Name: 使用肺炎球菌植民に対するプロバイオティクスの影響を調査体外接着アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学ぶ肺炎球菌の上皮細胞接着阻害におけるプロバイオティクスStreptococcus salivariusの効果をin vitroアッセイで。CCL-23単層培養を用いた定量的評価法が感染症予防戦略の開発に貢献します。

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この作品は、マードック子供研究所、ビクトリア州政府の業務インフラ支援プログラムからの資金によってサポートされていました。

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このアッセイの重要な部分は、Sの適切な濃度を追加していますのセクション3.1.7と3.1.12でのサリバリウスと肺炎球菌。濃度をOD測定値を用いて推定しているが、プレートを次の日にカウントされるまで正確な接種物が決定されていません。この理由から、我々は、対数中期を識別し、ODによって濃度を推定するのを補助するためのアッセイで使用されるすべての細菌株についての経時的なOD及び生菌数（CFU / ml）を測定するために成長曲線を実行することをお勧めします。また、肺炎球菌株は、その接着特性が実質的に異なることができます。良好な接着性（&gt; 3時間インキュベートした後の上皮細胞に付着した接種物の10パーセント）は肺炎球菌の付着を阻害するプロバイオティクスの能力を調査するアッセイのために推奨されていた株。経験豊かなオペレータが実行する場合であっても、図5に見られる比較的大きなエラーバーによって証明されるように、付着レベルは、アッセイアッセイを変化させることができる。についてこの理由は、我々は、各アッセイ条件の連のウェルを、各実験の3反復の最小値を推奨します。同様の可変性は<...

肺炎連鎖球菌 （肺炎球菌）は、肺炎、中耳炎、髄膜炎などの感染症を引き起こす可能性グラム陽性細菌である。これは、低所得国の子供たちと、毎年1 5歳未満の子供の推定80万死亡の原因の病気の主要な原因である。肺炎球菌は、しばしば幼児の鼻咽頭に運ばれる。この植民地は一般的に無症候性と考えられていますが、肺炎球菌感染症に先行し、ヒト集団2中の細菌のための貯蔵所として機能します。肺炎球菌共役ワクチン接種は、効果的なワクチン内に含まれる血清型のキャリッジを低減します。しかし、そこに90以上の肺炎球菌血清型があり、ワクチン接種はワクチン血清型の排除がnonvaccine血清型3に起因するキャリッジと病気の上昇が続いていることにより、血清型の交換、につながることができます。また、一部の高リスク集団において、肺炎球菌植民地化は、多くの場合、前に最初のワクチン用量4,5の投与と、非常に人生の早い段階で発生します。最近では、プロバイオティクスの使用は、肺炎球菌のコロニー形成を阻害する6,7 -付加的な戦略として提案されている。 インビトロ付着アッセイは、肺炎球菌付着8,9を調べるために使用されてきた。これらのアッセイは、肺炎球菌付着10上のプロバイオティックラクトバチルス·ラムノサス GG（LGG）の影響を調査するために適応されている。 LGGおよび他の乳酸菌に加えて、 ストレプトコッカス·サリバリウス 、口腔の一般的な居住者は、潜在的なインビトロおよび11 に肺炎球菌および他の呼吸器病原体を阻害する能力のコロニー形成への気道のための潜在的なプロバイオティクスとして研究されている- 13。ここで紹介するプロトコルは、S.の効果を調査するために使用される接着アッセイを記載肺炎球菌付着に対するサリバリウス K12ヒト上皮細胞株CCL-23へ。成長および付着特性は単離物10,14間で実質的に変化し得るように、アッセイで使用する前に、肺炎球菌分離株は、付着力を評価した。肺炎球菌やブドウの成長曲線サリバリウスを、光学密度（OD、 図1）（コロニー形成単位またはCFU / ml）を中間対数相と推定濃度を決定した。それは、それぞれのアッセイで使用する前に隔離するための生菌数とODにより成長を調べることをお勧めします。このアッセイは、標準的な組織培養施設及び設備を有する任意の実験室で行うことができる。このプロトコルでは、S.の3用量の効果サリバリウス前Sの付着に対する肺炎球菌のほかに1時間投与肺炎球菌 PMP843、鼻咽頭スワブから派生した血清型19Fキャリッジ分離株は、検査されます。付着性肺炎球菌を定量化するには、2つの異なる方法が提示されています。抑止する血液寒天上で平板鉱山生菌数、およびDNA抽出および定量PCRによる肺炎球菌15 LYTA遺伝子の検出。基本的な接着アッセイプロトコルは容易に異なる用量又はプロバイオティクスの投与時間を試験するために修飾することができ、また、他の細菌株又は種を用いることができる。

<table><tbody><tr><td>最小必須培地(MEM)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>SH30244.01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>SH30084.03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>T-75 フラスコ</td><td>ヌンク</td><td>156472</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CCL-23細胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-23</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ15090046</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>24ウェル細胞培養プレート</td><td>Nunc</td><td>142475</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>馬の血液寒天(HBA)プレート</td><td>Oxoid</td><td>PP2001</td>羊<td>の血液寒天プレートも許容されます</td></tr><tr><td>トッドヒューイットブロス</td><td>オキソイド</td><td>CM0189</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>Beckton Dickinson</td><td>212750</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ジジトニン</td><td>Σ-アルドリッチ</td><td>D141-100MG&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>使い捨てキュベットKartell</td><td></td><td>1938</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>ファイザー</td><td>2112105</td>は、<td>5,000 IU / 5m/&nbspの滅菌アンプルで提供されます。</td></tr><tr><td>滅菌スプレッダー</td><td>テクノプラス</td><td>S10805050</td><td>あるいは、ガラススプレッダーを96%エタノールに浸し、各使用前に火炎滅菌することができます</td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ムタノリシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SDS 20% ソリューション</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>キアゲン</td><td>19101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>QIAamp DNAミニキット (250)</td><td>Qiagen</td><td>51306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>LytA F プライマー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>カスタムメイド</td><td>5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA</td></tr><tr><td>LytA R primer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>カスタムメイド</td><td>5' -> 3' sequence&nbsp;TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT</td></tr><tr><td>LytAプローブ</td><td>Eurogentec</td><td>カスタムメイド</td>5 <td>'-> 3 'シーケンスCy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3、代替蛍光色素はヌ</td></tr><tr><td>クレアーゼフリー</td><td>ウォーターAmbion</td><td>AM9906</td><td>&nbsp;使用できます。</td></tr><tr><td>ブリリアントIII超高速QPCRマスターミックス</td><td>アジレントテクノロジー</td><td>ズ600880</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermo-Fast 96検出プレート&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AB-1100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>超透明qPCRキャップストリップ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AB-0866</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mx3005 QPCRシステム</td><td>Agilent Technologies</td><td>401449</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>*リストされている</td><td></td><td></td>ほとんどの/すべての製品で代替ソースが利用可能です<td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

使用肺炎球菌植民に対するプロバイオティクスの影響を調査<em&gt;体外</em&gt;接着アッセイ

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

鼻咽頭の上皮層への肺炎球菌 （肺炎球菌）の付着が植民地になることができます。 インビトロ接着アッセイは、細胞上皮する肺炎球菌の付着を研究するために使用することができ、肺炎や中耳炎などの肺炎球菌感染症のための前提条件と考えられている単層および、そのようなプロバイオティクスの使用など電位介入を調査するために、肺炎球菌のコロニー形成を阻害すること。ここで説明するプロトコルは、（時にはHEp-2細胞とも呼ばれる）は、ヒト上皮細胞株CCL-23への肺炎球菌の付着に対するプロバイオティックストレプトコッカス·サリバリウスの効果を調査するために使用される。上皮細胞および細菌細胞の1）準備、細胞単層上皮への細菌の2）に加え、3）生菌数（段階希釈およびプレーティング）による接着性の肺炎球菌の検出または定量的リアルタイムPCR（定量PCR：アッセイは、3つの主要な手順が含まれます）。このTEChniqueは比較的簡単であり、組織培養のセットアップ以外の特殊な装置を必要としません。このアッセイは、他のプロバイオティック種および/または肺炎球菌のコロニー形成の潜在的な阻害剤を試験するために使用することができ、容易に肺炎球菌の付着および侵入に関する他の科学的問題に対処するために修飾することができる。

これ肺炎球菌（ 肺炎球菌 PMP843、植民地19F分離株）の代表的な実験からの結果は、Sの添加後、CCL-23細胞を1時間に追加されましたサリバリウス 、および肺炎球菌の付着を表2に示した生菌数とLYTA定量PCRの両方によって定量した。結果数に正規化細菌の絶対数（CFU / mlとして提示）と％付着の両方のための2つの方法間で一致していた一人で肺炎球菌を含むウェル中の接着性肺炎球菌。ヘパリンは、それが肺炎球菌の付着を阻害することが知られているので、肺炎球菌+ヘパリン状態の付着を低減（典型的に&lt;40％、肺炎球菌単独と比較して）が成功したアッセイの指標であるようにコントロールとして使用する。S. 表2、S.高濃度に示すようにサリバリウスは 、用量依存的に肺炎球菌の付着を阻害するサリバリウス （概算LY 10 S.サリバリウス ：1肺炎球菌）は、最も低い肺炎球菌の接着された。 <p class="j...

インビトロでの付着アッセイは、細胞単層上皮するような肺炎球菌のコロニー形成を阻害するためのプロバイオティクスの使用のような潜在的な介入を調査するために、肺炎連鎖球菌の付着を研究するために使用することができる。

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

この手順の全体的な目的は、プロバイオティクスであるStreptococcus cell levariusが、上皮細胞株への肺炎球菌の付着を抑制する能力を調べることです。まず、CCL 23上皮細胞の単層を調製することでこれを達成します。24ウェルプレートにおいて、S. levariusと肺炎球菌を順次単層に添加し、細胞をインキュベートします。最終ステップとして、ウェルを洗浄して非付着細菌を除去します。CCL 23上皮細胞を溶解し、ウェル内の内容物を回収します。最終的に、細胞に結合した肺炎球菌の数を定量することで、salivariusが肺炎球菌の付着に及ぼす影響を評価できます。本手法は、プロバイオティクスが肺炎球菌などの細菌性病原体の付着を抑制できるかといった、感染症分野における重要な疑問への回答に役立ちます。私たちがこの手法を考案したのは、呼吸器系におけるLactobacillus rhamnosus GGおよびその他のプロバイオティクスの潜在的な利用について研究を始めたときのことでした。本手順のデモンストレーションは、当研究室の博士課程学生であるJane ManningとZenが行います。実験の前日に、コンフルエントに達したCCL-23上皮細胞の培養物を剥離し、滅菌済みの50 mLチューブ内で、あらかじめ温めておいた培地を用いて150,000 cells/mLの濃度に希釈します。次に、処理済みの24ウェル組織培養プレートの各ウェルに細胞を1 mLずつ播種し、一晩インキュベートします。その後、10 µLループを用いて、各細菌培養物の分離コロニーを10〜12ウェル分、0.5%酵母エキスを添加した10 mLのTodd Hewittブロス分注液に接種します。軽くボルテックスした後、実験当日に14〜16時間インキュベートします。各細菌培養液を3～5秒間ボルテックスし、次に、10 mLのブロスを含むラベル付きの予熱済みチューブに、pneumococciを100 µL、salivariusを100 µLずつ加えます。接種後のチューブを3～5秒間ボルテックスし、37 °Cでインキュベートして、培養液を対数増殖期中期まで増殖させます。CCL 23細胞培養のコンフルエンシーが少なくとも80%であることを確認した後、トランスファーピペットを使用して24ウェルプレートの各ウェルから培地を除去します。この際、細胞単層を乱さないようプレートをわずかに傾けます。その後、約500 µLの予熱済みPBSを加えてウェルを2回洗浄し、トランスファーピペットで液体を静かに除去します。2回目の洗浄後は、単層を保持しやすくするため、洗浄中にプレートを傾けてください。各ウェルに予熱した培地を500 µL加え、細菌培養の準備をしている間、プレートをインキュベーターに戻します。まず、levarius培養液1 mLの光学密度を600 nmの吸収波長で測定します。次に、5 mLのSal Levarius培養液を10 mLチューブに移し、室温で1,870 Gsで4分間遠心分離します。上清を捨てた後、OD値に応じて200〜1000 µLの0.85%塩化ナトリウムでペレットを懸濁し、最終濃度を約1.5 × 10⁹ CFU/mLにします。実際に添加された細菌数は翌日のコロニー計数まで確定しないため、適切な数の細菌を添加することがこの実験で最も難しい部分となります。次に、再懸濁した唾液接種物を「high」とラベルしたマイクロ遠心チューブに移します。この高濃度溶液を、0.85% sodium chlorideを用いて1:10および1:100に希釈し、アッセイ用の「medium」および「low」濃度溶液を調製します。希釈の合間にボルテックスミキサーで撹拌し、ヘパリンコントロールウェルを作成します。各コントロールウェルから40 µLの培地を取り除き、最終濃度が1ウェルあたり100 units/mLとなるように50 µLのheparinを添加します。CCL 23細胞のみのウェルと、CCL 23細胞および肺炎球菌を添加したウェルに、0.85%塩化ナトリウム溶液を10 µL加え、すべてのSIV濃度領域を完全にボルテックスします。次に、細菌と細胞単層との接触を促進するため、未希釈、1/10、および1/100のさまざまな濃度のSIVを10 µLずつ、適切なウェルに加えます。プレートを室温で114 ×gで3分間遠心分離し、その後、細胞を1時間インキュベートします。インキュベーション中に、唾液ストックを0.85%塩化ナトリウムで段階希釈し、滅菌スプレッダーを用いて、10⁻⁵、10⁻⁶、および10⁻⁷希釈液を100 µLずつ、馬血寒天培地プレート上に2連で分散させます。単層培養の終了間際、プレートを倒立させた状態で一晩インキュベーションします。肺炎球菌培養液の吸光度（OD）を測定し、その後、細胞1 mLを遠心分離で回収します。OD値に応じて、ペレットを0.85%塩化ナトリウム溶液300～2000 µLで再懸濁し、最終濃度を約150 million colony forming units/mLに調整します。次に、陰性対照ウェルを除くすべてのウェルに、希釈していない肺炎球菌を10 µLずつ加え、24ウェルプレートを再度遠心分離し、共培養を3時間インキュベートします。インキュベーションの間、肺炎球菌ストックをsalivariusと同様の方法で段階希釈してプレートに播種します。3時間のインキュベーション後、顕微鏡下で細胞に細胞変性効果（CPE）が見られるか確認します。次に、各ウェルから培地を除去し、非接着性の細菌を取り除くために、単層を乱さないよう注意しながら、1×PBSで共培養物を3回穏やかに洗浄します。その後、0.1% Digitonin 200 µLを用いて、37 °C、5% CO2の条件下で7分間、細胞を溶菌させます。続いて、それぞれにTHB 800 µLを加えます。各ウェル内でピペッティングを数回行い、細胞懸濁液をラベル付きのマイクロ遠心チューブに回収します。最後に、付着した肺炎球菌を段階希釈し、翌日に適切な希釈プレートでコロニー数を計測します。この表における肺炎球菌とslovarの定量化については、slovar添加の1時間後に肺炎球菌をCCL 23細胞に添加した代表的な実験の結果を示しています。肺炎球菌の付着能は、生菌数測定およびqPCRの結果の両方を用いて定量化しました。細菌の絶対数と付着率のいずれにおいても、2つの方法の間で一貫した結果が得られました。肺炎球菌のみを含むウェルにおける付着肺炎球菌数で標準化しました。ヘパリンは肺炎球菌の付着を抑制することが知られているため、コントロールとして使用されます。したがって、肺炎球菌単独のサンプルと比較して、肺炎球菌にヘパリンを加えたサンプルで付着が約40%以上減少していれば、アッセイが成功したことを示します。唾液は肺炎球菌の付着を濃度依存的に抑制し、唾液と肺炎球菌の比率がおよそ10:1という高濃度の条件下で、肺炎球菌の付着が最も低くなりました。これらのグラフは、肺炎球菌を添加する1時間前、同時に、または1時間後にsalivariusを添加した際の、CCL 23細胞への肺炎球菌の付着を示しています。肺炎球菌の添加前にAlvarを添加した場合、高用量および中用量のAlvarの両方で肺炎球菌の付着が有意に減少したため、肺炎球菌の付着抑制においてより効果的でした。一方で、Coit editionおよびpost editionのアッセイでは、高用量のSlovarのみが肺炎球菌の付着を抑制しました。このビデオを視聴することで、プロバイオティクスであるStreptococcus salivariusによる肺炎球菌の付着抑制を測定するためのin vitroアッセイの実施方法について、十分に理解できたはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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肺炎球菌によるマウス鼻咽頭のコロニー形成および後の付着またはリクルートされた細胞の抽出について説明する。この技術は、ナアレスを通して鼻咽頭および流体の収集を洗い流し、その場所でのmRNA発現の差動細胞定量および分析を含む様々な読み出しに適応可能である。...

肺炎球菌による鼻腔内コロニー形成時の炎症反応の特徴

肺炎球菌は、重症市中肺炎、世界中200万人以上の死亡の原因を引き起こす主要な病原体である。フィットネスまたは病原性に関与する細菌性因子の影響は、生物発光細菌を用いて、マウスの急性肺炎または菌血症モデルにおいてリアルタイムでモニターすることができる。...

生物発光細菌を使用してリアルタイムに急性肺炎のマウスモデルにおける肺炎球菌の毒性因子の影響を以下の

Streptococcus pneumoniaeの競合は、肺炎球菌や他の関連種に対する阻害活性を持つ小さな抗菌ペプチドであるバクテリオシンによって媒介されます。ここでは、バクテリオシン活性と阻害スペクトルの特性評価、バクテリオシン特異的免疫、分泌クォーラムセンシングペプチドの検出を可能にする最適化された細菌オーバーレイアッセイについて説明します。...

定性的にオーバーレイアッセイを使用すると、肺炎球菌バクテリオシンに対する細菌の産生と感度を測定します

強制経口投与を用いた新生児マウスにおけるプロバイオティクス研究

我々は、CFBE41o-細胞、THP-1マクロファージ、および空気液体界面-で確立された緑膿菌を用いて、感染した気道の3次元共培養モデルのプロトコルについて説明する。このモデルは、抗生物質の有効性、上皮バリア機能、および炎症マーカーを同時にテストするための新しいプラットフォームを提供します。...

P. アフルギノーサ 抗感染性の前臨床評価のための空気・液体界面における気管支上皮細胞とマクロファージの感染3Dコカルチャー

高スループット蛍光標識イメージングを用いた表形性付着に基づく宿主菌病原体相互作用の検出と、自動化された統計解析法により、宿主細胞との潜在的な細菌相互作用の迅速な評価が可能になります。...

ホスト細胞への細菌の付着を自動的に、ハイスループットで検出

本プロトコルは、非炎症条件下で pks+大腸菌 をマウスに定着させるために必要な手順と、便中での pks+大腸菌 の拡大の定着と評価のための非侵襲的手法を説明しています。...

非炎症条件下でのマウス pks+大腸菌 の定殖

学ぶ肺炎球菌の上皮細胞接着阻害におけるプロバイオティクスStreptococcus salivariusの効果をin vitroアッセイで。CCL-23単層培養を用いた定量的評価法が感染症予防戦略の開発に貢献します。

使用肺炎球菌植民に対するプロバイオティクスの影響を調査

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