使用肺炎球菌植民に対するプロバイオティクスの影響を調査体外接着アッセイ

この手順の全体的な目標は、プロバイオティクス連鎖球菌細胞レバリウスが上皮細胞株への肺炎球菌の付着を阻害する能力を調べることです。これは、最初にCCL 23上皮細胞単層を調製することによって達成されます。24ウェルプレートでは、次にスロバと肺炎球菌を単層に順番に添加し、細胞をインキュベートします。

最終ステップでは、ウェルを洗浄して、付着していないバクテリアを取り除きます。CCL 23上皮細胞を溶解し、ウェル内容物を回収します。最終的に、肺炎球菌のアドヒアランスに対する唾液の多様性の影響は、細胞関連肺炎球菌の数を定量化することで評価できます。

この方法は、プロバイオティクスが肺炎球菌などの細菌性病原体の付着を阻害できるかどうかなど、感染症分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法のアイデアを思いついたのは、乳酸桿菌催眠術、GG、およびその他のプロバイオティクスが気道で使用される可能性を調査し始めたときです。この手順を実証するのは、ジェーン・マニングとゼンから私たちの研究室の博士課程の学生になります実験の前日に、合流点、CCL 23上皮細胞の培養に分割され、その後、プレウォーム培地でそれらを150, 000細胞/ミリリットルの濃度に希釈します滅菌50ミリリットルチューブで。

次に、処理した24ウェル組織培養プレートでウェルあたり1ミリリットルの細胞をインキュベートし、細胞を一晩インキュベートする。次に、10マイクロリットルのループ接種を使用して、各細菌培養物の10〜12の十分に分離されたコロニーを10ミリリットルのトッドヒューイットブロスと0.5%酵母抽出物に接種します。実験当日に14〜16時間、培養物を短時間ボルテックスしてインキュベー

各細菌培養物を3〜5秒間ボルテックスし、次に100マイクロリットルの肺炎球菌と100マイクロリットルの唾液を、10ミリリットルのブロスを含むラベル付きの予温チューブに加えます。接種したチューブを3〜5秒間ボルテックスし、摂氏37度でインキュベートして、培養物を中期対数期まで成長させます。CCL 23細胞培養の少なくとも80%coの流暢さを確認した後、トランスファーピペットを使用して24ウェルプレートの各ウェルから培地を取り出し、プレートをわずかに傾けて細胞単層を乱さないようにしてから、約500マイクロリットルのプレウォームPBSを追加し、トランスファーピペットで液体を穏やかに除去してウェルを2回洗浄します。

洗浄中はプレートを傾けて、2回目の洗浄後も単層を保護します。各ウェルに500マイクロリットルの温熱培地を加え、プレートをインキュベーターに戻しながら細菌培養物を準備します。まず、吸収剤600でレヴァリウス培養物の1ミリリットルの光学密度を測定します。

次に、5ミリリットルのSal Levarius培養物を10ミリリットルのチューブに移し、室温で1,870Gで4分間チューブに遠心分離します。スナットResusを廃棄した後、ODの読み取り値に応じて、200〜1000マイクロリットルのポイント85%塩化ナトリウムのペレットを、1ミリリットルあたり9番目のコロニー形成単位である10倍の最終濃度に懸濁します。正しい数のバクテリアを添加することは、翌日にコロニーカウントが行われるまで実際のバクテリアの数が決定されないため、実験の最も難しい部分です。

次に、再懸濁した唾液接種物を高とラベル付けされたマイクロフュージチューブに移します。高濃度を1〜10および1〜100で希釈し、より多くのポイント85%塩化ナトリウムで、希釈の間にアッセイボルテックスチューブ用の中濃度および低濃度のアルバールを作成し、ヘパリンコントロールウェルを作成します。各コントロールウェルから40マイクロリットルの培地を取り出し、50マイクロリットルのヘパリンをウェルあたり1ミリリットルあたり100単位の最終濃度まで追加します。

CCL 23細胞のみに10マイクロリットルのポイント、85%塩化ナトリウムを加え、CCL 23細胞と肺炎球菌のみの井戸ですべてのSIV領域の濃度を完全にボルテックスします。次に、10マイクロリットルの希釈されていない1〜10および1〜100 sivのさまざまな濃度を適切なウェルに加えて、細胞との細菌の接触を促進します。単層は、室温で114Gで3分間プレートを遠心分離し、次いで細胞が連続的にインキュベートされている間にプレートを1時間インキュベートし、ポイント85%塩化ナトリウムで唾液ストックを希釈し、滅菌スプレッダーを使用して、10をマイナス5に、10をマイナス6に、10をマイナス7に分散させる馬の血液寒天プレートに二重に希釈する。

プレートを逆さの位置で一晩、単層の終わりに向かって軟膏のインキュベーションとして培養します。肺炎球菌培養物の光学密度を測定し、細胞の1ミリリットルをスピンダウンします。Resusは、ODの読み取り値に応じて、300〜2000マイクロリットルのポイント85%塩化ナトリウムにペレットを懸濁し、ミリリットルあたり約1億5000万コロニー形成単位の最終濃度にします。

次に、ネガティブコントロールウェルを除くすべてのウェルに10マイクロリットルの希釈されていない肺炎球菌を加え、24ウェルプレートを再度遠心分離し、インキュベーションステップ中に共培養物を3時間インキュベートします。肺炎球菌ストックを唾液と同様の方法で段階希釈し、プレートします。インキュベーションを3時間行った後、顕微鏡で細胞変性の影響がないか細胞を確認します。

次に、各ウェルから培地を取り出し、共培養物を1つのXPBSで3回静かに洗浄して、単層を乱さないように注意しながら、非付着性細菌を除去します。次に、200マイクロリットルの0.1%Dig toinを摂氏37度と5%二酸化炭素で7分間細胞に横たわらせます。次に、それぞれに800マイクロリットルのTHBを追加します。

ウェルピペットを数回上下させ、各ウェルからの細胞懸濁液を標識されたマイクロ遠心チューブに回収します。最後に、付着性肺炎球菌を連続希釈し、翌日、適切な希釈プレートでコロニーをカウントします。この表の肺炎球菌とアルバールを定量化するために、スロバアルを添加した1時間後にCCL 23細胞に肺炎球菌を添加した代表的な実験の結果を示します。

肺炎球菌の付着は、生存カウントと点灯数の両方によって定量化され、A-Q-P-C-Rの結果は、細菌の絶対数と付着率の両方について、2つの方法間で一貫していました。肺炎球菌のみを含むウェル内の付着性肺炎球菌の数に正規化されます。

ヘパリンは、肺炎球菌の付着を阻害することが知られているため、コントロールとして使用されます。したがって、肺炎球菌とヘパリンの併用サンプルでは、肺炎球菌単独と比較して、アドヒアランスが約40%以上減少したことは、アッセイが成功したことを示しています。唾液は用量依存的に肺炎球菌の付着を阻害するため、1つの肺炎球菌に対して約10の唾液の高濃度の唾液が肺炎球菌の付着を最も低くしました。

これらの移植片は、唾液を添加した場合、肺炎球菌の1時間前、または肺炎球菌の1時間後、唾液を添加した場合に、CCL 23細胞への肺炎球菌の付着を示しています。アルバーは、肺炎球菌の前に追加すると、アルバーの高用量と中用量の両方がプレエディションアッセイで肺炎球菌アドヒアランスを大幅に減少させたため、肺炎球菌アドヒアランスを阻害するのにより効果的です。.一方、コイト版とポスト版では、高用量のスロヴァールのみが肺炎球菌の付着を阻害します。

したがって、このビデオを見た後、プロバイオティクス連鎖球菌細胞領域による肺炎球菌アドヒアランスの阻害を測定するためのin vitroアッセイの実施方法について十分に理解しているはずです。