細胞培養物衝撃波アプリケーション

この手順の全体的な目的は、in vitroでの衝撃波治療中に、結果の再現性を妨げる物理的な影響を回避することです。これは、まず細胞培養フラスコに培地を完全に満たし、その後、フラスコを恒温水槽に入れることで達成されます。2番目のステップは、アプリケーターを水槽に結合させる際に、十分な量の超音波ジェルを使用することです。

次に、アプリケーターをウォーターバスのメンブレンに対して水平に配置します。最後のステップは、細胞が波の焦点内に位置するように、衝撃波源を細胞培養フラスコの中心に合わせることです。最終的に、リアルタイムPCRやサイトカインアレイを用いて、目的の遺伝子やサイトカインの変化を示すなど、細胞の解析を行うことができます。

既存の細胞培養に短波を直接照射する方法では、培地から外気に至る境界での波の反射の影響が考慮されていないことに気づき、本モデルを考案しました。本手順のデモンストレーションは、私の研究グループの博士課程学生であるDr. Chanteが行います。まず、3.5 Lの水道水を37 °Cまで加熱してください。

次に、加熱した水をウォーターバスに移します。水位はウォーターバスの上端から3 cm下に設定し、メンブレンが完全に浸かるようにしてください。続いて、温度センサーを電源に接続し、ウォーターバス背面壁にあるフィッティングに温度センサーを設置します。

その後、水を撹拌しながら、ヒーターを電源に接続して水を37°Cの安定した温度まで加熱します。無菌条件下で、細胞をT 25培養フラスコに播種します。

一晩培養することで、コンフルエンシーが90%に達します。その後、フラスコを垂直に立て、コンタミネーションを防ぐため、フラスコのネックの底部まで培地を満たします。この際、培地がフラスコのネックや密閉キャップに接触しないようにしてください。

次に、バス内の水による汚染を防ぐため、フィルターのないソリッドキャップでフラスコを密閉します。その後、パラフィルムでキャップを封止します。フラスコを封止した後、スタンドにクランプで固定します。

次に、固定したフラスコをウォーターバスに挿入し、細胞培養フラスコの中央を合わせます。ショックウェーブアプリケーターのメンブレンの中心に合わせて、アプリケーターとウォーターバスのメンブレンの両方に超音波伝達ジェルを十分に塗布してください。その後、アプリケーターをメンブレンに接続し、その間に気泡が入っていないことを確認します。

次に、衝撃波アプリケーターをメンブレンの中央に保持し、細胞培養フラスコの水平方向および垂直方向と一致させ、細胞増殖領域全体が処理されるようにします。その後、予備実験を行い、衝撃波アプリケーターと培養フラスコ間の最適な距離を決定し、適切な処理パラメータを定義します。衝撃波装置の作動中は、培養フラスコとアプリケーターを安定した位置に保持するようにしてください。

最適な距離が決定したら、目的の衝撃波処理パラメータで実験を行います。衝撃波処理の完了後、細胞培養フラスコをウォーターバスから取り出し、ペーパータオルで拭き取り、フラスコの外表面を消毒します。次に、フラスコ内の培地を遠心チューブに移します。

通常の遠心分離条件で細胞をペレット化します。細胞ペレットを2 mLの細胞培養液で再懸濁し、その後、5 mLの細胞培養液が入ったフラスコに細胞懸濁液を戻し、細胞解析実験に必要なコンフルエンシーまで細胞を培養します。ヒト臍帯静脈内皮細胞のリアルタイムPCR解析により、衝撃波処理後にtie2 mRNAレベルが上昇していることが明らかになりました。

これは、衝撃波治療が血管内皮細胞の増殖および血管新生を促進することを示唆しています。臍静脈におけるサイトカインレベルを測定しました。内皮細胞はサイトカインアレイを用いて定量化されました。

炎症性サイトカインであるIL sixおよびIL eightも有意に増加していることが判明しました。これらはいずれも、血管新生プロセスの進行に伴う炎症に関与しています。本手法により、衝撃波の基礎科学分野の多くの研究者が、in vitro実験において単一の細胞型への影響を探索する道が開かれました。衝撃波科学において再現性および比較可能性のある結果を得るために、より多くの研究者に本モデルの活用を促せればと考えています。