Name: 局所または全身薬理学的介入後のマウスの揮発性全身麻酔の感度変化を評価する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-16T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学ぶ マウスの揮発性全身麻酔感度変化評価法。薬理学的介入後の正位反射を指標に、意識レベル変化を測定する手法。異種動物への応用可能な高スループットシステムです。

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この作品は、R01 GM088156およびT32 HL007713-18でサポートされていました。私たちは、立ち直り反射装置を組み立てる際の彼らの助けのためにペンシルベニア研究計装ショップ大学ビル·ペニーとマイケルカーマンに感謝したいと思います。

本明細書に概説動物に関わるすべての手順は、ペンシルベニア州の機関動物実験委員会の大学によって承認されている。 1。試験装置の概要<ol><li>試験装置24は、透明なアクリル製円筒チャンバ長さ10cmおよび直径5cm（合計200ml容量）から構成されている。このサイズは、一般的な25グラムの成体マウスに適しています。チャンバは、ガス入口及び出口のための各端部にポートを有する。動物がチャンバ内に容易に装填することができるように出口端部は、取り外し可能である。ゴム製のOリングガスケットは、円筒状チャンバの取り外し可能な端部をシールするために使用されている間、ガスポート開口部を慎重に、テフロンテープで封止されている。 </li><li>各チャンバは、水浴の内部に着座ラックに取り付けられている。 （ガス入口以下）チャンバの下部のみが浸漬されるように、ラックが嵌合されている。安定性のために、チャンバーのバックエンドは、支持体上に載るように全体CHAMBERは、水平方向に位置しています。これはバス付きのチャンバ全体のさえ接触を保証する。 </li><li>ポリエチレン管は、麻酔剤気化器に酸素タンクを接続し、次いで、10 L /分の流量計を通過する。チューブは等しい流れがチャンバ24の各々に、エージェント·アナライザに配信されていることを確認する等しい長さの25小径抵抗に分かれる。 </li><li>真空ラインは、ガス入口の反対側の端部に各チャンバを出る。これは呼気の二酸化炭素の再呼吸を排除一方向の流れを促進する。真空ラインは、社​​内吸引ラインに接続するためのマニホールドに結合します。主真空ラインに沿ってポップアップ遮断弁は、各チャンバ内の気圧条件を確実にする。 </li><li>浴は、完全に各チャンバの底部に接触するように十分な水で満たされている。水は、ポンプ37により一定°Cの浴に通って循環され、維持される。 </li></ol> 2。露光前のシステムをチェックしてください<ol><li> C言語一体これは水浴の温度が浴を通して37 度Cである。 </li><li> 5 L /分（チャンバ+エージェント·アナライザあたり200 ml /分）の速度で酸素を流す。リークを示すもので、どちらも、水の下に各チャンバ水没し、気泡や室内への水の浸入を探します。実験を開始する前に、任意の漏れをシールする。 </li><li>各室には、フローは25ガスラインのそれぞれを渡ってバランスをとられていることを確認するために、チャンバの後の行に500ミリリットル/分の流量計を接続します。これは、各チャンバが200ml /分の流れを受け取るように入力5 L /分の流れが均等に分散されることを確実にする。予想される流れを受けていない任意のチャンバーは、その流入および流出管は障害物がないかチェックしている必要があります。 </li><li> 100％酸素が流れているときに0.00％のイソフルランの読み取りを保証するために、エージェント·アナライザを較正する。 </li></ol> 3。インプラント温度トランスポンダー<ol><li>馴化の前に一週間、2％イソフルランで各マウスを麻酔。 </li><li>ベタジンと背側首エリアを殺菌。 </li><li>滅菌されたパッケージ化された注射器の針を用いて肩甲骨の間の温度トランスポンダ皮下に注射する。 </li><li>感染およびトランスポンダの移行のための毎日の注射部位を監視します。 </li></ol> 4。試験室に動物を慣らす<ol><li>四日間最初の評価の前に、100％の酸素を流しながら2時間、個々の室にすべてのマウスを置く。 </li><li>により新しい環境にストレスの交絡の影響を避けるために、事前評価に4日間毎日、手順4.1。 </li></ol> 5。あなたは麻酔感度に対する効果についてテストする薬理学的介入を行う<ol><li>この介入は、脳24、静脈内または腹腔内注射25、またはカニューレ26を介して特定の脳領域への薬物の送達の特定の部分に定位注入することがあります。 </li><li>これらの手順自体は、ナイーブ動物に比べて麻酔感度を変更する場合がありますので、適切な対照群は、ビヒクル注射と同様の手順を経る必要があります。 </li><li>あなたは、以下の手順6に示すように増加させること、および/または麻酔薬感受性の決定を減少段階的に行うことを計画している場合は薬理学的介入は、アクションの適切長い持続時間を持っていることを確認し、そうでない場合は、手順7に進みます。 </li></ol> 6。段階的なEC 50誘導の判定と創発を使用して麻酔感度を評価<ol><li> 100％の酸素が流れると、個々の室にそれぞれの動物を配置します。 </li><li> 15分間0.4％*にイソフルラン濃度を設定します。マウスは、その背中に配置されるまで、この期間の最後の2分の間に、そっとチャンバーを圧延することにより、各動物の正向反射を評価する。正向反射、マウスは、すべてを復元することがある場合に限り、無傷であると考えられている2分以内室の床に、その足の。 <ol><li> * 0.4％イソフルランをC57BL/6Jマウスにおけるsubhypnotic用量であることに注意してください。任意のマウスは、最初のステップで、その立ち直り反射を紛失した場合、初期投与量が大きすぎ、後続の日に減少させなければならない。 </li></ol></li><li>各マウスについて正向反射の状態を記録し、温度データのために、各マウスをスキャンします。テンプレートレコードを表1に示す。 </li><li> 15分間〜0.05％でイソフルラン濃度を増加させ、ステップ7.2を繰り返します。すべての動物が彼らの立ち直り反射を失ったまで、これを実行し続ける。 </li><li>オプション：すべての動物は彼らの立ち直り反射を取り戻しれるまで（ステップ6.3参照）を段階的にイソフルラン投与量を減少させるための同じ手順を繰り返します。 </li><li> 、実験を終了し、イソフルランをオフにして、15分間100％酸素で、システム全体をフラッシュする。マウスは彼らのホームケージに戻す前に回復し、experimeを保護しますので、これは低酸素症を防ぐことができますいずれの麻酔薬の曝露からNTER。 </li><li>オプション：動物や麻酔薬の濃度の数の数が原因で、リソースや時間の制約に制限されている場合には、カーブフィットパラメータ推定値、特にはヒル勾配-は過小評価、不当に低い誤差推定している。このような場合には、十分に真のヒル勾配のパラメータとそれに対応する誤差推定を得るために最大2つの追加の実験日に6.1から6.6に記載の手順麻酔感度測定を繰り返す必要があり得る。 </li></ol> 7。出現に時間とともに麻酔感度の短期変化を評価<ol><li> 100％の酸素が流れると、個々の室にそれぞれの動物を配置します。 </li><li>野生型C57BL/6Jマウス20用の誘導のED 99に対応して1.2％のイソフルラン濃度を設定します。急性介入の作用の予想される期間に応じて、30〜60分間維持する。 </li><li> LORRを確認で静かにマウスまで、各チャンバーを圧延することにより、全ての動物を背中に配置されます。 </li><li>イソフルランをオフにして、100％酸素を流す。各動物がその立ち直り反射を取り戻すまでの時間を測定します。これは、チャンバの床にすべての4つの足の配置によって定義され、無傷の立ち直り反射を有する3つの連続した​​試験の存在によって確認される。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

シングルマウスLORRの評価は、一見単純な作業ですが、それは動物の群から信頼性の高いデータを収集するために、対象者との間で同一の生理学的条件を維持するためにもかかわらず、必要不可欠である。ここで紹介する厳密に調整、大容量のLORR装置は、実験を標準化し、効率を最大化する方法を提供しています。体温調節と同等の流量分布の基本的な教義に従うことによって、このシステムは、簡単に再作成し、個々の実験者のニーズに合わせてカスタマイズすることができます。チャンバサイズは、例えば、ラットなどの他の種のためにスケーリングすることができる、追加チャンバは、流入し、真空にさらに分岐点を付加することによって対応することができる。すべての被験者は、結果の二次的事後確認のためにビデオ記録実験することを可能にする透明アクリルチャンバーを通して簡単に見ることができます。アクリルはまた、温度を監視するために使用することができる無線周波数遠隔測定システムと互換性があるTURE、血圧、および生体電位。 私たちは、薬理学的介入、次の麻酔薬感受性を評価するための2種類の方法を提示する。両方の出現と段階的に誘導試験に時間が立...

全身麻酔薬は、薬のような多様なクラスがすべて単数形エンドポイントが分かりにくいままで誘発することができる方法についての種の多種多様な、まだ説明で催眠の可逆的な状態を引き起こす能力によって定義されています。理論の数は、催眠、1,2の基礎としての一般的なメンブレンの混乱を示唆した麻酔薬の効力および脂溶性の間マイヤー·オーバートン相関、で始まる、年間で断定されています。より最近の証拠は、神経細胞のシグナル伝達に影響を与えるタンパク質標的は麻酔効果に寄与することを示唆している。マウスが原因マウスおよびヒトの麻酔応答間の相同性のこれらの理論を探索するのに不可欠なモデルであることが証明されている。マウスは全身麻酔下で主観的な意識について質問することができませんが、ある種の原始反射はげっ歯類の催眠の有用な代理尺度として役立つ。出産後の最初の数日で、マウスは反射的復原RESPを開発受動的に仰臥位3に配置されるのを防ぎますオンセ。マウスは、その立ち直り反射を失うれる麻酔の投与量は、人間の催眠用量4とよく相関する。 正向反射（LORR）の損失の評価は、マウスにおける麻酔薬の感度をテストするだけでなく、ラット、モルモット、ウサギ、フェレット、ヒツジ、犬5-8を含む他の種の様々な広く使用されている実験室の標準となっている。 LORRの種のメンバーのために行うために、所与の麻酔剤の用量は非常に一貫しているが、それは環境因子によって有意にシフトさせることができる。例えば、睡眠不足のラットは、高い有酸素容量の揮発性および静脈麻酔薬9およびラットの両方に対してより敏感であるイソフルラン10にあまり敏感である。低体温はまた、11〜14種の大スペクトルにおいて催眠ために必要な多数の麻酔薬の投与量を減少させることが示されている。順番に確実にLORR実験動物の群において発生する麻酔薬の投与量を同定するために、評価環境は注意深く、応力を最小限euthermiaを維持し、全ての被験者への薬剤の等量を送達するように制御することが重要である。驚くことではないが、遺伝的因子もまた麻酔15-18感度を変えることが知られている。そのため、慎重に検討し、また遺伝的背景19をコントロールに与えられるべきである。 我々は一定の37°Cの環境を維持しながら、24匹のマウスのそれぞれに同一の気体の麻酔薬の配信を保証する装置を開発した。エクスポージャー室の透明の円筒形デザインは、高速LORR評価と遠隔測定生理学的測定を容易に統合することができます。このシステムは、正確に、野生型マウス20で出現にイソフルラン、ハロタン、セボフルラン及び誘導EC 50および時間を測定することが示されている。また、使用している遺伝的変異を持つマウスでは麻酔薬の感度の変化を観察し、21〜23視床下部の病変を対象とするこのシステム。ここでは、麻酔薬の感度が私達の制御された環境装置を用いて、薬理学的介入の後に評価することができる2つの方法について説明します。揮発性麻酔導入及び出現感度の定常状態の表現型は、8〜10時間を必要とし、結果的に最高の​​慢性または長時間作用薬理学的介入のような実験条件が変化しないような研究のために調整されています。しかし、その効果が時間の経過とともに大幅に放散する短時間作用型の治療のために我々はまた、定位的に標的とするマイクロインジェクションまたは大幅に麻酔薬の出現に影響を​​静脈内薬物処置後立ち直り反射の変化を評価するための簡単​​な手順を紹介します。これらの試験は、首題の任意の数に適合させることができるこの制御された環境システムのための潜在的な用途の小さなサブセットを表す様々な種のクトは、吸入治療のいずれかのタイプを受信する。

<table><tbody><tr><td>試薬</td><td>の名前 会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>酸素</td><td>空気ガス</td><td>OX300</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>バトラー シャイン</td><td></td><td>関心のある任意の揮発性麻酔薬を代用することができます</td></tr><tr><td>材料の名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>質量流量計- 10 SLPM</td><td>オメガエンジニアリング</td><td>FMA-A2309</td><td></td></tr><tr><td>質量流量計-500 SCCM</td><td>オメガエンジニアリング</td><td>FMA-A2305</td><td></td></tr><tr><td>麻酔薬アナライザー/ガスインジケーター</td><td>AM ビックフォード</td><td>FI-21 理研</td><td></td></tr><tr><td>加熱ウォーターポンプ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-874-175</td><td></td></tr><tr><td>温度トランスポンダー</td><td>BMDS</td><td>IPTT-300</td><td></td></tr><tr><td>RF温度リーダー</td><td>BMDS</td><td>DAS-6007</td><td></td></tr></tbody></table>

局所または全身薬理学的介入後のマウスの揮発性全身麻酔の感度変化を評価する

Assessing Changes in Volatile General Anesthetic Sensitivity of Mice after Local or Systemic Pharmacological Intervention

全身麻酔の一つの望ましいエンドポイントはまた、催眠として知られ、無意識の状態です。動物で催眠状態を定義すると、それは人間の患者には投与しないほど簡単です。げっ歯類での催眠のための広く使用されている行動の代用には反射（ロア）、あるいは動物がもはや背側横臥位の脆弱性を回避するために、自分の生来の本能に応答する点を立ち直りの損失である。我々は慎重に、温度変動を含むとガスの流れを変える可能性のある交絡のために制御しながら、同時に24匹のマウスでLORRを評価するシステムを開発した。これらのチャンバは、固定麻酔曝露後の立ち直り反射（RORR）を返すために、待ち時間によって測定された麻酔薬感受性の信頼性の評価を可能にする。代替的に、麻酔薬濃度を段階的に増加する（または減少）を用いて、チャンバはまた、誘導（又は発生）に集団の感受性の決定を可能にすることによって測定されるようEC 50およびヒル勾配。最後に、ここで説明する制御された環境チャンバーは他の薬物、毒物学研究、及びバイタルサインの同時リアルタイムモニタリングの吸入送達を含む代替的な用途、様々に適合させることができる。

図1に、薬理学的介入の長期的影響を決定するための段階的なLORRアッセイの有用性を実証している。イボテン酸（IBA）は、多くの場合、永久的な神経損傷を引き起こす興奮毒として使用されるグルタミン酸N-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体のアゴニストである。ここでは、試験前に両側性C57BL/6Jマウスの腹外側視索前野（VLPO）1週に1％のIBAの10 ​​NLを注入された。この核のニューロンの大多数は、覚醒中に発火の低料金を示し、特に非急速眼球運動睡眠、レム睡眠、そして全身麻酔23,27-29の催眠用量への曝露との間にその活性を増加させる。 VLPOで成功した病変はイソフルラン誘発性催眠に対する抵抗性を引き起こす必要があります。イソフルランの各増加レベルでは、立ち直り反射を失ったマウスの割合は、対数10スケールの麻酔薬濃度に対してプロットした。データマウスの各群（ビヒクルを注射し、注射したIBA）、次いでシグモイド用量反応曲線に適合させた。このアッセイは、常に直立すべての動物で始まり、常に正向反射を失ったすべての動物で終わっているので、下部と上部の定...

立ち直り反射の消失は、長い実験動物でも催眠呼ばれる、意識不明のための標準的な行動の代理を務めています。薬理学的介入によって引き起こされる揮発性麻酔薬感受性における変化は、任意の吸入治療剤の送達のために適合させることができる注意深く制御されたハイスループット評価システムを用いて検出することができる。

One desirable endpoint of general anesthesia is  the state of unconsciousness, also known as hypnosis. Defining the hypnotic state in animals is  less ...

本手順の全体的な目的は、薬理学的介入後の麻酔感受性の変化を評価することです。まず、ガス流と温度が均一であることを確認するために、曝露チャンバーを慎重に点検します。次に、動物をチャンバーに慣れさせます。次に、目的の薬理学的介入を行います。最後のステップは、麻酔剤への曝露に対する動物の書字反射を評価し、麻酔感度の変化を判定することです。最終的に、書起反射アッセイを用いて、持続時間の長いまたは短い薬理学的介入によって生じる麻酔感度の違いを示します。このシステムはマウスにおける麻酔感受性の変化に関する知見を得るために有用ですが、さまざまな種に適用して、あらゆる吸入療法の効果を研究することにも利用できます。試験装置は、長さ10センチメートル、直径5センチメートルの透明アクリル製円筒状チャンバー24個で構成されています。このサイズは、一般的な体重25グラムの成マウスに適しています。各チャンバーの両端には、ガスの導入および排出用のポートがあります。排出側端は、取り外しを容易にするためにゴムガスケットで密封されています。動物を挿入させる際は、各チャンバーをウォーターバス内に設置するラックに取り付けてください。チャンバーの下部のみが浸かるようにラックを配置します。チャンバー後端のサポートが安定性を高めてチャンバーを水平に保持し、各チャンバーがバスに均等に接触するようにします。酸素タンクをポリエチレンチューブで気化器と流量計に接続した後、チューブを等長で小径の抵抗器25本に分岐させます。これにより、接続時に各チャンバーへ均等な流量が供給されるようになります。次に、ガス入口とは反対側の各チャンバーから出ている真空ラインを接続します。真空ラインはマニホールドでまとめられ、施設内の吸引ラインに接続されます。メイン真空ラインに沿ったポップオフバルブにより、各チャンバー内の大気圧条件が確保されます。すべての接続が完了したら、各チャンバーの底部に完全に接触するまで、バスに十分な水を満たします。ポンプを始動して水を循環させ、37 °Cの一定温度を維持します。試験を開始する前に、チャンバーに漏れがないか、および気流が適切であるかを確認します。まず、酸素の流量を 5 liters per minute に設定します。各チャンバーを水に浸し、気泡の発生または水の浸入がないかを確認してください。どちらの場合も漏れがあることを示しています。実験を開始する前に、漏れがあるチャンバーはすべて交換してください。各チャンバーについて、流量が各ラインで均一であることを確認するため、チャンバーの直前に500 milliliter per minuteの流量計をインラインで接続します。想定される流量が得られないチャンバーがある場合は、チューブに閉塞がないか確認してください。最後に、馴化の1週間前に、100% oxygenを流した際にフッ素の読み取り値が0.0%になるよう、エージェントアナライザーを校正します。試験中の体温を追跡するため、トランスポンダーを植え込みます。適切な麻酔深度に達した後、首の背面領域をベタジンで滅菌します。次に、滅菌針を用いて、肩甲骨の間に温度トランスポンダーを皮下注入します。注入部位を毎日観察し、感染やトランスポンダーの移動がないかを確認してください。最初の評価の4日前、すべての試験動物をチャンバーに慣れさせ、新しい環境によるストレスの影響を軽減させます。これを行うには、100%酸素を流した各チャンバーに動物を入れ、2時間放置します。この曝露を試験日まで毎日繰り返します。4日間の馴化後、試験当日は目的の薬理学的介入への曝露から開始します。この介入は、薬理学的介入の場合、特定の脳領域への定位注入、静脈内注射、または腹腔内投与である可能性があります。作用時間が長い場合は、麻酔感受性の段階的な判定が行われます。すべての動物の配置が完了したら、各動物を100% oxygenが流れる個別のチャンバーに入れてテストを開始します。イソフルラン濃度を0.4%に設定し、15分間保持します。この期間の最後の2分間に、チャンバーをゆっくりと回転させてマウスを仰向けにし、各個体の右転反射（righting reflex）を確認します。マウスがすべての肢をチャンバーの底面に戻すことができれば、右転反射は保持されていると判断します。2分以内に、各マウスの右反射の状態を記録し、各マウスの温度データをスキャンします。次に、イソフルラン濃度を約0.05%上昇させて15分間保持し、前述の方法で右反射を評価します。すべての動物が右反射を消失するまで、麻酔薬の濃度を上げ続けます。必要に応じて、麻酔薬の濃度を段階的に下げながら段階的な書字反射評価を繰り返すことで、麻酔からの覚醒を測定できます。実験を終了するには、イソフルランを停止し、投与期間が短い介入の場合は100%酸素でシステム全体を15分間フラッシュします。その後、覚醒までの時間を測定します。各動物を100%酸素が流れる個別のチャンバーに入れ、イソフルラン濃度を1.2%に設定します。数分間麻酔に曝露させた後、各マウスが仰向けの状態になるまで、各チャンバーをゆっくりと回転させます。右 refleks（正位反射）の消失を確認し、急性介入の想定作用時間に応じて、イソフルラン濃度を1.2%で30分から1時間維持します。イソフルランの供給を停止して100%酸素に切り替え、各動物の4肢すべてが床に着くまでの時間を測定します。動物が4本の足すべてを床に置く動作を3回連続で行えたとき、ライティングリフレックス（writing reflex）は正常であると判断されます。本実験では、腹外側視索前核にイボテン酸を注入してから1週間後に、ライティングリフレックスの検査を行いました。この脳領域に病変が生じると、麻酔感受性が低下すると予測されていました。しかし、導入および覚醒のいずれにおいても、段階的な麻酔感受性に有意な差は認められませんでした。この例では、両側のI botanic acid微量注入の直後に覚醒時間試験を実施しました。VLPOに注入した場合、近接する内側中隔への注入および溶媒注入コントロールと比較して、催眠状態が著しく延長しました。このビデオを視聴することで、すべての動物に同一のガス流量と温度を適用しながら、段階的導入法または覚醒時間測定法を用いて麻酔感受性を評価する方法について、十分に理解することができます。

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Medicine

医学

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