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Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

幼虫給電回路の機能解析ショウジョウバエ

Full Text

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09:23 min

November 19, 2013

DOI: 10.3791/51062-v

Parag K. Bhatt¹, Wendi S. Neckameyer¹

¹Department of Pharmacological and Physiological Science,Saint Louis University School of Medicine

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

キイロショウジョウバエの幼虫での給電回路は、供給速度の変化は口と胃の神経回路の変化と相関することを可能にする、シンプルでありながら強力なモデルを提供しています。この回路は、口のフックに予測だけでなく、腸を送信中枢セロトニン作動性神経細胞で構成されている。

Transcript

この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエモデルシステムを利用して、行動出力を神経アーキテクチャの変化と関連付けることです。これは、最初に成虫のショウジョウバエの個体群ケージを設置して幼虫を収集することによって達成されます。手順の次のステップは、後期2番目から初期3番目の幼虫の自発運動能力を評価することです。

3番目のステップは、幼虫の口のフックの伸縮を観察することにより、幼虫の摂食行動を評価することです。最後のステップは、免疫組織化学的手法を使用して、後期の3齢幼虫から証明された心室サンプルを解剖し、調製することです。最終的には、行動アッセイと免疫蛍光顕微鏡を組み合わせて使用することで、発生中の神経構造の異常が行動の変化にどのように関連しているかを結果に示すことができます。

この手法の意味するところは、神経アーキテクチャの発達の理解を深めることにまで及び、それにより神経疾患の進行をよりよく理解することができます。その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるプラグボットです。ショウジョウバエの個体数ケージを摂氏25度に維持し、12時間の明るい暗いサイクルで行います。

対照群と実験群が同じ照明条件にさらされている限り、この手法は標準的な実験室環境で実行できます。確立された個体群を使用して、メスがリンゴジュースに一晩中卵を産むことができるようにすることで、幼虫を収集します。寒天皿は朝に皿を交換し、集めた皿の中央に少量の酵母を置きます。

酵母は孵化した幼虫を引き付け、卵が摂氏25度で24時間成長するのを許し、翌日、ペーストから最初の幼虫を収集します。金属製のヘラを使用して、幼虫を新鮮なリンゴジュースまたはグレープジュースプレートに移します。追加の酵母ペーストは、アッセイが第2および初期の第3のInstar幼虫を収集するために実施されるまで、幼虫に栄養を与えるために追加することができ、第1のInstarは40〜48時間老化することを可能にする。

この期間中、給餌速度は収集するために一定です。後期の3番目の幼虫は、瓶の中で幼虫を育てます。ジュースプレートで後期の3齢幼虫を育てると、体性胃系に農業が蓄積するため、有害になる可能性があります。

幼虫の年齢は、この構造に明確な変化があるため、マウスフックの形態によって確認できます。幼虫のカビごとに、ジュースプレートを水で優しく広範囲に洗浄し、幼虫をメッシュフィルターに注いで、後期の2番目と初期の3番目の幼虫を収集し、行動分析を進めます。100ミリメートルの組織培養皿の2%acer基質上に1匹の後期2番目から初期の3番目の幼虫を置き、幼虫がちょうど1分間30秒間順応するのを待ちます。

カウンター集計を使用して、基質上の前後の各動きを、動物の体の4分の3で発生する各収縮をスコアリングします。幼虫が左右に揺れているが、実際には位置が変わらない場合、これらの動きは記録されません。時折、完全な前方から後方への収縮は、前方移動のような後方の動きを生成します。

後方移動もスコアリングされます。アッセイプレートは、合計で最大10匹の動物が試験された後に交換してください。実験条件ごとに少なくとも20回の録音を行います。

自発運動アッセイで使用した各幼虫を、鈍いイノックスを使用した摂食アッセイで採点します。その5、ピンセット。幼虫を自発運動アグリプレートから、5ミリリットルの均質な酵母溶液で覆ったアグリ充填プレートの中心に慎重に移します。

酵母溶液では、幼虫は大部分が所定の位置に留まり、餌の摂食は口フック収縮の速度に直接相関します。これは、頭蓋咽頭の咽頭の収縮権の延長と収縮として見られます幼虫が30秒間順応し、その後1分間、カウンターを使用してマウスフックの収縮回数を記録します。まず、新たに調製した4%EMグレードのホルムアルデヒドをPBSで3ウェルスポットグラスに装填します。次に、さまよう3番目の幼虫をPBSで解剖皿に移します。

一方の鉗子で後端を保持し、もう一方の鉗子で後端を動かさないように保持しながら口のフックを保持します。口のフックをそっと引っ張って、内臓にアクセスします。唾液腺、脳、脂肪体などの関連組織をすべて取り除きます。

次に、各腸をホルムアルデヒド固定具を含む3つのウェルディッシュに移します。腸を摂氏4度で不透明な組織培養ボックスで一晩インキュベートします。固定液を抜く翌日に、胃のセカを取り出し、証明された心室の近くで中腸をクリップして、突起が妨げられることなくはっきりと見えるようにします。

次に、固定液を1つのXPBTと交換し、組織を穏やかに揺さぶって10分間インキュベートします。このPBT洗浄を6回行います。次に、神経構造に影響を与えることなくセロトニンシグナル伝達を強化するセロトニンを追加します。

次に、揺さぶらずに摂氏4度で1時間腸をインキュベートします。1時間後、PBTで腸を6回徹底的に洗浄し、一次抗体を除去します。その後、抗セロトニン一次抗体と摂氏4度で腸を一晩インキュベートします。

翌日、PPT洗浄を6回繰り返し、続いて二次抗体を摂氏4度で90分間インキュベーションします。1〜400 Alexaフロア5 68ヤギ反米国、または1〜400反ウサギIgGを使用します。PBT洗浄法を用いて二次抗体を除去し、次いで腸を4ミリモル炭酸ナトリウム中で10分間穏やかに揺さぶりながらインキュベー

トします。

その後、腸を4%Nの没食子酸プロピルに20ミリモルの炭酸ナトリウムをバッファーとしてマウントし、400倍の拡大で蛍光下で観察して分析することができます。証明された心室の後端で画像を撮影することは、これらの繊維がしっかりと束されているため避けてください。中腸の後部線維は、組織に入ると魅惑的になるため、より分岐しています。

神経突起線維は、ニューロルシータやニューロエクスプローラーなどの商用ソフトウェアを使用して、手動で計算するか、無料で入手できるソフトウェアを使用して定量化できます。鮮明でない単純なネライトトレーサー画像は、ファイバーと静脈瘤を区別するのを難しくするため、ファイバーアーキテクチャが背景と明確に区別できる場合は使用しないでください。また、ネライトの長さに沿って個々の静脈瘤を識別できる場合、その調製物は分析に適しています。

また、繊維の残りの部分から個々の静脈瘤を識別できる場合、これは分析のための高品質の画像の別の指標です。脳から突き出た軸索線維は再発神経に束ねられており、証明された心室に到達して分離して神経支配するまでは分析には適していません。涙胃系 焦点範囲外の繊維を除くすべての繊維を分析します。

場合によっては、線維は複数の焦点面間で湾曲し、脳から証明された心室への個々の線維の突起を追跡し、静脈瘤と枝を数え、単位長さあたりの大きな静脈瘤の頻度を計算します。セロトニン作動性摂食回路の研究は、特定の因子が神経系の発達に及ぼす影響を分析するのに効果的です。供給速度を定量化することにより、供給回路の軸索構造をその機能出力とリンクさせることができます。

自発運動アッセイでは、対照遺伝子型と変異型遺伝子型の間で自発運動反応に差は見られません。突然変異が摂食回路にのみ影響を与える場合、突然変異楕円体本体が開きます。EBO 3 は、中央複合体の楕円体本体に構造上の欠陥があります。

野生型の親株。CSWUは、EO 3が摂食の低下をもたらす一方で、移動運動は影響を受けないことを明らかにしました。EO 3変異体の発生障害は、腸の尿酸構造に影響を与えました。

これらの幼虫は、尿酸の長さに沿って、小さいものから大きいものまで、より多くの枝分かれとより多くの静脈瘤を示しました。矢印の分岐ノード、矢印の先端の静脈瘤、アスタリスクの大きな静脈瘤に注意してください。これらの神経分岐の変化は、統計解析のために定量化されました。

この手順を試みるときは、幼虫や解剖された組織サンプルを傷つけないように注意することが重要です。

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