キイロショウジョウバエ幼虫を用いた免疫組織化学的検討

<em>Drosophila</em> Larval IHC
JoVE Science Education
Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans
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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans
Drosophila Larval IHC

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08:29 min
April 30, 2023

Overview

免疫組織化学的検討(IHC)は、組織内のタンパクの存在、場所の同定に用いる実験方法です。ショウジョウバエ幼虫は染色しやすく、特にIHCに適しています。さらに、ショウジョウバエ幼虫は透明であるため、解剖せずに観察できる組織もあります。

IHCでは、タンパク質を抗体で検出することができます。抗体は、ターゲットとなるタンパク内の「エピトープ」に特異的に結合します。このエピトープを保護するために、染色前には組織の固定が必須となります。さらに、抗体が膜を通過できるように、界面活性剤を用いて細胞の透過性を上げる必要があります。このビデオでは、解剖した幼虫組織の染色に必要な試薬や道具、そして固定、ブロッキング、染色などの工程を説明しています。また、蛍光顕微鏡検査法に必須の封入のテクニックもご覧いただけます。最後に様々な分野におけるこれら技術の応用例を紹介しています。

Procedure

キイロショウジョウバエは、多用途で扱いやすいため広く研究に用いられるモデル生物です。 ショウジョウバエの幼虫を用いた免疫組織化学的検討、IHC により、タンパク質の存在、位置、共局在を調べることができます。 このビデオでは、ショウジョウバエの幼虫組織の解剖、固定、ブロッキング、封入方法とその応用例を見ていきます。

免疫組織化学は、ターゲットに対して特異的に結合する抗体を使って、組織のタンパク質を検出する手法です。

ショウジョウバエ幼虫の免疫組織化学は、適切な解剖が鍵となり、幼虫組織がもろいため、正確さと適時性が求められます。 解剖は通常リン酸緩衝食塩水、PBS中で行います。 摘出器官は、一時的に幼虫内部と同じPHのPBS中に保存します。 解剖の次は固定作業です。

固定とは、組織を保護するために希釈したホルムアルデヒド液に浸す過程のことです。 この固定液により、組織内の酵素によるタンパク質の分解を防ぐことができます。 固定に続いて、数回洗浄します。免疫染色では、トライトンX含有PBS溶液である、PBSTを用います。 界面活性剤であるトライトンX100は、細胞の透過性を上げるので、抗体や試薬が反応しやすくなります。 固定、洗浄に続いては、組織のブロッキング工程です。

ブロッキングとは、抗体が非特異的に組織に結合するのを防ぐためにあらかじめタンパク質を含んだ溶液で、組織を覆う作業のことです。 ブロッキングの次は、組織染色工程です。

染色により、標的タンパク質、つまり抗原に特異的な一次抗体を結合させます。 レポーター分子が結合した二次抗体を一次抗体に結合させます。 レポーター分子は、通常蛍光として観察できます。 各抗体のインキュベーション後、非特異的な結合を防ぐため抗体を十分に洗い落します。 染色工程の次は、サンプルの封入です。

染色結果を見るため、組織を丁寧にスライドに乗せます。 粘度のある試薬や封入剤で組織を包み込みます。 これで、サンプルを顕微鏡で観察することができます。 ここまで、ショウジョウバエの免疫組織化学の原理、工程について見てきました。

ここからは、免疫組織化学で使用する試薬、道具、またその過程について紹介します。 ショウジョウバエ幼虫の脳を固定するところからです。 ここでは、全脳を染色するホールマウント免疫染色を行っています。 解剖手順は、組織の種類で変わってきますが、免疫染色の主要工程は同じなので、次は固定作業にいきます。

脳の解剖が完了したら、ピペットでPBSを取り除きます。 固定剤を加え、プロトコールに従って、ここでは23分インキュベートします。 固定後は、サンプルをPBSTで4回洗浄します。 サンプルをブロッキング溶液中で少なくとも30分、室温でインキュベートします。

適切に希釈した一次抗体中で、4℃で一晩インキュベートします。 インキュベーション後、ピペットを使って PBSTで 脳を4回洗浄します。 二次抗体を4℃で一晩インキュベートします。蛍光退色を防ぐため暗所で行います。 その後再び、脳を4回、TBSTで洗浄します。

脳をマウント溶液中で、一時間、平衡化します。 その後、チップをカットしp200ピペットを用いて脳をスライドに移動させます。 サンプル周辺にスぺーサーを置き、壊れるのを防ぎます。 サンプルにカバーガラスをかけます。 マニキュア液で端を封入します。 これで、幼虫の脳は観察できる状態です。

ショウジョウバエの脳の免疫組織化学について学んできました。 ここからはIHCの応用について見ていきましょう。

ショウジョウバエの幼虫のイメージングには、別の解剖と固定方法を使います。 この実験では、細胞がどうやって特異的な形を作っていくのかを研究しています。 幼虫の気管の末端細胞の形態をトレーシングします。 研究者は、GFP発現するハエのラインを利用できます。 GFP発現は、水浴で熱を加えることで誘発されます。

解剖顕微鏡で蛍光発光している幼虫を選別します。 ハエが蛍光を発したら、GFP活性化の成功です。 これらのハエは熱により固定します。 解剖の必要はありません。 トレーシングするためのソフトウェアを使って、気管支と気管腔の細胞形態が確認できます。

ショウジョウバエの卵巣は、幹細胞とまわりの環境との相互作用を調べるのに最適なモデルです。

ショウジョウバエの卵巣のIHCは、卵巣と精巣を確認し、メスのショウジョウバエを識別することから始まります。 収集したメスの幼虫を各ウェルに移動させます。 そこで丁寧に解剖し卵巣を含む脂肪体と呼ばれる組織を獲得します。 脂肪体を固定、染色し、スライドに組織を置いたら、脂肪体から卵巣を離します。 スライドを封入し、観察の準備ができたら、蛍光染色により、幼虫卵巣内の体細胞と原始生殖細胞を確認します。

ショウジョウバエの幼虫の免疫組織化学の方法は、蛹と成虫とでほとんど変わりません。 様々な発生段階、 例えば、幼虫、蛹、成虫期のショウジョウバエの網膜を研究するためにも同じ手順でIHCが利用されます。 その結果、ショウジョウバエの網膜の様々な発生段階を知ることができます。

ショウジョウバエの幼虫の免疫組織化学には、たくさんの応用法があります。 このビデオでは、解剖、固定、染色、封入を含む幼虫の免疫染色方法について学びました。 ご覧いただきありがとうございました。

Transcript

Drosophila melanogaster is a widely studied model organism due to its versatility and facility of use.

Immunohistochemistry performed on Drosophila larval preparations is an invaluable method that can provide information on the presence, location, and the co-localization of proteins.

This video will cover the essential methods for the dissection, fixation, blocking, and mounting of Drosophila larval tissue and examples of their applications.

Immunohistochemistry is a process that uses modified antibodies to target, bind, and ultimately visualize specific proteins in tissue.

Immunohistochemistry of Drosophila larva hinges on proper dissection, which demands accuracy and timeliness due to the sensitivity of larval tissue.

Dissection is typically done in phosphate buffered saline, or “PBS” for short.

Upon extraction organs are temporarily placed in PBS – a saline solution with the same pH as the internal pH of the larva.

After dissection the next step in Drosophila larva IHC is fixation.

Fixation is a process where tissue is placed in a diluted formaldehyde-based solution, which preserves tissue.

This fixing solution prevents the enzymatic breakdown of proteins in tissue.

Following fixation, several washing steps occur throughout the immunostaining process using PBS containing Triton-X, called PBST.

Triton-X100 provides a small amount of detergent that serves as a surface tension breaker and permeabilizes the cell, allowing antibodies and other reagents to enter.

After fixation and washing, the tissue is ready for blocking.

Blocking solution contains proteins that bind to tissue and occupy non-specific binding sites to which the target-specific antibodies would otherwise adhere. Blocking helps to prevent a false positive protein signal.

After blocking the tissue is prepared for staining.

Staining incorporates highly-specific “primary” antibody that binds to a target protein called an antigen.

A “secondary” antibody conjugated to a reporter molecule binds the primary antibody.

The reporter molecule emits a localized signal that can be visualized, which is often fluorescent in nature.

Following each antibody incubation step, excess antibody is washed off to remove any antibodies that have bound nonspecifically.

After the staining process, the sample must be mounted.

In order to see the results of staining, the tissue must be carefully mounted onto slides.

A thick reagent or mounting medium is used to encase the tissue.

The sample is then ready to be viewed under the microscope.

Now that we’ve gone through the principles of Drosophila immunohistochemistry, we’re ready to see how it’s done.

In this video we’ll focus on the reagents, tools, and processes used in the immunohistochemistry of the Drosophila larval brain beginning with fixation.

The process we are following uses the entire brain and is known as whole mount staining.

While the dissection procedure differs depending on the tissue type used for the experiment, the major steps of IHC remain the same so we’ll skip to the fixation step.

Once dissection of larval brains is complete, remove PBS with a pipette.

Add fixative and incubate for according to your specific protocol, for brains use 23 min.

Following fixation, wash samples four times in PBST.

Incubate samples in blocking solution for at least 30 min room temperature.

Using the appropriate dilutions, incubate in primary antibody solution overnight at 4 °C.

After the incubation period wash brains four times in PBST with a pipette tip at room temperature.

Incubate the samples in secondary antibody overnight at 4 °C in the dark to prevent the fluorophores from bleaching.

Again, wash brains four times in PBST.

Equilibrate the brains in mounting medium for one hour.

After equilibration transfer the brains to a slide using a p200 pipette with the tip cut off.

Place spacers around the sample to prevent it from being crushed.

Place a coverslip over the samples.

Seal the slip edges with nail polish. Larval brains are now ready to be visualized with immunohistochemistry

Now that we’ve covered the immunohistochemistry of Drosophila brains, let’s go through some alternative ways of applying IHC procedures.

Alternative dissection and fixation techniques can be used to prepare Drosophila larva for imaging.

In this experiment, researchers want to learn how cells generate specific shapes.

They do this by tracing the morphologies of larval tracheal terminal cells.

The researchers take advantage of a mutant fly line that expresses GFP.

The GFP expression is induced by exposure to heat in a water bath

Larvae are selected under a dissection microscope with fluorescence.

Flies emitting fluorescence indicate successful activation of GFP.

These flies are submitted to an alternative form of fixation by heat; no dissection is necessary.

After using software to assist tracing, cellular morphologies of tracheal branches and lumen are identified .

The Drosophila ovary is an excellent model for understanding how stem cells interact with their cellular environment.

IHC of Drosophila ovaries begins by identifying Drosophila females by presence of ovaries versus testes, which are apparent in males.

Collected female larvae are transferred to individual wells where they are carefully dissected to obtain a structure known as the fat body, which houses the ovaries.

Fat bodies are fixed and stained, and then – after placing the tissue on slides – the ovaries are separated from fat body tissue. After mounting and visualizing the slides, fluorescent staining reveals the location of somatic cells and primordial germ cells in the larval ovary .

Immunohistochemistry of Drosophila larvae has many parallels to pupal and adult IHC.

For example, researchers can use IHC to look at Drosophila retinas at different developmental stages: larval, pupal, and adult, thereby illustrating the difference between pupal, larval, and adult immunohistochemistry procedures.

Results show the various stages of development of Drosophila retinas.

Immunohistochemistry of Drosophila larva is a tool with a large amount of applications and variations. In this video we covered the procedures for immunostaining larvae including dissection, fixation, staining, and mounting. Thanks for watching!