の自動分離 C.虫可変細菌性病原体の植民地

次の実験の全体的な目標は、シーエレガンスにおける自然免疫応答の開始に対するコロニー形成の寄与とそれに関連する損傷を評価することです。これは、若年成人の海の優雅さの同期した集団を、緑色蛍光タンパク質またはGFPを発現するシュードモナス・アローザにさらすことによって達成されます。これにより、病原体によってさまざまなコロニーを持つワームの集団が生成されます。異なる方法で洗浄した後、コロニー化されたワームの集団は、完全にコロニー化されたワームと非コロニー化されたワームの2つの極端に焦点を当てた純粋な集団に分離されます。

次に、これらの集団からRNAを抽出し、免疫遺伝子の発現を非病原性大腸菌で増殖した線虫と比較して評価します。免疫応答とコロニー形成との関係を調べるために、p arosaに対するsea eleganceの自然免疫応答が病原体のコロニー形成から切り離すことができることを示す結果が得られます。この手法が、シーエレガンスにおける免疫応答の開始を研究するための他のアプローチよりも優れている点は、温暖な集団における感染の変動性に対処し、感染プロセスのさまざまな側面を解明できることです。

この方法は、自然免疫応答の開始の基礎は何かなど、海の優雅さ、自然免疫の主要な質問に、高スループットの方法で答えるのに役立ちます。さまざまな遺伝子操作や環境操作が、病原体のコロニー形成に抵抗する能力にどのような影響を与えますか?多くの線虫が墓の段階に達するまで、大腸菌細菌を播種したいくつかの線虫、成長培地、またはNGMプレートで線虫を育て始める。

次に、墓動物を卵調製液で処理して、同期培養を行います。次のプレート。数枚の60mmNGMプレートに載せた卵に、1プレートあたり約150〜200個の卵の密度でバクテリアを播種しました。

数千匹のワームを入手するには、最低でも15〜20枚のプレートが必要になります。選別実験では、より多くの線虫が必要な場合は、プレートあたりの卵数が多い大径のプレートを使用してスケールアップする必要があります。プレートを摂氏20度で2日間インキュベートし、線虫がL4または若年成人期に達するまで

卵調製の翌日に、POSA培養物、PA 14 GFPを発現するA GFPを、抗生物質を含む2ミリリットルのキングスB.Mediumに接種します。培養物を摂氏37度で一晩攪拌しながらインキュベートします。翌日、PA 14 GFP培養物を、各150 mmシャーレでのアッセイに必要な数のスローキリングプレートにプレートします。

飽和培養物の75〜100マイクロリットルをピペットでつなぎ、均一に広げます。滅菌ガラススプレッダーを使用して、プレートを摂氏37度で20〜24時間インキュベートします。PA 14 GFP入りプレートをインキュベーターから取り出し、室温まで冷まします。

一方、NGMプレートで増殖した線虫を回収するには、プレートを覆うのに十分な量のM nineバッファーを少量加えます。プレートを静かに渦巻き、液体を15ミリリットルの円錐管に移します。ワームを底に沈殿させ、余分な液体を取り除いてから、ワームをPA 14 GFPプレートに移す 最小限の液体では、150ミリメートルプレートを使用すると、1枚のプレートに数百匹のワームを配置できます。

プレートを摂氏25度で18〜21時間インキュベートし、p arosaに曝露した若年成人虫を探します。これは、コロニー化された動物とコロニー化されていない動物の最適な分布を表示する時間枠であり、サンプルの分類を実行する前に、マシンが適切に機能していることを確認します。ここでは基本的な手順を概説し、詳細はオンラインで入手できます。

シースバルブの圧力を約5PSIに設定して、シース液の流量が適切であることを確認します。ディスペンサーの下に15ミリリットルの円錐形チューブを置きます。シースバルブをオンにし、ソーターバルブをオフにします。

チューブをディスペンサーの下に60秒間保持します。チューブ内の容量は9〜10ミリリットルである必要があります。この範囲外の場合。

それに応じてシースバルブの圧力を調整して、シース液の流量が正確な選別を可能にするようにします。最初にシースバルブをオフにして、ソート速度をテストします。次に、約25ミリリットルの制御粒子溶液をリザーバーに加えます。

シースバルブとサンプルをオンにしますampコンピュータソフトウェアでバルブ。制御パーティクル モードに移動し、[取得] をクリックします。粒子の流量が毎秒約5〜8個の粒子であり、飛行時間が40マイクロメートルの粒子の幅に近似

これにより、一度に 1 つの 40 ミクロンのオブジェクトのみが通過することが保証されます。値がこの範囲外の場合は、それに応じて設定を調整してください。M nineバッファーを使用して、ワームを15ミリリットルの円錐管に洗浄し、成虫が重力によってチューブの底に沈み、上清を取り除きます。

チューブに新しいM nineバッファーを充填します。このプロセスを3〜4回繰り返します。これにより、幼虫の大部分と余分なバクテリアが除去され、約10分かかります。

穏やかに混合する小さな攪拌子を含むウォームソーターリザーバーにワームを追加します。緑の光電子増倍管を600に、赤と黄色の光電子増倍管を200に設定して、初期信号ゲインを調整します。データの取得を開始して、設定を調整します。

毎秒 25 から 30 イベントまたはワームのソート速度を目指します。数率が高すぎる場合は、リザーバー内のワームをM nineで希釈します。それに応じてバッファリングします。

レートが低すぎる場合は、少量のM nineでさらにワームを追加します。実験でコロニー形成された線虫と非定着線虫の非常に厳密な分離が必要な場合は、一致チェックを純粋に設定します。これにより、2つの物体が互いに近すぎる場合、または同じ液滴内で発生した場合、マシンは液滴を拒否します。

関心のある母集団を分類するために収集するのではなく、サイズと蛍光強度を示す軸の周りにゲートを描きます。蛍光ゲーティングの値は、経験的に決定する必要があります。次に、マルチウェルプレートまたはシャーレをディスペンサーの下に置き、ワームを収集します。

次に、ソートバルブを開いてワームの選別を開始します。動物の小さな集団を収集して、顕微鏡で、選別された集団が対象の集団であることを確認します。そうでない場合は、それに応じてゲートパラメータを調整し、サンプル収集を続行します。

年齢が一致した場合、GFPに曝露された遺伝的に同一の海の優雅さは、ポサを発現し、コロニー形成のレベルが広く分布し、コロニー形成されていないワームとコロニー化されたワームの効率的な分離が、ワームソーターを使用して達成されました。コロニーを形成していないワームとは異なり、コロニーを形成したワームは、だるさや排便を減らすなどの明白な兆候を示します。後者は、P arosaによってコロニーを形成した線虫が感染をクリアするのが難しい理由である可能性があります。

4つの遺伝子は、線虫のコロニー形成状態に関係なく、P arosa曝露と同様に誘導され、定量的R-T-P-C-Rを使用して遺伝子の発現を測定しました。この4つの遺伝子は、CLイーガンの免疫応答の一部であることが知られています。Lys 2は、リゾチームをコードする2つの特徴のない遺伝子は、感染に特異的に応答し、そのうちの1つは感染抵抗性にも寄与し、PGP 5は感染および重金属ストレスに応答します。

この結果は、以前に発表された結果を裏付けており、コロニー形成とそれに伴う損傷は免疫応答に必要ではないことを示しています。それどころか、病原体に関連する分子パターンをシグナルデータとして指摘し、PGP 5がコロニーを形成していない動物で誘導されることを示しています。これは、経験していないと予想されています。甚大な被害は、調節プログラムが重複していることを示唆しており、シーエレガンスにおける免疫反応と一般的なストレス反応を制御しています。

この方法は、シーエレガンスにおける免疫応答の開始に関する新たな洞察を提供するだけでなく、環境条件や遺伝子操作がコロニー形成に及ぼす影響や、感染プロセス以外の異なる病原体間の競争など、他の問題にも適用できる可能性があります。この方法は、代謝物や化学物質の摂取や隔離など、ワームと環境との他の相互作用を追跡するためにも適用できます。この手順に従うと、選別された目的の集団は、遺伝子発現以外のさまざまな目的に使用できます。

これには、その後の感染や生存アッセイ、行動実験のための生きた動物の収集が含まれます。この手法は、病原体への曝露とコロニー形成が自然免疫と海の優雅さに及ぼす影響を研究するための有用な手段を提供します。