Name: 昆虫に行動可塑性を調査するためのテングザルの拡張レスポンスプロトコル：基本、生物医学および農業研究への応用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 学ぶ ミツバチの行動条件づけ法。Apis melliferaを用いたPERプロトコルで、学習メカニズムと環境ストレス影響を評価する神経科学的手法を解説。

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アリゾナ州立大学;この研究は、NIH NCRR（BHSにR01 RR014166）、NIH NIDCD（R01 DC011422 BHS共同PI）、米国農務省（BHスミス共同PI JトランブルPI）からの資金によってサポートされていました。学生を訓練するためのワークショップのための資金（ 図4のデータ）は、チリの科学財団によって提供された。

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<li>Strube-Bloss, M. F., Nawrot, M. P., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mushroom+body+output+neurons+encode+odor-reward+associations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mushroom body output neurons encode odor-reward associations.</a> J Neurosci. 31, 3129-3140 (2011).</li>
<li>Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+and+non-associative+plasticity+in+kenyon+cells+of+the+honeybee+mushroom+body%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Syst+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Associative and non-associative plasticity in kenyon cells of the honeybee mushroom body.</a> Front Syst Neurosci. 2, (2008).</li>
<li>Fernandez, P. C., Locatelli, F. F., Person-Rennell, N., Deleo, G., Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+conditioning+tunes+transient+dynamics+of+early+olfactory+processing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Associative conditioning tunes transient dynamics of early olfactory processing.</a> J Neurosci. 29, 10191-10202 (2009).</li>
<li>Locatelli, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonassociative+plasticity+alters+competitive+interactions+among+mixture+components+in+early+olfactory+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nonassociative plasticity alters competitive interactions among mixture components in early olfactory processing.</a> Eur J Neurosci. 37, 63-79 (2013).</li>
<li>Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+early+olfactory+processing+by+an+octopaminergic+reinforcement+pathway+in+the+honeybee%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee.</a> Journal of Neuroscience. 23, 5370-5380 (2003).</li>
<li>Mussig, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+disruption+of+the+NMDA+receptor+subunit+NR1+in+the+honeybee+brain+selectively+impairs+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation.</a> J Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).</li>
<li>Hladun, K. R., Smith, B. H., Mustard, J. A., Morton, R. R., Trumble, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selenium+toxicity+to+honey+bee+%28Apis+mellifera+L.%29+pollinators%3A+effects+on+behaviors+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Selenium toxicity to honey bee (Apis mellifera L.) pollinators: effects on behaviors and survival.</a> PLoS One. 7, e34137(2012).</li>
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<li>Drezner-Levy, T., Shafir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+of+variable+reward+distributions+that+affect+risk+sensitivity+of+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Parameters of variable reward distributions that affect risk sensitivity of honey bees.</a> J Exp Biol. 210, 269-277 (2007).</li>
<li>Drezner-Levy, T., Smith, B. H., Shafir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+foraging+specialization+on+various+learning+tasks+in+the+honey+bee+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Ecology+%26+Sociobiology%22%5BJournal%5D)">The effect of foraging specialization on various learning tasks in the honey bee (Apis mellifera).</a> Behavioral Ecology & Sociobiology. 64, 135-148 (2009).</li>
<li>Shafir, S., Menda, G., Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caste-specific+differences+in+risk+sensitivity+in+honeybees%2C+Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Caste-specific differences in risk sensitivity in honeybees, Apis mellifera.</a> Animal Behaviour. 69, 859-868 (2005).</li>
<li>Smith, B. H., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+variability+in+the+feeding+motor+program+of+the+honey+bee%3B+the+role+of+learning+in+releasing+a+modal+action+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Ethology%22%5BJournal%5D)">An analysis of variability in the feeding motor program of the honey bee; the role of learning in releasing a modal action pattern.</a> Ethology. 82, 68-81 (1989).</li>
<li>Erber, J., Pribbenow, B., Kisch, J., Faensen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operant+conditioning+of+antennal+muscle+activity+in+the+honey+bee+%28Apis+mellifera+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology+A-Sensory+Neural+%26+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Operant conditioning of antennal muscle activity in the honey bee (Apis mellifera L).</a> Journal of Comparative Physiology A-Sensory Neural & Behavioral Physiology. 186, 557-565 (2000).</li>
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<li>Matsumoto, Y., Menzel, R., Sandoz, J. C., Giurfa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+olfactory+classical+conditioning+of+the+proboscis+extension+response+in+honey+bees%3A+a+step+toward+standardized+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Revisiting olfactory classical conditioning of the proboscis extension response in honey bees: a step toward standardized procedures.</a> J Neurosci Methods. 211, 159-167 (2012).</li>
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<li>Paranjpe, P., Rodrigues, V., VijayRaghavan, K., Ramaswami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+habituation+in+Drosophila+relies+on+rutabaga+%28adenylate+cyclase%29-dependent+plasticity+of+GABAergic+inhibitory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Gustatory habituation in Drosophila relies on rutabaga (adenylate cyclase)-dependent plasticity of GABAergic inhibitory neurons.</a> Learn Mem. 19, 627-635 (2012).</li>
<li>Vinauger, C., Lallement, H., Lazzari, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+and+memory+in+Rhodnius+prolixus%3A+habituation+and+aversive+operant+conditioning+of+the+proboscis+extension+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Learning and memory in Rhodnius prolixus: habituation and aversive operant conditioning of the proboscis extension response.</a> J Exp Biol. 216, 892-900 (2013).</li>
<li>Smith, B. H., Abramson, C. I., Tobin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+withholding+of+proboscis+extension+in+honeybees+%28Apis+mellifera%29+during+discriminative+punishment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Psychology%22%5BJournal%5D)">Conditional withholding of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera) during discriminative punishment.</a> Journal of Comparative Psychology. 105, 345-356 (1991).</li>
<li>Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+blocking+in+odorant+mixtures%3A+an+increase+but+not+a+decrease+in+intensity+of+reinforcement+produces+unblocking%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An analysis of blocking in odorant mixtures: an increase but not a decrease in intensity of reinforcement produces unblocking.</a> Behav Neurosci. 111, 57-69 (1997).</li>
<li>Gerber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honey+bees+transfer+olfactory+memories+established+during+flower+visits+to+a+proboscis+extension+paradigm+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Honey bees transfer olfactory memories established during flower visits to a proboscis extension paradigm in the laboratory.</a> Animal Behaviour. 52, 1079-1085 (1996).</li>
<li>Rueppell, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+architecture+of+sucrose+responsiveness+in+the+honeybee+%28Apis+mellifera+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetic architecture of sucrose responsiveness in the honeybee (Apis mellifera L).</a> Genetics. 172, 243-251 (2006).</li>
</ol>

著者には開示すべき利益相反はありません。

このプロトコルは、PERプロシージャを使用して空調するための2つの信頼できる方法を提示した。これらは正常に27、21を採用されているいくつかの方法のうちの2つである。私たちは、それが一貫して信頼性があるとして、さらには異なる実験者全体で、PERを使用して、すべての実験的研究のための方法2使用している。 同じ基本的な手順が異なるコンディショニング刺激と異なる行動反射の使用を含むミツバチ、との研究の多くの異なる種類に適応されています。また、脳13,14,30、および調節および行動15,16,31の分子遺伝学的拠点に28,29の学習の違いの遺伝的基礎の調査、嗅覚と記憶の生理学的相関にリンクされている。そのため100年以上前にカール·フォン·フリッシュによる最初の研究を始め、ミツバチへの嗅覚学習の生態学的関連性、高度な知識の<suのp&gt; 31、PERの結果は容易にコロニーの生存ニーズに連結することができる。最近では、それは農薬や環境有害物質17の亜致死行動効果を調査するために、農業研究に適応されています。 基本的な手順は、他の種の問題を調査するために適用することができるという点で強力​​である。二つの蛾の種、 たばこスズメガとスポドプテラ·リトラリスは 、匂いの識別および各種の嗅覚学習能力32,33の神経基盤を調査するために、PERの研究に使用されている。ミバエとPER実験はchemosensationに関与する分子シグナル伝達カスケードに多くの洞察を提供し、34の学習している。あたりは最近、ノミ（Rhodniusのprolixus）35、重要な病気のベクトルに慣れを研究するために使用されています。 一般的には、この手順は方法の変化にロバストである。 Dの使用ifferent方法は、おそらく、治療群間の同じ相対的な差を生成する。比較的簡単な手順にもかかわらず、いくつかの問題が常に臭気蔗糖の関連付けを学習するからミツバチを防ぐことができます。次のトピックでは、プロトコルとPERコンディショニング中に発生する可能性のある一般的な問題のいくつかの可能な変化があります。 コンディショニングプロトコルにおける試験の数とタイプに関する考察任意の学習プロトコルは、取得段階での試行回数にミツバチの露出が必要になります。この数は、主にタスクの難易度によって異なります。ミツバチは、単一の裁判の後、簡単なタスクを学ぶことができますが、それらは長期記憶形成を誘導するために、少なくとも3回の試験を必要としています。予想されたように、ミツバチが十分に困難な課題を学習するためにかなり多くの臨床試験が必要になります。一般的には、ミツバチがもはや大幅に改善しないそれを超える試行の最大数がありますIRパフォーマンス。この最大値は、特定のタスク、匂いの種類と濃度、およびショ糖濃度に依存する。 異なる臭気を有するトライアルつ以上のタイプを使用する場合、臭気のプレゼンテーションの単純なシーケンスを記憶する代わりに、臭気36との間の違いを学習するからハチを維持するために擬似ランダム·シーケンス内の異なる試行型を提示する。これらの擬似ランダム·シーケンスでは、臭気タイプごとに試験が同数のがなければならない。また、一臭気が先行し、同じ匂いが続くタイプ、または他の匂いのいずれかの試験の確率は、すべての臭いのために等しくなければならない。 ABBABAAB： - AとB - 2臭いについては、次のシーケンスを使用しています。 8件の試験にわたって各臭気を4回提示される。各臭気のための臨床試験の所望の数に到達するために同一の配列を連結します。 関係なく、実験的なデザインの、ままでなければならないいくつかのパラメータがあります学習を最適化するための定数。 CSと米国との間の重なりは、効果的なコンディショニングのために重要である。試行間間隔（ 図1、表1）は一定であるとムラや短すぎるか長すぎる試行間間隔が著しくコンディショニングプロトコール1の有効性に影響を与えることができるので、最適化される必要がある。 行動試験トライアルの重要性と設計上の考慮事項 CSと米国が一緒に提示されている実験の「捕捉段階」中に記録された応答は、便利です。しかし、匂いの提示条件は別の裁判のいずれかのタイプとは異なる場合があることに注意してください。補強試験中に、ショ糖、続いて臭気がハチの応答に影響を与えることができる視覚刺激（ショ糖液滴を送達するための装置の移動）に関連して提示される。そしてハチはわずか3秒を持っている（; 図1匂い刺激マイナススクロースを発表した1秒オーバーラップの4秒）の応答を示すための。実験は2匂いを区別するために学んで蜂が含まれている場合（ 例えば 、補強及び補強されていない）、別の試験に提示され強化されていない臭いが報酬提示の視覚刺激せずに発生し、ミツバチが応答する完全な4秒を持っている。したがって、2つの匂いに対する応答は、取得中に完全に比較することはできません。いずれのコンディショニングプロトコルで、取得カーブ1のみに依存しません。より良いミツバチが学んだことを確認するために、全ての刺激の試験は、同一の条件下で行われることが保証もない臭いが補強されている間の強化されていないテスト一連の試験を、ご紹介します。 実験の具体的な目的に応じて、テストはエアコン臭やエアコン外径を持つ一連の試験の単一のテストトライアルで構成することができますあるいは、または調整され、新たな臭気の組み合わせ。エアコン臭の単一のテストトライアルはミツバチが「エアコンの臭いを覚えているかどうかの単純なアッセイを提供する。ただし、最初のテストトライアルへの応答は、ミツバチのモチベーションレベルだけでなく、エアコンの臭いの彼らのリコールを反映することができる。試験一連の試験、エアコン臭気または馴化および1つ以上の新規な臭気の単一一連のテストの消光一連の試験のいずれか、また記憶を評価するために使用することができる。絶滅一連の試験は、ミツバチが「エアコンの関連付けを覚えてどのように強く評価することができます。条件反応を消すために必要な試験が、より多くのリコールも強い。空調や小説臭いのシングル一連のテストは、またエアコンの臭いの特異性ハチ &#39;記憶を評価することができます。 これは、同じ時点で対照群と処置群の両方を調整し、テストするためにも不可欠である。比較例すぐに長い期間のために開催されたハチのコンディショニング後に蜂のパフォーマンスを覆うと理由飽食にミツバチを供給することにより、ショ糖、米国への露出の問題である。例えば、長い間隔の後にパフォーマンスの低下は、メモリ崩壊が原因であるか、結果があいまいなことによる米国への未強化の曝露によって誘発される動機づけ状態および/または学習の変化である可能性があります。したがって、治療群の性能は、常に調整され、同じ時点で試験した対照群と比較して判断すべきものである。 臭気濃度およびIntegrity 匂い（CS）の濃度と完全性が損なわれることができるいくつかの方法がある。臭気配信に最も普及している問題は、使いすぎた（ 図2）からの臭気カートリッジの枯渇である。この落とし穴を回避するために、カートリッジを10〜12の使用（5ミツバチのグループを持つすべての2または3試験）を交換してください。また、使用することが重要です使用済みカートリッジは差動で枯渇する可能性があるので、テスト試験の新鮮なカートリッジを見出し、本不等匂い刺激。別の一般的な問題は、それを完全にクリーニングすることなく、複数の臭気のためにカートリッジを使用することに起因する臭気カートリッジ汚染である。汚れていたり、汚染された空気の流れも意図せずに、​​追加の嗅覚刺激を（活性炭フィルタは、バックグラウンド汚染を防ぐことができます）を導入することができます。臭気に対する生理的応答の測定と調節PER結合する場合に、特に問題となる。漏洩臭気カートリッジは匂い刺激の顕現性を低下させる試験が始まる前にミツバチが臭気にさらされているので、問題を提示する。バルブが人為的に意図された臭気にハチ」の応答を低減すること、開いたときに臭気の配信のための空気供給にルーズフィッティングはほとんど、あるいは全く臭気配達になることがあります。 ショ糖溶液と無条件刺激（報酬） Aマウントは、米国として使用ショ糖溶液の濃度、および完全性は、実験の成功に不可欠である。コンディショニングは、US 37として使用されるスクロース水溶液の量及び濃度の関数である。方法2で使用されるマイクロシリンジは、（0.2μLまで）非常に精密な米国の配信の制御を可能にし、私たちは説明した両方の方法のためにそれらを使用することをお勧めします。爪楊枝（方法1）の使用は、以下の予算を持つフィールドに大きな人のグループ、仕事の訓練中に、などの高価なシリンジを使用することができない状況のために適切である。タイミングはショ糖の蓄積（及び納入濃度）を回避するために、爪楊枝の定期交換で維持されているように、方法1を注意深く実装がある限り大丈夫です。しかし、爪楊枝を使用して正確に制御および調整研究1のために重要である量およびUSの大き送達を推定することはより困難である。に必要とされるショ糖の濃度タスクの難しさとハチの内部状態や時期に依存することが条件付け関連付けを学習する動機ミツバチを維持するのに十分な報酬を提供する。より困難なタスクがハチ &#39;成功したタスクを学習するためのより高いショ糖溶液を必要とします。実験中にミツバチの健康と報酬の認識に影響を与え、溶液の完全性を損なうであろうとしても5℃ のショ糖溶液中での金缶の蓄積、。それは、数日おきにソリューションを交換するのが最善です。 高精度、タイミング、およびCSの一貫性と米国の配達 PER手続きの適正な実施についての最も重要な問題、またはそのことについては、コンディショニング手順は、精度、タイミングとCSと米国デリバリー（ 図1）の一貫性を必要とする。手順に慣れていない研究者は頻繁に一方または両方の刺激の配送について不正確である。 ISIのそれは、CSの重複を可能にするために失敗し、米国が悪いコンディショニング性能をもたらす。 PLCは、臭気の配信開始後、ショ糖3秒を配信する実験者のための可聴信号を自動化します。調べでは、信号の後に迅速な配達のためのミツバチの近くにショ糖/水滴を保持する必要があります。これらの手順は、一貫性のあるISIを同伴するのに役立ちます。空調アリーナによってストップウォッチを配置すると、裁判の都合の良いときの配置を可能にするだけでなく、刺激の分娩前と後の両方の分野でミツバチ」時間を監視する。そうすればITI年代は比較的一貫していることができ、全体の手順は、制御されたペースで実行することができます。長すぎるITIの短すぎるのは、たとえば1分以内、または貧弱なコンディショニング性能1につながることができます。 ミツバチパフォーマンス上、季節的、環境的、文脈効果ミツバチのパフォーマンスが大幅にその周囲に影響され得る前および条件付けの間の両方。多くの場合、季節の移り変わりが付属して温度や食料の入手可能性の変動が学ぶためのミツバチのモチベーションが変更されます。花が咲いているときは、研究室で空調関連付けを学習するミツバチ意欲が38減少します。コロニーが強調されている場合には - 極端な温度、食糧不足、または疾患に関連するストレスから - ミツバチが &#39;内部の学習性能の低下が表示されます。ミツバチは、しばらくの間うまく学ぶが、そこにあまりにも病気のストレスや老化が時間とともに彼らの学習性能が低下する可能性があり、飛行の部屋に保管。条件付けの間のコンテキストはまた、ハチのパフォーマンスを低下させることができる。余分な臭い、移動、他の刺激は、実験的な刺激からミツバチをそらすことができます。この問題を回避するには、合理的に一貫性のある、単純化された視覚的なコンテキストを維持。 遺伝子型と経験は、PERのパフォーマンスに影響 &lt;Pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;ミツバチの労働者が原因タスク特化、遺伝子型、または他の環境要因20の任意のコンディショニング手順でパフォーマンスがかなり異なる場合があります。したがって、可能な限り、個体間のばらつきを低減するために、実験に使用される動物のタイプを標準化することが重要である。彼女は多くの異なったドローンと交配を意味し、オープン交尾女王率いるコロニーでは、労働者は父方の遺伝子型が異なります。遺伝的背景は、感覚応答39と学習性能29の劇的な違いにつながることができます。機器によって、単一の無人機28から精子によって受精女王率いるコロニーを使用すると、この個体間のばらつきを低減します。 上記のプロトコルは、巣の入り口からミツバチの労働者を収集するための方法を含む。しかし、これらのミツバチは、年齢や行動タスクに関して互いに異なる。彼らは（inexperien若いかもしれCED）以上（より経験豊富な）飼料収穫機。彼らは第一の配向便を作る若いミツバチかもしれません。それとも、ガード蜂かもしれません。彼らは大人（年齢のために制御するために）、および/またはそれらは（経験のために制御するために）餌始めるなどとして浮上としてばらつきを低減するために、いずれかの速乾性エナメル塗料やマーキングタグでミツバチをマーク。その後、数日後、コンディショニングのための顕著なミツバチを集める。看護行動に従事している労働者は、ハイブ内のフレームから採取することができる。彼らは餌と内側幼虫の世話をするためにひな細胞中に頭を挿入すると、看護師は、積極的に識別することができる。 PERコンディショニングのためにヴァージンクイーンやドローンを使用するワーカーミツバチに加えて、バージンミツバチ女王とドローンは、容易に性能28の学習において異なるミツバチの遺伝的系統を開発することを目的と研究のためのPER手順で調整することができる。ヴァージン女王は目の後すぐに収集する必要がありますEYは蛹化から出現し、麻酔なしで拘束ハーネスに直接入れ。コロニー内部のひなコームか​​ら収集若い、未熟ドローンは、一般的に学ぶことがモチベーションではありません。彼らはフライトを交配始めた後は、無人偵察機は、容易にPERタスク28を学ぶ。彼らは、相手の飛行から戻るように収集され、女王を飼育するために使用コロニーの小さなケージに一晩維持されるべきである。彼らにコンディショニング前日を活用しようとしないでください。彼らはハーネス一晩でよく生存しない。数時間前にエアコンの無人機は、ケージから収集され、麻酔なしで拘束ハーネスに入れることができる。 結論このPER手順は、メソッドのように、PER実験を設計するための出発点に達する。プロトコルはPERほとんどが概説された手順、実験とaccommodatの具体的な目標を実現するために何らかの方法で変更されることが必要になります電子複数の処置群。これは、実装が容易です。しかし、適切な実装を詳細かつ実践に注意を払う必要があります。一度それが異なる昆虫種にはいくつかの基礎および応用研究プログラムのための研究ツールとして追加するための強力な手続きでできるマスタリング。

多くの昆虫は、生態学的に関連した刺激について学び、彼らはその後、自分の環境で新しい予測関係に適応するために、これらの刺激に対する彼らの行動反応を変更します。いくつかの異なるメカニズムが、この行動の可塑性の根底にある（ 例えば 、非会合、連想/パブロフ、およびオペラント/ 1インストゥルメンタル）。可塑性のこれらのタイプは、刺激がや行動は、食品の発生、メイト、または危険などの重要なイベントに関連している方法が異なります。可塑性のこれらの形態を理解することは、神経系は新しい思い出2をコード化するためにどのように変化するかの基礎研究のために非常に重要である。それは重要な病気のベクター（ 例えば 、ツェツェバエや蚊）と作物生産（ミツバチ）や害虫のいずれかとして、農業的に重要であり、昆虫である昆虫の適応行動を理解するためにも重要である。 どんなアニムに行動の可塑性を研究らは、フィールド1は達成できない変数の数以上の実験制御のレベルが必要です。これは、より制御された条件下で使用することができる強固なコンディショニングプロトコールを開発する必要が、依然として自然条件下での挙動に関連する。ミツバチ（ ミツバチ ） は 、行動の可塑性3,4の制御された分析を行うためのプロトコルを開発する方法のための優れたモデルです。ミツバチでのテングザルの拡張応答（PER）は、ミツバチが糖液と触角刺激に応答してその口吻を拡張している自然な行動の反射である。ミツバチが花に蜜を見つけたときに、通常の採餌行動時には、PERが発生します。幸いなことに、ミツバチは、容易に実験室でのこの単純かつ容易に定量挙動を示すことになる。これは、制御された環境で、この生態学的に関連する挙動5に影響を与えるメカニズムを研究することを可能にする。 CA PERnはまた可塑6の根底に行動および神経機構を明らかにするように設計された異なる処理条件の下で、刺激の知覚、学習および記憶を調査するためにコンディショニングプロトコル内で使用される。 桑原7による最初の研究以来、PERコンディショナーは、広く非会合、連想とミツバチ8における行動の可塑性の根底にあるオペラントメカニズムを解明するために用いられてきた。これらのメカニズムは、自由に飛んでいるミツバチ9の研究で明らかになったものと同一である。自由に飛んでいるミツバチの研究は違って、PER調整プロトコルは、電気生理学10,11または脳の生細胞蛍光イメージング12-14と結合することができる。また、PERプロトコルはそのようなneurなどのネットワークの特定のコンポーネントの役割についての仮説をテストするための薬理学的または分子遺伝学的治療を介した神経経路の実験的操作を可能にomodulators 15,16。 PERプロトコルも、環境条件だけでなく、健康への毒素やミツバチ17の採餌効率の亜致死影響を評価するための重要な方法を提供してきました。 この手順は、並列の2つの臭気送達方法を記載する。方法1は、臭気およびショ糖の報酬を提示するための安価で技術的に簡単な方法を提供し、臭いや無条件刺激（ショ糖）配送のバージョンです。この方法は、基本的な訓練のために良好であり、自動化ができない場合。それは、教室や授業研究室にこの技術を導入するための優れた方法です。より困難なタスクと匂いの知覚、学習または記憶の結合された生理学的評価を伴う実験のためのコンディショニング中には、正確かつ精密な刺激の開始、持続送達のタイミングを調節することが非常に重要である。最も信頼性の高い刺激の配達は、臭気の配信aを自動化する手段を使用するND報酬配送の正確な方法。方法2は、自動臭気の配信と、より正確なショ糖の配信を採用しています。それは、技術的にはより洗練されたで、方法1よりも初期セットアップのためにもっと必要としますが、それを大幅に調整するために用いた刺激のタイミングと量の一貫性を高め、可能な限り使用されるべきである。

<table><tbody><tr><td>スクロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378-1KG</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;におい物質（例）&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;1-ヘキサノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471402-100ML</td><td>追加の例については</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;2-オクタノン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W280208-800G-K</td><td>におい物質の、いずれかの</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;ヘプタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51778-5ML</td><td>嗅覚に関する論文</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;ゲラニオール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>163333-25G</td><td>〜からの処理</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;ノナナール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>131210-100ML</td><td>Smith研究室</td></tr><tr><td>ヘキサン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090-1L</td><td></td></tr><tr><td>高粘度ミネラルオイル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760-1L</td><td>確認してください&amp;rsquo;無臭です。</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836-1L</td><td></td></tr><tr><td>シンチレーションバイアル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z190535-1PAK</td><td>小型のドリルビットを使用して、バイアルのキャップに小さな穴を開けます。</td></tr><tr><td>ミツバチ用ハーネス</td><td></td><td></td><td>直径0.9 cmのプラスチック製ストロー、または硬質プラスチック製あるいは金属製のチューブを用いて特製した。</td></tr><tr><td>ダクトテープ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>キムワイプス</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z188956-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>洗浄瓶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z560847-3EA</td><td>70%エタノールについて。</td></tr><tr><td>乾燥機用チューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;メソッド1のみに適用&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>20 ml使い捨てプラスチック製シリンジ</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-07945-18</td><td></td></tr><tr><td>直径15 mmのろ紙ディスク</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z274844-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>プッシュピン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>爪楊枝</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;方法2のみに適用&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Gilmont マイクロメーターシリンジ、0.2 ml</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07840-00</td><td></td></tr><tr><td>Gilmontマイクロメーターシリンジチップ</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07841-00</td><td></td></tr><tr><td>26G 3/8インチ&amp;rdquo; ルアーロック皮下注射針</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-10</td><td></td></tr><tr><td>1 cc ツベルクリン用注射器（プラスチック製/ガラス製）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z181641-1EA または Z192090-200EA</td><td>ガラス製ツベルクリン注射器も利用可能ですが、プラスチック製注射器の方がはるかに安価であり、回数限定の使用であれば十分に機能します。</td></tr><tr><td>小型ゴム/シリコン製レストリクター</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95702-02</td><td>外径4.8 mmのシリコーンチューブ、または1 ccシリンジプランジャーのゴムチップを用いて作製します。</td></tr><tr><td colspan="4">[ヘッダー]</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>75 x 100 mm ろ紙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z695106-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Direct Logic 05 プログラマブルロジックコントローラ</td><td><a href="http://www.koyoele.co.jp/english/product/plc/index.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> 光洋電子工業株式会社</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mm, 4 mm, &amp;amp; 内径6 mmのPVCまたはシリコンチューブ</td><td>Cole-Parmer</td><td>各種</td><td>Cole-Parmer社は、適切なチューブを幅広く取り揃えています。</td></tr><tr><td>ポリプロピレンコネクター &amp;amp; ルーアフィッティング</td><td>Cole-Parmer</td><td>各種</td><td>Cole-Parmer社は、多くのチューブサイズに対応したコネクターおよびフィッティングを幅広く取り揃えています。</td></tr><tr><td>65 mm 相関流量計</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-03216-08</td><td>ガラスフロート付きアルミニウム製；液体およびガス用、バルブ付き。</td></tr><tr><td colspan="4">または</td></tr><tr><td>Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2) アクアリウム用エアポンプ</td><td><a href="http://www.aquacave.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> アクアケイブ</a></td><td>AE-TETRA-300</td><td></td></tr><tr><td>内径0.042インチチューブ用LIFシリーズ電磁弁、構成「E」</td><td><a href="http://www.theleeco.com/LEEWEB2.NSF" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> The Lee Company</a></td><td>LFAA1200118H</td><td>ネオプレン、430ステンレス鋼、302ステンレス鋼、280 mW</td></tr><tr><td>PCボード用 12VDC 70dB ピエゾブザー</td><td><a href="http://www.radioshack.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> RadioShack</a></td><td>273-074</td><td></td></tr></tbody></table>

昆虫に行動可塑性を調査するためのテングザルの拡張レスポンスプロトコル：基本、生物医学および農業研究への応用

A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

昆虫は生存のための重要なイベント（ 例えば 、食品、仲間、脅威）と、それらの刺激を関連付ける経験を通して刺激に対するそれらの応答を変更します。昆虫が顕著な関連付けを学習し、これらのイベントにそれらを関係を通して、いくつかの行動のメカニズムがあります。これは、農業のために有益である昆虫を支援することを目的に向けてのプログラムでこの行動の可塑性を理解することが重要です。この理解はまた、疾患ベクターおよび害虫として作用する昆虫によって作成された生物医学的及び農業の問題に対する解決策を発見するために使用することができる。テングザルの拡張レスポンス（PER）コンディショニングプロトコルは、彼らがどのように認識しているか研究し、蜜や花粉資源の生存のためのコロニーのニーズを知らせる花の臭い、について学ぶために50年以上前にミツバチ（ ミツバチ ）のために開発された。 PER手順はいくつかの異なる生態学的に関連するメカを研究するための堅牢かつ簡単に採用フレームワークを提供行動可塑性のニズム。これは、いくつかの他の昆虫種および他の行動反射神経との使用に容易に適合可能である。これらのプロトコルは、容易に電気またはバイオイメージングを介してCNSに神経活動を監視するため、または標的神経調節経路を操作するためのさまざまな手段と組み合わせて使用​​することができる。これは、急速に環境ストレス、毒素または殺虫剤によって引き起こされる行動に対する亜致死効果を検出するための堅牢なアッセイである。 私たちは、PERプロトコルは2つの手順を使用して実装するのは簡単であるかを示す。一つは、学生のための、または実験的治療の効果の迅速なアッセイのための実験室での運動などに適しています。もう一つは、行動のコンディショニングに関する研究のために重要である変数のより完全なコントロールを提供します。私たちは、バイナリはい/いいえから吻拡張の待ち時間と期間のような、より連続的な変数の範囲で行動反応にはいくつかの対策がhypotheseテストするために使用する方法を示して秒。そして、私たちは、彼らが最初に手順を使用する場合、研究者は、一般的に遭遇するいくつかの落とし穴を説明します。

私たちは、上記のPERプロトコルの使用の2つの例を提示する。最初の例では、ミツバチがCS 5,24,25として使用臭気分子類似性の関数として異なる匂いを知覚する方法勉強する方法2を利用した。第二には、方法1と研究室に空調実験ごとに使用し始めたときに注意しなければならない注意事項のいくつかの使用例である。 あるよう、本研究は、13または電気生理学的には26を解析し、生体イメージングと一緒にミツバチと蛾の嗅覚「知覚空間」を記述するために使用されてきた。ミツバチは、（N = 20）12フォワードペアリングコンディショナートライアル（ 図3A）を介して、ショ糖の補強と、付臭剤デカナールを関連付けるために調整した。ミツバチの約10％が正常である最初の試験、に「自然に」答えた。 responde割合その後ミツバチの100％が五裁判と後続のすべての裁判に応答するまで、次のいくつかの臨床試験の経過とともに増加dは。いくつかの研究は、応答におけるこの増加は、いくつかの重要な制御手順3に転送するペアリング状態（ 図1）相対的に特異的であることを示している。アクイジション·フェーズの後、各ミツバチは匂いCSにし、体系的に分子構造中のCSは異なっいくつかの他の匂い物質への暴露を関与補強されていないテスト一連の試験（ 図3B）、を行った。ミツバチは、CSに最も強く反応した。他の匂い物質に対する応答は、少なくともCSのような匂い物質に対する最低の応答と、構造の体系的な変化の関数として減少した。 図4では、方法1を使用して、ミツバチを調節する方法を学生が最初に、学習したもので、最近のワークショップの結果は、例示されている。学生モミ<html> tはショ糖の補強（ 図4A）との上位ペアリングmethycyclohexanone（MCH）またはオクタノール（OCT）によるミツバチを条件付け。パーセント応答は最初の裁判に低かったとミツバチが臭気蔗糖関連を学んだことを示して、その後の試験に増加した。ミツバチは、学生のさまざまなグループ間の馴化関連を学んだ程度の差があった。われわれの経験では、違いがこれらの種類は、メソッド（方法1）での不正確な要素に、あるいは実験者のトレーニングレベルに、CSとした臭いが原因である可能性があります。第3のケースでは、パフォーマンスはすぐに実験者」の増加の経験を持つ、より一貫性になる。コンディショニング後、各ミツバチは、各臭気で二回試験した。予想通りに10月またはMCHのフォワードペアリングで調整していたミツバチの群では、応答は、エアコン臭（ 図4B）に最も強かった。 <html> ENT &quot;&gt; 10月にペアリングを前方に経験したミツバチの第2のグループは、臭気10月後方ショ糖とペアにされた別のグループと並行して調整した。後方ペアリングが実証する制御手順のいくつかの種類の一つである反応の増加そのような感作からの非特異的な覚醒として、別のプロセスに起因するペアリングを転送しないように固有のものです。後方のペアリングのために、ショ糖、米国および臭気CSが図1に示したものと逆の順序で提示されている。後方ペアリングからの取得データであるCRは、ショ糖のプレゼンテーション後の臭気、CSのプレゼンテーションを与え採点することができないため、図示していない。連想コンディショニングのために予測されるように、10月に応答レベルは、下位グループ（ 図4C）に転送ペア、グループの相対で高かった。 7fig1highres.jpg &quot;幅=&quot; 500 &quot;/&gt; 図フォワードペアリングを使用して調整するための実験計画の1ダイアグラム。この図で使用される用語の定義については、表1を参照してください。（A）CS（臭い）が先行し、米国（ショ糖/水溶液）と重なっている。示さCSと米国との関係は、コンディショニングミツバチと蛾に最適です。しかし、最適なISIは、コンディショニングプロトコルおよび動物種1に依存することができる。（B）の内訳とCS、CR、米国、およびURの相対的なタイミング。米国の発表の前または補強されていない「試験」試験中にいずれかが発生しCRが実験プロトコルの従属尺度である。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig2highres.jpg" width="500" /> 図2のカートリッジの再利用による臭気枯渇。これらのデータについては、臭気のカートリッジであったセットアップヘキサノールを使用してテキストを参照してください。ヘキサノールは、一般PER研究におけるCSとして使用される。しかし、枯渇の実際のレートは、臭気や溶剤に依存することになる。カートリッジは、4秒（40の用途に等しくなる標準実験で5ミツバチ/トライアルと仮定して）8回の試行毎分に一度使用された。 PER実験の比較的標準的であった、示された溶媒中の希釈液を、2.0Mの（A）と0.2 M（B）であった。（A、B）は臭いは、第1および固相への吸着による第八裁判後にサンプリングしたその後ガスクロマトグラフ上に脱着しマイクロ抽出（SPME）ファイバー。ピーク下相対面積は両溶媒のための第1〜第8トライアル相対した後、両方の濃度について高かった（ウィルコクソンのマッチドペア符号付き順位検定p &lt;0.05 [*]以上）、あまり臭いがカートリッジから配信されたことを示しているカートリッジは、多数回使用された後（C、D）は 、同じデータがちょうど第八のtrを示す<html>拡張され、y軸にIAL。これは、枯渇が鉱油ヘキサンに対しては少し大きいだけ低い濃度であったことを示している。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig3highres.jpg" width="500" /> CSとコンディショニングの方法2として、デカナール使用して図3の取得およびテスト。 （A）トライアル·バイ·トライアル12フォワードペアリング試験（ 図1）上の寛解（CR）。データは5ミツバチずつの4グループにエアコンはn = 20、ミツバチからのものである。 ISIは3秒であり、ITIは6分であった。（B）炭素鎖の長さ及び/又はカルボニル炭素の位置によってデカナール異なる臭気を用いた非強化の試験。匂いは、4つのグループ間でランダム化された直列に発表されたとCRの絶滅を避けるために、デカナール（各二から三の試行）で強化された臨床試験が点在した。 常に &quot;&gt;：&quot; =キープtogether.withinページのFO」e_content <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig4highres.jpg" width="500" /> ワークショップからの図4のデータは、その間の学生は （それぞれN = 23、15 Gpsの1及び2）、オクタノールに条件付けミツバチの三つのグループから、メソッドごと1（A）取得データを用いたミツバチを調整するように訓練された卒業生およびメチル（n = 10）に（B）の両方の匂いと補強されていない試験中のCR。 4グループ間でランダム系列で提示トライアル。ミツバチの二つのグループ内の両方の匂いと、（C）非強化のテスト、1フォワードがペア（GP 1、N = 23）と一つは、下位ペアた（n = 25）。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> ターム（略称） </td><td> 定義 </td><td> 関連する例 </td></tr><tr><td>条件刺激（CS） </td><td> A最初はほとんど、あるいはまったく反応を誘発すると米国信号刺激</td><td>臭気</td></tr><tr><td>条件反応（CR）A </td><td>米国との関連の後にCSへの応答</td><td>テングザルEXTENSION </td></tr><tr><td>無条件刺激（US） </td><td>応答を誘発する生物学的に有意な刺激</td><td>ショ糖/水溶液</td></tr><tr><td>無条件反応（UR）A </td><td>米国への応答</td><td>テングザルEXTENSION </td></tr><tr><td>刺激間間隔（ISI） </td><td> CSの発症と米国の発症までの時間</td><td>ショ糖間隔に臭気</td></tr><tr><td>試行間間隔（ITI） </td><td>単一の動物のための連続した​​CS-USのペア間の時間</td><td>臭気の臭気（トライアルn）は（トライアルのn + 1）間隔</td></tr></tbody></table> 表1イムportant用語。団体、他のタイプのためにも、CRとURが同じである空調PERについては、これらの用語については、図1を参照し、CRとURが異なる場合が反射神経。 <a href="/files/ftp_upload/51057/BEE_4.avi" target="_blank">ムービー1。</a>それは臭いに反応するように調整された後のPERを実行ミツバチの映像。臭気発症後蜂約1.5秒のPER応答に注意してください。追跡ソフトウェアは、臭気の提示に応じて、触角の動きをマップしました。ビデオの右上隅にプロットされたラインは、実際の触角の動きを示している。二つのXの画面を示して触角の動きの下部にあるグラフ（左）とY（右）座標。ビデオに示すグラフの縦の線は、右、ライトON、PERに委ね、示して消灯し、後退を長い鼻。

ミツバチ(Apis mellifera)のために開発されたテング拡張応答(PER)条件付けプロトコルは、多くの昆虫種における学習のいくつかの異なるメカニズムを研究するための生態学的に関連性があり、容易に定量化可能な手段を提供します。

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). ...

本手順の全体的な目的は、ミツバチにおける食物に対する単純な反射反応の行動条件付けの実装方法を示すことです。まず、ミツバチを捕獲してハーネスで固定し、少量の糖液を給餌し、拘束状態に慣れさせます。次に、ショ糖で触角を刺激した際に十分な動機付けを示す個体を選択し、条件付けを行います。条件付けの間、条件反応を誘発するために、臭いの提示とショ糖による報酬を対提示させます。次に、非強化試行を行い、反応の有無、反応潜時、および反応時間を測定します。最終ステップは、条件付けおよびテスト試行のデータ解析とグラフによる提示です。この手法は、ミツバチの生物学および健康に関する研究にうまく適用されてきました。学習行動は、殺虫剤などの妨害処理に対して特に敏感であるため、亜致死量レベルでのこれらの処理がミツバチの行動に与える影響を評価することが可能です。この方法を視覚的に実演することで、効果的な条件付けに必要な刺激のタイミングや、有効性を低下させる一般的な誤りを理解するのに役立ちます。この手法に不慣れな個人は、プロトコルと周囲の条件の両方で求められる細部への注意に苦労するでしょう。まず、巣門で待機しているか、または採餌から戻ってきた働き蜂を採取します。1本のバイアルにつき1匹の蜂のみを捕獲してください。蜂が逃げ出さないよう、バイアルの開口部を水平または下向きに保持しながら蓋を締めてください。ミツバチを回収した後、ラボに戻り、一度に数本のバイアルを氷水のスラリーに入れます。ミツバチが不動になったら、過剰な露出を避けるために直ちにバイアルを氷から取り出し、拘束用ハーネスに固定します。ミツバチの背面の胸部がホルダーの切り欠き部分に向くようにし、頭部が上端のすぐ上にくるようにして固定してください。ミツバチを軽く押し、口器がホルダーの端から外に出るようにします。ダクトテープの断片を頭部と胸部の間の背面に差し込み、自由端をホルダーの側面にしっかりと固定します。ハーネスのテープにシワがなく、ピンと張っていることを確認してください。ビーホルダーの前部とテープの間に目立つ隙間がないようにしてください。隙間があると、蜂が足を適切に伸ばせなかったり、逃げ出したりする可能性があります。ハーネスを装着した後、給餌する前に約30分間、蜂を回復させてください。その後、訓練エリアから十分に離れた場所で、給餌から条件付けまでの間隔に、各ミツバチに0.5 molarのスクロースを約3～4 µL投与します。ミツバチを研究室の静かな場所に置き、濡れたペーパータオルを入れたプラスチック容器に入れておきます。この間、条件付けを開始する数分前に、0.5 molarのスクロース溶液の小さな液滴で触角に触れさせ、ミツバチの摂食意欲を促します。この試験の間、餌を与えないでください。もし蜂がpsisisを伸ばして反応した場合、学習への動機付けが十分になされていると考えられ、プロトコールに使用できます。準備が整ったら、ガラス製臭気シリンジを粘土製のホルダーに固定し、幅の広い方の開口部が蜂に直接向くように調整します。シリンジの先端を蜂から1〜2 cmの位置に配置し、カートリッジとエアストリーム配管およびバルブシステムを接続するフィッティングを、シリンジの細い方の端にしっかりと固定してください。各試行の開始時に、ハーネスを装着したミツバチを条件付けアリーナのペグ上に配置し、触角が臭気カートリッジの方向を正対するようにします。ミツバチが新しい環境に慣れるため、臭気刺激を開始する前にアリーナ内で15〜25秒間静止させます。スタートボタンを押し、臭気提示のためのタイミングメカニズムを作動させます。刺激の開始後、無条件刺激を提示するまで、 odor（臭気）に対するハチの反応をモニターします。各試行の後、初期記憶の形成を促すため、ハチを条件付けエリア内でさらに15〜25秒間休ませてください。試行後すぐにハチを移動させると、各条件付け試行の有効性が著しく低下します。スクロースを投与するには、臭気を提示している間、針先をミツバチから2〜3cm離して保持します。シリンジを振るとミツバチの注意が逸れる可能性があるため、トレーニングアリーナの端を利用して固定してください。臭気刺激の提示中に、給餌信号音が鳴ります。給餌の合図が聞こえたら、ミツバチが口吻を伸ばすまで触角を軽く刺激し、その後、ミツバチに給餌します。臭気の提示とショ糖の提示のタイミングが極めて重要です。理想的には、これら2つの刺激が短時間重なるようにしてください。臭気の提示からスクロースの提示までに数秒以上の間隔が空くと、条件付けの成績が低下します。条件付けの後、非強化テスト試行を行い、ミツバチが条件付けされた連合をどの程度記憶しているかを確認します。まず、トレーニングエリアの上に三脚でビデオカメラを設置し、触角と口吻が鮮明に写るように、ミツバチの頭部の正面にピントを合わせます。臭気刺激の提示を示す小型LEDライトを、ビデオで確認でき、かつハチからは見えないハチの背後のエリアに配置してください。これにより、解析時に臭気提示の開始時間と終了時間を特定することが可能になります。最も一貫した結果を得るためには、すべてのセットアップが完了した後、テストに新鮮に調製した臭気カートリッジを使用してください。前述の方法で臭気を提示し、テストを開始します。臭気を提示する20秒前から録画を開始し、提示後少なくとも20秒間は録画を継続してください。テスト後、ビデオ編集ソフトウェアを使用して、刺激に対する各ミツバチの反応をスコア付けします。psis伸展反応を、陽性または陰性のいずれかで判定する二値スコアリングシステムを用います。Bの反応を陽性と判定します。開いた大顎の先端を結ぶ線を超えてBがpsisを伸展させた場合、臭気提示後かつ臭気消失前にprob boisを伸展させたときのみ陽性反応としてスコア付けします。試験中にprob boisの伸展が見られない場合、または臭気物質の消失後にprob boisが伸展した場合は、Bの反応を陰性とスコア付けします。伸展までの潜時や、条件に対する伸展反応の回数および総持続時間などの他のパラメータを収集することも可能です。その後の条件付け試行を通じて、刺激を増強させた。刺激と炭素鎖の長さまたは炭素-炭素結合の位置が異なる新規テスト臭への反応は、条件刺激と新規テスト臭の差異の程度に比例して減少した。これらのデータは、新規研究者間における変動性と条件付けの成功を示している。octalに対する反応は、テストを行った群によって異なりました。テスト試行において、条件刺激として用いた臭気で最も強い反応が引き出されました。octalを条件刺激として用いた場合、新規の臭気であるmethyl cycloneを用いた場合と比較して、テスト時の反応がより強くなりました。同様に、メチルシクロプロパンを条件刺激として用いた場合に、より強い反応が得られました。逆方向ペアリングを用いたところ、条件反応は新規臭と同レベルまで低下し、条件付けを成功させるためには正確なタイミングが重要であることが示されました。この手法の開発により、神経科学分野の研究者が、ミツバチなどの昆虫モデル生物を用いて学習と記憶の神経基盤を探索する道が開かれました。昆虫、特にミツバチを扱う際は危険が伴う場合があることに留意してください。これらの動物を扱う際は、必ず適切な保護具を着用してください。

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