精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備

本手順の全体的な目的は、顕微鏡観察のためにショウジョウバエの精巣を解剖し、作製することです。まず、雄のハエの腹部から精巣対を解剖して取り出します。次に、適切な発達段階で精巣を裂き、精巣を押し潰して内部の細胞を放出させます。

次に、圧砕した精巣を固定し、一次抗体および二次抗体でインキュベートします。最終ステップとして、組織をスライドガラスに封入し、イメージングを行います。最終的に、位相差顕微鏡または免疫蛍光顕微鏡を用いて、精子形成のさまざまな段階にある細胞の欠損や形態を観察し、さらにさまざまなタンパク質の細胞内局在を観察します。

この手法は、精子形成の進行過程におけるタンパク質の重要な役割の特定など、発生生物学分野における主要な疑問への回答に役立ちます。ショウジョウバエの精巣の解剖を視覚的に提示することは極めて重要です。なぜなら、この操作に不慣れな人は、最初はハエの腹部内で精巣の位置を特定することに苦労する場合があるためです。さらに、組織の押し潰し（スクワッシング）を最も効率的に行う方法は、言葉で説明するよりも実演して示す方が容易です。

解剖を開始するために、二酸化炭素気流を用いてボトルまたはバイアル内でハエを麻酔します。次に、麻酔したハエをフライパッドに移します。解剖顕微鏡下で小さな絵筆を用いてハエを仕分けし、目的の遺伝子型のophオスを約6〜8匹回収します。

次に、ピンセットを使用して各ショウジョウバエの翅を取り除きます。これにより、ハエが液体中で浮き上がるのを防ぎます。解剖の際、黒色の背景を持つシリコンコーティング済みの解剖皿に、500 µLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を1滴加えます。

次に、除翼したハエの1匹の前端にピンセットを向けます。胸部をつまんで保持し、PBSの液滴に浸します。腹部腹端の後方に位置する暗褐色の構造を確認し、もう1本のピンセットを使用して、外部生殖器が腹部から脱落するまで後方に引っ張って摘出します。

ほとんどの場合、精巣、精嚢、および副生殖腺は外生殖器と共に腹部から除去されます。しかし、除去されていない場合は、ピンセットを腹部に挿入して精巣を慎重に掻き出してください。2組のピンセットを用いて、精巣を副生殖腺および外生殖器から分離します。

野生型の精巣は、周囲の白い組織とは異なる黄色い色で判別します。ライブイメージング用の試料を準備するため、ピンセットを用いて2～3対の精巣を、正方形のガラスカバースリップ上の4～5 µLのPBS液滴の中にそっと配置します。次に、引き裂きます。

各精巣をピンセットで、作製物中に目的の生殖細胞系細胞タイプを最大限に含めることができる適切な高さの位置で開きます。精巣の内容物は、裂開した部位からスライド上に流出します。精原細胞および精母細胞を濃縮させるための圧砕ステップでは、濃縮効率を高めるために精巣の先端付近を裂開してください。

精母細胞および精細胞を回収する場合は、より成熟した生殖細胞を濃縮するため、レベル1よりもわずかに基側に位置する部分で精巣を切り開きます。精巣の湾曲が始まる位置に近い部分で切り開いてください。次のステップとして、カバーガラスの上に精巣を置き、その上から顕微鏡スライドガラスで緩やかに押し潰します。

手動で圧力をかけず、気泡が入らないように注意してください。生細胞を観察するため、調製後15分以内にサンプルを使用してください。位相差顕微鏡を用いて、クリーニングワイプでカバーガラスの下の余分な液体をゆっくりと吸い取り、生殖細胞がはっきりと焦点に合うまで標本を平坦にしてください。

作製した精巣圧砕標本のスライドを、金属製ピンセットを用いて液体窒素に浸し、気泡が出なくなるまで急速凍結させます。直ちにカバースリップをカミソリで取り除きます。その後、金属製ピンセットでスライドを、氷冷した95%エタノールを満たしたあらかじめ冷却したガラス製スライドラックに移し、サンプルを-20°Cで10分間保存します。

平衡化したスライドを、PBSに4%ホルムアルデヒドと0.1%Triton X 100を加えた溶液またはPBSTを満たしたガラススライドラックに移し、室温で7分間静置します。その後、スライドをPBSを満たしたラックに移します。ラック内の溶液を捨てて新しいPBS溶液に交換することで、室温で5分間、PBSによるスライドの洗浄を行います。

洗浄をもう一度繰り返します。PBSを捨て、スライドを室温のPBSTに30分間浸し、細胞膜を透過させます。その後、室温のPBSで5分間の洗浄を3回行います。免疫染色の操作中に抗体溶液を限定させ、組織を常に湿った状態に保つため、疎水性バリアペンを用いてスライド上の圧砕組織の周囲に円を描きます。

次に、PBSTで希釈した一次抗体を30〜40 µL、円内の組織に加えます。一次抗体による反応後、スライドを湿った暗室に入れ、室温で2時間、または4 °Cで一晩インキュベートします。その後、室温のPBSで5分間、3回スライドを洗浄します。

次に、PBSで希釈した蛍光標識二次抗体を30～40 µL組織に添加し、室温で1～2時間遮光下でインキュベートします。続いて、スライドをPBSで室温にて5分間、3回洗浄します。その後、円内にある組織にDAPI溶液を30～40 µL添加します。

組織の上にガラスカバーのスリップをそっと被せ、気泡が混入しないよう細心の注意を払います。気泡が生じた場合は、サンプルを壊さないように注意しながらカバーのスリップを慎重に動かし、気泡が端から抜けるまで調整します。クリーニングワイプを用いて、スライドの端から余分な液体を吸い取ります。

次に、マニキュアを使用してカバーガラスを封印し、3〜4時間以内に蛍光顕微鏡で免疫染色した細胞を観察します。この図は、ショウジョウバエの精巣内におけるさまざまな細胞成熟段階の位置を示しています。レベル1には精子形成の初期段階にある若い細胞が含まれ、レベル3にはより成熟した精子細胞が含まれています。

レベル2には、有糸分裂期および有糸分裂後の生殖細胞の混合集団が含まれています。対応する位相差顕微鏡像では、精巣をレベル1で破裂させた際に放出される精原細胞ならびに初期および後期の一次精母細胞が示されています。また、黄色い矢印は、不完全な細胞質分裂によって2つ以上の細胞が相互に連結し、融合している箇所を指しています。

ここで示した押し潰し法のアーティファクトとして、精巣をレベル2で破裂させた際に、後期一次精母細胞および、円形精細胞、伸長精細胞、成熟精子を含む減数分裂後の細胞が放出した様子を示す対応する位相差顕微鏡画像があります。押し潰した精巣の位相差イメージングは、数多く存在する円形精細胞の欠陥を容易に特定するためにも利用できます。ここでは、位相明らかな核を1つ持つ野生型精細胞が、ほぼ同等の大きさの位相暗い単一のミトコンドリア凝集塊に付着している様子が示されています。

対照的に、Aun精巣の精細胞は、細胞質分裂の不全および染色体分離の誤りに起因して、複数の小さな核と1つの大きなミトコンドリア凝集体を含んでいます。ここに示すグレースケール画像は、微小管、DNA、中心体をそれぞれ色別で識別する試薬で染色した精巣圧砕標本からのものです。これらの画像を合わせると、分裂中の精母細胞、円形精細胞の広範な視野、および成熟精子の束が示されています。サンプルの調製に習熟すれば、位相差顕微鏡観察は20分から30分で完了します。

適切に行えば、免疫蛍光顕微鏡観察用のサンプル調製は6時間で完了します。また、顕微鏡観察のためのoph精巣の処理に加えて、摘出した精巣をタンパク質の生化学的分析に利用することも可能です。