4D共焦点タイムラプスイメージングを、次のサンプルのドリフト補正

TimeLapse Microscopyは、この画像上で発生するサンプルの開発成長またはドリフトのプロセスを視覚化することができます。取得により、細胞の動きを追跡または追跡することができなくなる可能性があります。これは、次のプロトコルです。オープンソースの画像処理ソフトウェアを使用して、時間の経過に伴う3次元のドリフトを補正します。

異なる焦点面で一連の光学切片をキャプチャすることで、サンプルの3次元モデルを生成できます。これは、タイムラプスシリーズの3Dデータセットを作成することで、4次元に拡張できます。長期のタイムラプス実験では、サンプルの動きを観察するのが一般的です。

これは、ハードウェア制御ステージのスライド精度と焦点位置によって引き起こされる可能性がありますが、他の場合では、サンプルの成長または封入媒体内の柔軟性によって引き起こされる動きの結果としてのドリフターが、ハードウェアフォーカシングシステムの多くの改善と封入媒体の剛性の向上により、これらの動きを制限するために存在します。しかし、これらのアプローチは、サンプルの維持と成長を補正するための適切な条件を提供するために必要なイメージングセットアップのため、多くの場合に適用できません。サンプルドリフトについては、フィジーのオープンソースイメージング処理プラットフォームを活用するためのプラグインを開発しました。

当社の正しい3Dドリフトプラグインは、マルチチャネル実験の3次元タイムラプス実験で役割またはサンプルドリフトとして発生する動きを補正するための位相相関登録を形成することができます。正しい3Dドリフトプラグインは、1つのチャネルを使用して必要な補正を決定します。この補正は、追加のチャネルに適用され、4つのDデータセットが登録されます。

オープンソースの無料Webパッケージ。フィジーは、Image Jプログラムのディストリビューションフォークであり、顕微鏡実験から収集されたデータに対して多数のプロセスを実行するためのプラグインがプリインストールされています。フィジーは、より簡単なプラグインアーキテクチャを提供し、デフォルトのインストールに含まれています。

正しい3つのEGプラグインのコピーで、インストールが完了したときにこの分析に使用します。フィジーは、膨大な数の独自の顕微鏡画像形式のインポートをサポートしています。これは、ドラッグアンドドロップまたはユーザーであるオープン顕微鏡環境を通じて実現できます。

バイオフォーマットインポートプラグイン。データ・セットがシステムにインストールされているメモリーのサイズを超えている場合は、イメージ・ファイルを仮想スタックおよびメモリー管理オプションとして開きます。この分析で使用するデータセットは、ACTAのGFPトランスジェニックゼブラフィッシュの3次元時系列実験から生成されました。この実験では、GFPが骨格筋に発現しています。

核を視覚化するために、このトランスジェニックラインにMチェリーを局在する核を注入して、これらのFluorフロアをよりよく表現し、カラーチャネルツールの下でこれらの各チャネルのルックアップテーブルを変更することができます。収集された時系列の過程で、ジッパーフィッシュのサンプルが視野内を漂っているように見えます。彼女はこのドリフトを修正し、フィジーにインストールされているプラグインの登録サブメニューで正しい3Dドリフトプラグインを開きました。

サンプル内で広く発現している、または画像取得中の市場イベントに関与していないセラーマーカーは、ドリフト補正の最適なソースを提供します。この例では、ACTA 1、チャネル1のGFP蛍光。システムのメモリが限られている場合は、仮想スタック オプションを選択し、Correct 3D drift プラグインの実行を許可します。

修正されたデータセットは、元のデータセットよりもキャンバス サイズが大きくなります。サンプルの動きに対応します。光学セクションの最大の投影画像を生成すると、補正されたサンプルから除去されたドリフトの比較が可能になります。

最大強度の Projection は、データセットからディメンションを削除しますが、ドリフト補正の結果をすばやく調べるための便利なアプローチです。ここでは、修正されたデータセットと修正されていないデータセットの各タイポイントの最大投影画像が表示されます。このタイムラプス実験を1枚の画像として投影すると、短時間のタイムラプス実験でも起こりうるドリフトの量が明らかになります。

サンプルの1つのチャンネルのドリフトを登録して行われた補正は、この画像スタックに含まれる他のすべてのチャンネルにも適用されます。システムのメモリが制限されている場合のドリフト補正の手順は、若干変更されています。購入形式、インポートメニュー、および正しい3Dドリフトプラグインのポップアップメニューの両方で、使用された仮想スタックオプションを選択します。

このオプションを選択すると、プラグインがタイムラプス実験のチャンネルスライスと時点ごとに個々の画像ファイルをエクスポートできる場所を選択するように求められます。生成された仮想スタックには、前の例と同じドリフト補正が含まれています。選択した保存場所を開くと、生成された個々の画像シーケンスファイルが表示されます。

このファイルのコレクションを開くには、画像シーケンスのインポート ツールを使用します。結果のファイルは、チャネル、光学セクション、または時点を分離しません。これらの機能を視覚化するには、ログファイルのデータを使用してスタックをハイパースタックに変換し、チャネル数、光学スライス、および収集されたタイポイントを入力します。ルックアップテーブルを再度変更して、タイムラプス実験の表示色を調整できます。

このプロトコルは、単一の時点のキャプチャ内で発生するドリフトを、このプロトコルでは修正できない時点間で発生するドリフトを修正します。画像取得に使用するパラメータを使用して、キャプチャする各時点にかかる時間を短縮することをお勧めします。後処理ソフトウェアでドリフトを補正する機能により、サンプルのドリフトによるスキルである細胞の動きを分析および測定できます。