ミツバチの生物学および健康に関する研究にうまく適用されてきました。学習行動は、殺虫剤などの妨害処理に対して特に敏感であるため、亜致死量レベルでのこれらの処理がミツバチの行動に与える影響を評価することが可能です。この方法を視覚的に実演することで、効果的な条件付けに必要な刺激のタイミングや、有効性を低下させる一般的な誤りを理解するのに役立ちます。この手法に不慣れな個人は、プロトコルと周囲の条件の両方で求められる細部への注意に苦労するでしょう。

まず、巣門で待機しているか、または採餌から戻ってきた働き蜂を採取します。1本のバイアルにつき1匹の蜂のみを捕獲してください。蜂が逃げ出さないよう、バイアルの開口部を水平または下向きに保持しながら蓋を締めてください。

ミツバチを回収した後、ラボに戻り、一度に数本のバイアルを氷水のスラリーに入れます。ミツバチが不動になったら、過剰な露出を避けるために直ちにバイアルを氷から取り出し、拘束用ハーネスに固定します。ミツバチの背面の胸部がホルダーの切り欠き部分に向くようにし、頭部が上端のすぐ上にくるようにして固定してください。

ミツバチを軽く押し、口器がホルダーの端から外に出るようにします。ダクトテープの断片を頭部と胸部の間の背面に差し込み、自由端をホルダーの側面にしっかりと固定します。ハーネスのテープにシワがなく、ピンと張っていることを確認してください。

ビーホルダーの前部とテープの間に目立つ隙間がないようにしてください。隙間があると、蜂が足を適切に伸ばせなかったり、逃げ出したりする可能性があります。ハーネスを装着した後、給餌する前に約30分間、蜂を回復させてください。

その後、訓練エリアから十分に離れた場所で、給餌から条件付けまでの間隔に、各ミツバチに0.5 molarのスクロースを約3～4 µL投与します。ミツバチを研究室の静かな場所に置き、濡れたペーパータオルを入れたプラスチック容器に入れておきます。この間、条件付けを開始する数分前に、0.5 molarのスクロース溶液の小さな液滴で触角に触れさせ、ミツバチの摂食意欲を促します。

この試験の間、餌を与えないでください。もし蜂がpsisisを伸ばして反応した場合、学習への動機付けが十分になされていると考えられ、プロトコールに使用できます。準備が整ったら、ガラス製臭気シリンジを粘土製のホルダーに固定し、幅の広い方の開口部が蜂に直接向くように調整します。シリンジの先端を蜂から1〜2 cmの位置に配置し、カートリッジとエアストリーム配管およびバルブシステムを接続するフィッティングを、シリンジの細い方の端にしっかりと固定してください。

各試行の開始時に、ハーネスを装着したミツバチを条件付けアリーナのペグ上に配置し、触角が臭気カートリッジの方向を正対するようにします。ミツバチが新しい環境に慣れるため、臭気刺激を開始する前にアリーナ内で15〜25秒間静止させます。スタートボタンを押し、臭気提示のためのタイミングメカニズムを作動させます。

刺激の開始後、無条件刺激を提示するまで、 odor（臭気）に対するハチの反応をモニターします。各試行の後、初期記憶の形成を促すため、ハチを条件付けエリア内でさらに15〜25秒間休ませてください。試行後すぐにハチを移動させると、各条件付け試行の有効性が著しく低下します。

スクロースを投与するには、臭気を提示している間、針先をミツバチから2〜3cm離して保持します。シリンジを振るとミツバチの注意が逸れる可能性があるため、トレーニングアリーナの端を利用して固定してください。臭気刺激の提示中に、給餌信号音が鳴ります。

給餌の合図が聞こえたら、ミツバチが口吻を伸ばすまで触角を軽く刺激し、その後、ミツバチに給餌します。臭気の提示とショ糖の提示のタイミングが極めて重要です。理想的には、これら2つの刺激が短時間重なるようにしてください。

臭気の提示からスクロースの提示までに数秒以上の間隔が空くと、条件付けの成績が低下します。条件付けの後、非強化テスト試行を行い、ミツバチが条件付けされた連合をどの程度記憶しているかを確認します。まず、トレーニングエリアの上に三脚でビデオカメラを設置し、触角と口吻が鮮明に写るように、ミツバチの頭部の正面にピントを合わせます。

臭気刺激の提示を示す小型LEDライトを、ビデオで確認でき、かつハチからは見えないハチの背後のエリアに配置してください。これにより、解析時に臭気提示の開始時間と終了時間を特定することが可能になります。最も一貫した結果を得るためには、すべてのセットアップが完了した後、テストに新鮮に調製した臭気カートリッジを使用してください。

前述の方法で臭気を提示し、テストを開始します。臭気を提示する20秒前から録画を開始し、提示後少なくとも20秒間は録画を継続してください。テスト後、ビデオ編集ソフトウェアを使用して、刺激に対する各ミツバチの反応をスコア付けします。

psis伸展反応を、陽性または陰性のいずれかで判定する二値スコアリングシステムを用います。Bの反応を陽性と判定します。開いた大顎の先端を結ぶ線を超えてBがpsisを伸展させた場合、臭気提示後かつ臭気消失前にprob boisを伸展させたときのみ陽性反応としてスコア付けします。試験中にprob boisの伸展が見られない場合、または臭気物質の消失後にprob boisが伸展した場合は、Bの反応を陰性とスコア付けします。伸展までの潜時や、条件に対する伸展反応の回数および総持続時間などの他のパラメータを収集することも可能です。

その後の条件付け試行を通じて、刺激を増強させた。刺激と炭素鎖の長さまたは炭素-炭素結合の位置が異なる新規テスト臭への反応は、条件刺激と新規テスト臭の差異の程度に比例して減少した。これらのデータは、新規研究者間における変動性と条件付けの成功を示している。

octalに対する反応は、テストを行った群によって異なりました。テスト試行において、条件刺激として用いた臭気で最も強い反応が引き出されました。octalを条件刺激として用いた場合、新規の臭気であるmethyl cycloneを用いた場合と比較して、テスト時の反応がより強くなりました。

同様に、メチルシクロプロパンを条件刺激として用いた場合に、より強い反応が得られました。逆方向ペアリングを用いたところ、条件反応は新規臭と同レベルまで低下し、条件付けを成功させるためには正確なタイミングが重要であることが示されました。この手法の開発により、神経科学分野の研究者が、ミツバチなどの昆虫モデル生物を用いて学習と記憶の神経基盤を探索する道が開かれました。

昆虫、特にミツバチを扱う際は危険が伴う場合があることに留意してください。これらの動物を扱う際は、必ず適切な保護具を着用してください。