Name: 経時インドシアニングリーン血管造影による加齢黄斑変性症のマウスモデルにおける脈絡膜血管系の異常を検出する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学ぶ 経時インドシアニングリーン血管造影法を用いて、加齢黄斑変性症マウスモデルの脈絡膜血管異常を検出する方法です。尾静脈注射と多時相画像取得により、病態進行を詳細に解析できます。

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この作品は、失明（RPB）を防止するためにNIHの助成金1R01EY022901、リサーチからキャリア開発賞によってサポートされていました、CMReeves＆MAリーブス財団、視覚障害者のためのE.マチルダチーグラー財団、テンプル騎士団アイ財団、学科への無制限の助成金RPBからのユタ大学の眼科。 私たちは、原稿議論やコメントのためのSpectralisマルチモダリティイメージングシステムとタオ張に関する技術支援をBalamurali Ambatiに感謝します。

1。楽器の準備<ol><li>手順は、動物施設で手術室で行われる。 </li><li>実験を開始する前に、フェイスマスク、ヘアボンネット、手術用ガウン、無菌フットカバー、手袋を着用してください。 </li><li>ホットプレート上でビーカーを〜40℃の熱水。 </li><li>撮影時のマウスの体温を維持するために後で使用します加熱パッドの上に無菌青パッドを配置。加熱パッドをオンにします。 </li><li>イメージングシステムを準備します。 <ol><li>ダストカバーを外して、レーザーをオンにします。 </li><li> 55°レンズを取り出し、マシンにマウントします。 </li><li>コンピュータと入力、新しい患者のシートの下にイメージングのためのマウスの情報（ 例えば 、遺伝子型、年齢など ）からイメージングソフトウェアを開きます。 「デバイスの種類」の下では、赤外線（IR）モードを選択します。 </li></ol></li></ol> 注：これは、報告されているoを使用我々は（ 図1-4、代表的な結果を参照）、外部のレンズを用いることなく、IV-ICGAことにより、高品質の画像を得ることに問題はないものの、外部の二重非球面レンズfの画質を向上させることができる17-20。 2。 ICGAの尾静脈注射<ol><li> 1％トロピカミド点眼液をマウスの眼を拡張し、5分待ちます。 </li><li>必要に応じて麻酔（ケタミン/キシラジン/アセプロマジン65-100/10-20/1-3 mg / kg）の量を決定するために、マウスを秤量する。 </li><li> 32 Gの針と一緒に、滅菌1 mLの注射器を取り出す。麻酔薬（13 mg / mlのケタミン、2.6 mg / mlのキシラジン、滅菌PBS中の0.3 mg / mlのアセプロマジン）を腹腔内にマウスを注入する。マウスが完全に麻酔されるまで待ちます（約5分）。 </li><li>静脈の血管拡張を引き起こすために40℃の温水中にマウスの尾を置きます。 </li><li> 32 Gの針を1ミリリットルの注射器を取り出す。 ICの所望の量を撤回G、1 mg / mlの25gのマウス（2 mg / kg）のために、無菌のチューブに0.2μMのシリンジフィルターで無菌濾過しICG、典型的に50μl。シリンジ内に空気を導入しないように注意してください。 </li><li>注入されるべき領域を殺菌するアルコール綿で尾を拭きます。 </li><li>外側尾静脈が上になるように、片手で尻尾を持ちます。針のベベルを上に向けて、最小限の角度で静脈に針〜2ミリメートルを注入する。静脈を穿孔しないように注意してください。少しシリンジに引くと針が正常に静脈に挿入されたことを示す針ハブ、への血流の痕跡を探します。 </li><li>ゆっくり静脈にICGを注入する。注入する際、最小の抵抗があるはずです。針を外して、任意の出血を止めるために〜5月10日秒間注入部位に直接アルコール綿を適用します。マウスは、撮影のための準備ができる。初期段階（注入後0-4分）をキャッチするためには、ESSEですすぐにイメージにマウスをntial。 </li></ol> 注：マウスの眼は、簡単に乾燥得ることができますし、麻酔下で白内障を開発することができます。これは、手術中の滅菌PBSを適用することにより、しっとり目を離さないことが重要です。 ICGA記録する前に、滅菌綿棒で過剰のPBSを拭き取る。他のラボは、角膜17から20の脱水を避けるために、コンタクトレンズを使用している。 3。 ICG血管造影<ol><li>網膜と脈絡膜の循環が最大輝度（0-4分）であるまで、イメージを脈絡膜の充填の初期段階の捕獲を許可するICG注入後30〜40秒を取るために開始します。網膜血管は、最良の焦点〜35〜45ジオプトリーで可視化され、脈絡膜血管系10〜15ジオプトリーで可視化される。 注意：動物モデルの最初の検査中に、それはすべての可能なABNOを識別するために、全ての角度（鼻、時間的、背側と腹側）から画像をキャプチャすることをお勧めします血管系におけるrmalities。初期段階で、中規模および大規模脈絡膜動脈と静脈の両方がよく可視化する。このプロトコルで使用される動物モデルにおいて、脈絡膜病変（ 例えば、polypoidalの拡張部分）は初期段階中に1分間現れ始めることができる。 </li><li>血管系の画像のフォーカスを設定します。明るさ制御と、それぞれ、制御モジュールおよびフォーカスノブを使用して焦点を合わせる。これらの値は、デジタル的に調整可能であり、容易に一定に保たれる。画像品質は、以下の技術を用いて再現可能であることを保証するためにカメラのレンズ定数にマウスの眼からの距離を保つ。 注：デバイスは、イメージ後部の目の部分を、我々は、フォーカス、明るさを維持しようとすると、カメラのレンズと我々の画像を異なる角度からの全体の後部の目のような一定のマウスの眼の間の距離ができるからである。このための鍵は、VIEの分野で目ICGにより放出された円形の発光を揃えることですカメラのW。これは、全体のイメージは、暗い領域を有しなくなるまで、左から右、上下、及びカメラ位置の調整·アンド·アウトすることによって達成される。発光とカメラの視野が並んでいる場合には、レンズの眼からの距離は、次の画像の集合だけでなく、品質の画像のための最適な距離でのための再現可能になります。 </li><li>脈管構造に焦点が合っていると、取得モジュールに丸い黒ボタンを押すことによって画像フレームをキャプチャする。黒い丸ボタンも最高の画像品質のためのICGの信号を低減または増強するために使用することができる。 </li><li>画像脈絡膜病変に対する最適な画角や焦点深度を決定します。それは、目の位置、焦点深度、全体の経時ICGA固定他のデバイスの設定を維持することが重要である。画像が取得モジュールのタッチスクリーンパネルの[取得]ボタンを押すと、保存されます。 </li><li> 6月15日分の後方で中間相での画像を取得ER注入。 注意：脈絡膜および網膜血管の両方があまり明確ななる。脈絡膜血管系は、拡散蛍光として表示されます。 hyperfluorescenceを示す脈絡膜病変は、通常のバックグラウンド蛍光を取り囲むフェージングとは対照的に現れる。 </li><li>注射後の17〜25分で後期相での画像を取得する。 注意：Hyperfluorescenceはフェード。脈絡膜および網膜血管の両方が表示されなくなり。視神経頭が黒くなります。 Hyperfluorescent脈絡膜病変は、フェージング背景に最大限のコントラストを持っています。 </li><li>画像の取得が終了した後、マウスの眼に明確な潤滑アイジェルを適用し、回復のための加熱パッド上でマウスを残す。 </li><li>ケージや保持領域にマウスを返します。さらに分析するために、TIFFやJPEGファイルとして書き出す画像。 </li></ol> 注：各フェーズのタイミングが絶対的なものではない。我々が発見したEAのタイミングCh相は、注入されたICGの量に応じて変更される可能性があります。より多くのICGは、各相を延長する傾向がある。位相を定義するための最良の方法は、上記の各フェーズの主な機能に応じてある。

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</ol>

YFは本研究で使用したAMDのマウスモデルに関連する2出願中の特許の発明者である。 SK、ZB、及びADJは、開示することは何もありません。

本研究では、HTRA1トランスジェニックマウスにおける画像脈絡膜病変ICGAの使用を実証した。私達のマウスモデルにおける初期、中期、及びICGAの後期相の特徴は、ヒトの研究1でよく時間経過と一致する。これは、AMDのような脈絡膜に関連する症状の病態生理学的メカニズムと治療戦略の研究に貴重であるヒト病理と動物の表現型の間のよりよい比較を行うことが重要です。 まず、IP注射によりマウスにおいてICGAを行い、時間経過は、マウスからマウスへの、おそらく腹部体腔からICG色素の可変吸収（ 図3）に対して高度に可変であることがわかった。これは、困難なIV注入により行わヒトの研究と比較することができる。加えて、IV-ICGAの異なる段階の血管造影特徴が動物における脈絡膜病変の異なるタイプを特徴付けるために非常に有用である<html>モデル。ほとんどの人は、（マウスの尾静脈は小さいです）尾静脈注射を実施する技術的課題にマウス用（FAにおけるEG）IV注射を避けるために選択します。しかし、努力は、当この技術の再現性の性質及び...

インドシアニングリーン血管造影（ICGA）は、目の血管に関連した画像の問題の診断テストです。発光スペクトルは835 nmの1にピークを有する発光770-880 nmの範囲でありながら、ICGの吸収スペクトルは790-805 nmの範囲である。これは、そのスペクトルが可視範囲内にある他の一般的な染料、フルオレセインナトリウム、異なる。赤外スペクトルは簡単に​​ナトリウム - フルオレセインベースのフルオレセイン血管造影（FA）で可視化をブロックすることができますすべてが網膜色素上皮（RPE）、漿液血液状流体、および脂質滲出液、貫通するICGを可能にします。 ICGは脈絡膜血管や脈絡膜病変の1,2の強化された画像化を可能にする98％のタンパク質結合少なく溢出、その結果、血管系である。 ICGAはほとんどRPEに後方で脈絡膜血管系を可視化するための唯一の選択肢となります。 図1は、マウスの眼の撮像血管系におけるICGAとFAの比較を示す。 FAはできるBイメージに網膜血管系井戸ではなく、脈絡膜血管系を使用した電子。対照的に、ICGAは、網膜および脈絡膜血管系の両方の画像に使用することができる。 ICGAを一緒に我々はこの研究で使用する赤外線感受性ビデオカメラ、高解像度のデジタル画像化システムまたは走査レーザー検眼鏡（SLO）を用いて行われる。 診療所では、ICGAはPolypoidal脈絡膜血管障害（PCV）、網膜血管腫増殖（RAP）、網膜色素線条、卵黄様黄斑ジストロフィー、中心性漿液性網脈絡膜、脈絡膜血管腫、出血、網膜などの脈絡膜血管系が関与する網脈絡膜疾患の数を診断する際に推奨されている細動脈macroaneurysms、脈絡膜腫瘍、および後部ブドウ膜炎1,3の特定の形態。 FAと光コヒーレンストモグラフィー（OCT）とICGAの組み合わせは、滲出性加齢黄斑の診断および管理における臨床医のための強力なツールを提供変性（AMD）4月10日 。 ICGAは脈絡膜を含む状態を診断するために特に有用である。実際、ICGAはPCV、滲出性AMD 11月13日のバリアントを診断するためのゴールドスタンダードと考えられている。 PCVは、脈絡膜血管系11-13に、端末polypoidal拡張部分で血管の分岐ネットワークによって特徴づけられる。 PCVが頻繁に漏れやpolypoidalコンポーネント11,14,15からの出血とRPEと網膜の再発漿液血液状分遣と関連している。我々は最近、トランスジェニックマウスの網膜色素上皮（RPE）16で、ヒトHTRA1、多官能性セリンプロテアーゼを発現することによって第PCV動物モデルの作製を報告した。我々は、増加HTRA1は、PCVの特徴、 例えば polypoidal病変を誘発することが示された。 ここでは、私たちのHTRA1のマウスモデルを用いて、AMD研究の尾静脈注射による経時ICGAの使用を実証した。我々のデータは示唆しているIV-ICGAは現在、脈絡膜病変を特徴づけるためのフィールド17,18に使用されるIP（又は皮下（SC））ICGAよりも優れている。 動物研究に関する声明動物実験は、施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されたプロトコールに従って実施され、眼科と視覚研究における動物の使用に関するARVO声明に従って行った。

<table><tbody><tr><td>Spectralis Multi-Modality Imaging System</td><td>Heidelberg Engineering, Germany</td><td>SPECTRALIS HRA+OCT</td><td></td></tr><tr><td>Tropicamide 点眼液 (1%)</td><td>Bausch &瞳</td><td>孔の拡張のための</td>Lomb <td>NDC 24208-585-64</td></tr><tr><td>Genteal Gel</td><td>Genteal</td><td>NDC 58768-791-15</td><td>&nbsp;クリアローションアイジェル&nbsp;</td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>Vedco Inc</td><td>NDC 50989-996-06</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>NADA 139-236</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Vedco Inc</td><td>NDC 50989-160-11</td><td></td></tr><tr><td>32-G Needle</td><td>Steriject</td><td>PRE-32013</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Indocyanine Green</td><td>Pfaltz &バウ</td><td>アーI01250</td><td></td></tr></tbody></table>

経時インドシアニングリーン血管造影による加齢黄斑変性症のマウスモデルにおける脈絡膜血管系の異常を検出する

Detecting Abnormalities in Choroidal Vasculature in a Mouse Model of Age-related Macular Degeneration by Time-course Indocyanine Green Angiography

インドシアニングリーン血管造影（またはICGA）は脈絡膜や、加齢性黄斑変性症（AMD）のような種々の眼疾患の網膜血管系の異常を診断するために眼科医によって実行される手法である。 ICGAは赤外線スペクトルで着色層を貫通するその能力に起因する眼の後脈絡膜血管系の画像に特に便利です。 ICGAの時間経過は、初期、中期、後期の段階に分けることができます。 3相目の問題の病態に関する貴重な情報を提供しています。静脈内（IV）による経時ICGAが注射が広く脈絡問題の診断および管理のために臨床で使用されているが、腹腔内注射によりICGA（IP）は、一般に、動物研究において使用される。ここでは、尾静脈注射し、共焦点走査型レーザー検眼鏡検査によってマウスにおいて高解像度ICGAの経時的画像を得るための技術を実証した。私たちは、脈絡膜ルイメージにこのテクニックを使用加齢性黄斑変性症のマウスモデルにおける排出。それはIPによるマウス脈管構造へのICGを導入することがはるかに簡単であるが、我々のデータは、それがIP-ICGAによって再現可能なICGA経時画像を得ることが困難であることを示している。対照的に、尾静脈注射を介してICGAはヒトでの研究に匹敵する高品質ICGA経時画像を提供する。加えて、我々はICGAは着色されたマウスで行っ比べ脈絡膜血管の鮮明画像を提供しますアルビノマウスで行っていることを示した。私たちは、時間経過IV-ICGAは、動物モデルに基づいてAMDの研究における標準的になってなければならないことを示唆している。

私たちは、CD1の背景が、どちらも、HTRA1トランスジェニックマウスと対照WT同腹仔でICGAタイムコースを実施した。アルビノのCD1背景がインドシアニングリーン血管造影（ICGA）イメージング（説明を参照）を容易にするように選択した。拡張部分のようないくつかの動脈瘤がHTRA1マウスにおける初期段階で表示されるようになった（ 図2、赤い矢印は、容器の先端に拡張を示し、赤い円は、クラスタ型polypoidal病変を示す）。脈絡膜の血管は、この初期のフィルインICG色素の段階でWT及びHTRA1マウスの両方にはっきりと見える。中間相では、初期段階でのhyperfluorescent病変はより明確になり、脈絡膜血管が（黄色の円は、より病変の出現を示す）HTRA1マウスをフェードインし始めながら、より病変が現れ始めた。すべての血管が背景に消えとして後期では、HTRA1マウスの脈絡膜病変は、より「明瞭な」となりました。視神経<html>ヘッドは、WTおよびHTRA1マウス（緑の矢印）の両方で暗かった。 3相の主な機能は、人間のAMD患者（;中間相、5〜15分間、初期段階、0-3分後期、18〜22歳分）でICG...

尾静脈注射によって行われるインドシアニングリーン血管造影（またはICGA）は、マウス脈絡膜の異常を特徴付けるために、高品質のICGA経時画像を提供する。

Indocyanine Green&#160;Angiography (or ICGA) is a technique performed by ophthalmologists to diagnose abnormalities of the choroidal and retinal ...

本手順の全体的な目的は、タイムコース・エンド・イン・グリーンおよびグラフィを用いて、加齢黄斑変性のマウスモデルにおける脈絡膜血管系の異常を検出することです。まず、動物の準備と注射用の色素の調製を行います。次に、イン・グリーンを尾静脈より注入します。次に、緑色蛍光血管造影（green angiography）における初期、中期、後期の各相で眼の画像を撮影し、それらをエクスポートして解析します。最終的に、緑色蛍光血管造影による時間経過の観察は、加齢黄斑変性における脈絡膜のさまざまな病変を特徴づけるための標準的な手法として利用できる可能性があります。マウスモデル。本手法の主な利点は、EndoSign Greenの腹腔内投与などの既存の手法と同様に、ヒトでの研究に匹敵する高品質なタイムコース画像が得られることです。手順を開始する前に、動物実験に適した適切な服装を着用してください。これには、サージカルガウン、滅菌フットカバー、ヘアキャップ、フェイスマスク、および手袋の着用が含まれます。次に、システムの電源を入れ、温度を37 °Cに設定し、滅菌済みのブルーパッドで覆い、イメージング中に使用するヒーティングパッドを準備します。次に、ホットプレートの電源を入れ、ビーカーに入れた水を40 °Cまで加熱します。レーザーを予熱し、装置に55度のレンズを取り付けて、尾静脈注射前のイメージングシステムの準備を行います。その後、イメージングソフトを開き、新しい患者シートにマウスの個体識別情報を入力します。デバイスタイプで、赤外線モードを選択します。イメージングシステムのセットアップ後、1% トロピカミド点眼液でマウスの瞳孔を散瞳させ、5分間待ちます。この間にマウスの体重を量り、必要な麻酔量を決定します。次に、付属のテキストプロトコルに従い、ケタミン、キシラジン、およびアセプロマゼンの混合液を腹腔内投与します。マウスが完全に麻酔状態になるまで約5分間待ちます。麻酔下にあるマウスの眼を眼軟膏で保護する代わりに、2分ごとに滅菌PBSを点眼するか、専用のコンタクトレンズを装着して、乾燥および白内障の発生を防ぎます。麻酔後、マウスの尾を40 °Cの水に20〜30秒間浸し、尾静脈を拡張させます。次に、32ゲージの針を装着した1 mLシリンジを用いて、1 mg/mLのインドシアニングリーン溶液を体重1 gあたり2 µL分吸引します。この際、シリンジ内に気泡が入らないように注意してください。次に、片手で尾を持ち、側尾静脈が上を向くように固定し、アルコール綿で注入部位を拭いて滅菌します。その後、針の切断面（ベベル）を上に向け、最小限の角度で静脈に約2 mm注入します。シリンジをわずかに引き戻し、針のハブに血液が流入しているかを確認します。これにより、針が静脈に正しく挿入されたことがわかります。次に、インドシアニングリーン溶液をゆっくりと注入します。注入時は抵抗がほとんどないはずです。針を抜き、注入部位にアルコール綿を5〜10秒間直接当てて止血してください。これで、尾静脈注射後のマウスのイメージング準備が完了しました。脈絡膜の充填の初期相で画像を撮影するため、速やかにマウスをあらかじめ準備したイメージングシステムへ移動させてください。まず、画像を調整し、目的の血管系に焦点を合わせます。網膜血管には35〜45ディオプター、脈絡膜血管には10〜15ディオプターの範囲でピントを合わせます。次に、コントロールモジュールを使用して明るさを調整し、ピントと明るさの値をデジタル的に調整します。設定後は、そのショットの種類に対してこれらの値を一定に保ってください。また、マウスの眼からカメラまでの距離も一定に維持してください。画像の品質に再現性を持たせるため、眼球後極全体をさまざまな角度から撮影し、初期スクリーニングを行います。まず、インドシアニングリーン色素によって放出される円形の発光部を、カメラの視野内に合わせます。これを達成するために、左右、上下、および前後に動かします。画像全体にピントが合い、暗い部分がなくなるまでカメラの位置を調整してください。再現性の確保のため、最適なデバイス設定を記録しておきます。血管系にピントが合ったら、取得モジュールの丸い黒いボタンを押して画像フレームをキャプチャします。このボタンは、最適な画質を得るために、indocおよびグリーンの信号を減少または強化させるためにも使用できます。前回のスクリーニング結果に基づいて特定の病変部位を検査するには、以前に決定した最適な角度とデバイス設定を用いてイメージングシステムをセットアップしてください。眼の視野角、フォーカス深度、およびその他のデバイス設定を、全工程を通して固定してください。撮像モジュールのタッチスクリーンパネルにある撮像ボタンを押し、画像を保存します。網膜および脈絡膜の血流が最大輝度に達するまで、早期相の画像撮像を継続します。これには最大4分かかります。その後、注入後6分から15分の間の中期相において画像の取得を継続します。ここでわかるように、この相では脈絡膜血管が不明瞭になり、びまん性の蛍光として観察されます。さらに、高蛍光を示す脈絡膜病変が出現します。次に、注入後17～25分の後期相で画像を撮影します。この相では、高蛍光が減衰し、血管は見えなくなります。また、視神経乳頭は黒くなり、減衰する背景に対して脈絡膜病変のコントラストが最大になります。画像の取得が完了した後、マウスの眼に潤滑剤IGELを塗布し、リカバリーのためにマウスを加熱パッドの上に置いておきます。マウスにある程度の動きが見られたら、ケージおよび飼育エリアに戻します。最後に、さらなる解析のために、すべての画像を画像ファイルまたはビデオファイルとして書き出します。ここでは、マウスの網膜および脈絡膜血管のイメージングにおける、ナトリウムフルオレセインを用いたフルオレセイン血管造影（FA）とエンドサイトグリーン（endocyt in green）を用いた血管造影（ICGA）の比較を示しています。網膜血管はFAとICGAの両方で観察できますが、脈絡膜血管はICGAでのみ観察可能です。以下は、野生型マウスの尾静脈にエンドサイトグリーンを注入した後に撮影した脈絡膜血管の画像です。HT A oneトランスジェニックマウスのどのイメージング段階においても、拡張や病変は見られませんでした。しかし、尾静脈投与と腹腔内投与のインドシアニングリーンのイメージング品質を比較するために追加でイメージングを行ったHRA oneトランスジェニックマウスでは、初期段階で拡張およびクラスター型のポリープ状病変の両方が見られ、中期段階でさらにいくつかの病変が出現し、後期段階でより明確になりました。腹腔内投与後5分で、両方のマウスにおいて脈絡膜血管の大部分が見えなくなり、12分後には完全に不可視となりました。下段のパネルでは、注入のルートに加えて、色素の色も画像の質に影響します。ここでは、緑色の時間経過 IV 投与を用いて、有色素マウスとアルビノマウスを比較しました。アルビノマウスでは、初期および中期段階において、大小両方の脈絡膜血管の画像が格段に鮮明であり、本手法の開発後、この分野のさらなる研究において優れた繁殖背景となると考えられます。この手法により、視覚研究分野の研究者がマウスモデルにおける脈絡膜の異常を探索することが可能になりました。

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経時インドシアニングリーン血管造影による加齢黄斑変性症のマウスモデルにおける脈絡膜血管系の異常を検出する

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