k空間画像相関分光法を用いて、EGFPタグ付きプラズマ膜タンパク質の拡散係数を簡単に測定

この手順の全体的な目的は、生細胞内における膜タンパク質の拡散係数を測定することです。まず、GFPタグ付きタンパク質を発現させた細胞を培養し、次にスピニングディスク顕微鏡を用いて、焦点を細胞膜に合わせたタイムラプス画像シーケンスを取得することでこれを達成します。2番目のステップは、画像スタックの中から、膜が平坦であり、かつ移動するオルガネラが存在しない領域をクロップして選択することです。

次に、切り出した領域をケースベース画像相関分光法ソフトウェアを用いて解析します。最終ステップとして、Excelで拡散プロットの平均を算出します。最終的に、ライブセル顕微鏡法とkicksを組み合わせることで、膜タンパク質の拡散係数を測定します。

本手法は、異なる条件下における膜タンパク質の拡散係数の算出など、膜生物物理学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。kicksコードを初めて使用する場合は、MATLABを起動して「ファイル」をクリックしてください。次に「パスの設定」を選択し、「サブフォルダも含めて追加」をクリックして、コンピューター内でkicksコードが保存されているフォルダを選択します。

OKをクリックします。取得中にMATLABを保存して閉じる前に、イメージングの間中、膜のフォーカスを維持することが重要です。蛍光が均一に分布している膜の平坦な部分に、長方形の関心領域（ROI）を選択します。

移動している細胞小器官や突出した膜領域は除外してください。十分な統計量を確保し、良好なK2プロットを作成できるようクロップサイズを選択します。領域をクロップし、その結果をtiff形式で保存します。

適切なフォルダに保存します。同一の動画から複数のクロップを作成した場合は、stack one crop, do tiff, stack one, crop two, tif のように、番号を増やして命名してください。解析を行うには、まず MATLAB を起動し、コマンドウィンドウに ICS gooey と入力して Enter キーを押してください。

GUIは、ICS Gooeyにおける画像相関分光法グラフィカルユーザーインターフェースプログラムの実行ファイル名です。「kicks」タブをクリックしてください。「MATLAB code」という名前のフォルダを探してください。

ファイル名がscriptsであるファイルまでスクロールし、それをダブルクリックして開きます。このファイルはエディタと呼ばれます。エディタ内では。

スクロールしてkicksデータセットを読み込みます。次に、ファイル名とフォルダの場所をコピーまたはコマンドラインに入力してください。以下のコマンドラインにフォルダの場所を指定します。

解析するフレーム数を設定します。データシリーズ内の連続するすべての動画に対して、同じ設定を使用してください。後方のフレームでフォーカスのズレが生じている場合に適用します。

これらはエディターでの解析から除外する必要があります。「保存」をクリックし、次に「評価」をクリックします。これでデータセットが読み込まれ、GUIのkicks解析ウィンドウで解析ソフトウェアに表示されます。

まずT細胞のボックスのチェックを外し、解析の設定を入力します。次に、解析するタイムラグ数を入力します。最大K二乗値を入力してください。

初期値は通常20から50の間です。最適な値が決定されるまで解析を繰り返し、その後、データシリーズ内のすべての連続する動画にその設定を適用してください。選択した設定によって、良好なカイ二乗プロットおよび線形の拡散プロットで示されるように、データに良好にフィットしていることを常に確認してください。

次に、store settingsをクリックして進みます。続いて、yesをクリックしてすべてのグラフを表示させます。load image seriesをクリックし、次にworkspaceをクリックします。

ワークスペースからインポートをクリックする前に、画像シリーズのクロップを選択します。次に、ピクセルサイズのボックスにイメージングシステムの収集設定を入力します。画像スタックを取得した際のイメージングシステムの投影ピクセルサイズを入力してください。

「select ROIs」をクリックし、1つのROIを入力します。次に「okay」をクリックし、「whole image」を使用します。「do kicks analysis」をクリックし、「yes」をクリックして不動フィルタリングを実行します。

結果は画像として自動的に開きます。設定ウィンドウ、セル情報ウィンドウ、およびダイナミクスウィンドウ内のフォトフィジックスウィンドウをそれぞれ最小化してください。ダイナミクスプロットで、データが負の勾配に沿って直線的にフィットしていることを確認してください。これは、データポイントに相関があり、自由拡散であると想定できることを意味します。

特定のタイムラグおよびK squaredの設定における拡散係数を記録します。K squaredプロットのデータポイントは、指定された時間のライン周辺に集まっている必要があります。「Lags」チェックボックスをオンにし、「save open figures as images」を選択して、結果ファイルを画像として保存してください。

新しいフォルダーに保存し、「clear current data」をクリックしてから、次の作物の解析に進みます。あらかじめ設定した作物の名称を用い、各ROIから得られた個々の拡散係数をスプレッドシートに入力し、タイムラグの数とK squared値を必ず記録してください。スプレッドシートプログラムを使用して、平均拡散係数と標準偏差を算出します。

統計的な有意差を評価するために、MOV SmirnoffテストまたはStudentのt検定を行います。有意水準5%を用いて、細胞間の定量的な比較を行うことができます。拡散プロットのスプレッドシート版は、解析ソフトウェアによって作物ごとに作成され、各タイムラグにおける各条件のデータが平均化されています。

論文やプレゼンテーションで提示するための、新しい平均拡散プロットを作成します。ここに提示する結果は、EGFPでタグ付けされたAquaporin 3のタイムラプス画像シーケンスです。これは、フォーカスを細胞膜に合わせたスピニングディスク顕微鏡で撮影した、腎上皮細胞である生存 MDCK 細胞のものです。

ここに示すのは、クロップ選択のための例となるROI（関心領域）クロップを矩形で強調表示した細胞の画像です。2次元拡散のみを可視化するため、膜が均一で平坦な細胞の辺縁部でクロップすることが重要です。細胞小器官、小胞、および膜突出部は避ける必要があり、また、解析においてはタイムラプス中のドリフトがないことが重要です。

この代表的なクロップは、拡散係数に影響を及ぼす可能性がある移動小胞が含まれているため、解析およびキックから除外されました。膜に穴がある除外クロップの別の例をここに示します。キックを用いて生成された1つのクロップの拡散プロットをここに提示します。

この手法は、蛍光タンパク質、色素、または量子ドットで標識されたタンパク質の拡散係数を求めるために使用できます。拡散プロットにおける曲線の傾きは、単純に拡散係数の負の値となります。ここに示したEGFPで標識されたAquaporin threeの例では、タイムラグ（時間遅れ）が多すぎるため、計算された拡散プロットが非線形になっています。このケースでは、拡散プロットが線形になるよう、タイムラグの数を減らして解析をやり直しました。

ここでは、代表的なケースの2乗プロットを示します。これは、これらのK2乗プロットから選択したタイムラグにおける、放射状平均および対数変換後の相関曲線です。この傾きをタイムラグに対してプロットした結果が、先に示した拡散プロットとなります。

K平方プロットを確認する際は、このK平方プロットに基づいてフィッティングを評価することが重要です。プロットが負の傾きを持ち、ノイズフロアまで線形に減衰する必要があるため、クロップ範囲が狭すぎて適切に解析できなかったと結論付けることができます。K平方の値が大きくなるにつれて残差が増大しており、フィッティングの状態が悪くなっているため、このK平方プロットは最大K平方値を下げて再解析する必要があります。

この場合、より低い最大K squared値を入力し、解析を再度実行する必要があります。ここでは、10個のクロップで平均化した平均拡散プロットを示します。この拡散プロットは、解析によって得られたExcelファイルから抽出されました。

AQUAPORIN 3 EGFPの拡散係数は、この手順に従って算出します。薬剤投与後の膜タンパク質の拡散係数の測定など、他の手法を用いることで、薬剤処理後に拡散係数が変化するか、また膜内の脂質環境やタンパク質間相互作用に変化が生じている可能性があるかといった、さらなる疑問に対する検討を行うことができます。