Name: の自動分離 C.虫可変細菌性病原体の植民地 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: 学ぼう、ワームソーターを用いてGFP発現緑膿菌に感染したCaenorhabditis elegansを分離し、病原体定着と免疫応答の関係を解析する方法。この技術は感染の個体差を解明し、自然免疫の初期応答メカニズムを高スループットで研究するのに有用です。

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著者は、彼らのサポートのためにエリソン医療財団に感謝します。私たちは、wormsorterを使用しての支援のためのアビーデルンブルク研究室のメンバーに感謝したいとも。

1。ヤングアダルト動物の同期化された文化の取得<ol><li> OP50-1 E.を接種し、いくつかのNGMプレート上でワームを育てる大腸菌の細菌（10×飽和文化からの濃縮）、多くのワームは、妊娠の段階に達するまで。 </li><li>同期された培養物（卵）を得るために卵プレップ液で妊娠動物を扱う。 </li><li>いくつかの60 mmのNGMプレート上のプレートの卵は、およそ150〜200の卵/プレートの密度で10倍に濃縮OP50-1を播種。 </li><li> （ - ヤングアダルト段階ワームは、L4に達するまで）2日間、25℃で培養する。 </li></ol> 2。 緑膿菌版の作製やワームに感染<ol><li>卵プレップ（ステップ1.1）の日に100μg/ mlの最終濃度王のB型メディアを含むリファンピシンの2ミリリットルにPA14 :: GFPの培養物に接種。攪拌O / Nで37℃で培養液を、 </li><li> PA14 :: GFP CULプレートアッセイに必要な数のスローキリングプレート（SKP）にTURE。各150ミリメートルSKPペトリ皿ピペットに75〜100飽和文化μlの滅菌ガラススプレッダーを使用して均一に広げる。 20〜24時間、37℃で培養する。 </li><li>インキュベーターからプレートを取り外し、それらを室温（〜20分）に冷却する。 M9緩衝液を使用して、PA14にステップ1.4からワームを洗っ:: GFPプレートを液体の最小容量の。 150mmプレートを使用する場合は、数百のワームは、単一のプレート上に配置することができる。 </li><li> 18〜21時間、25℃で培養する。 Pの緑膿菌に露出し、若い成虫は、これはnoncolonized動物VSコロニー形成の最適な分布を表示時間ウィンドウです。 </li></ol> 3。 Wormsorterの設定 サンプルの並べ替えを実行する前に、マシンが正常に機能していることを確認してください。詳細はhttp://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43で得られた、と目することができますE基本的な手順は以下のとおりです。 <ol><li>約5 PSI（4.5〜5.5の範囲）にシースバルブの圧力設定を行ってください。 </li><li>そのシース流体流量が適切であることを確認ディスペンサーの下に15ミリリットルコニカルチューブを配置し、シースバルブをオンにし、ソーターバルブをオフにします。 60秒間、ディスペンサーの下にチューブを保持します。チューブ内のボリューム9-10 mlでなければならない。この範囲外である場合、それに応じてシース弁圧を調節する。 </li><li> （ステップ3.2と同様に設定）がシース液流量が正確な選別を可能にする確実40μmで調整粒子を使用してソート速度をテストする</li><li>シースバルブをオフにします。貯水池への制御粒子溶液約25ミリリットルを追加します。 </li><li>シースバルブ、サンプルバルブをオンにします。 </li><li>コンピュータソフトウェア上で、「制御粒子モード」に移動して取得]をクリックします。 </li><li>幅を近似するTOF（飛行時間）で、粒子流量は〜5-8粒子/秒であることを確認してください粒子の、40ミクロ​​ン。このようなTOFは、単一の40ミクロ​​ンのオブジェクトを一度に通過していることを示しています。値がこの範囲外である場合は、それに応じて（上記の指示に従う）設定を調整します。 </li></ol> 4。 Noncolonizedワーム対植民仕分け<ol><li> M9を使用して、15 mlのコニカルチューブにワームを洗う。成虫は、重力によって、チューブの底に沈む、上清を除去することができます。新鮮なM9でチューブを埋める。このプロセスを3〜4倍を繰り返します。これは幼虫の大部分だけでなく、余分な細菌を除去し、約10分かかります。 </li><li>優しく混合小さな攪拌棒付きwormsorterリザーバーにワームを追加します。 </li><li> 200に600にグリーンPMTを設定し、赤と黄色の光電子増倍管によって初期信号ゲインを調整します。 </li><li>設定を調整するためのデータの収集を開始。 </li><li>毎秒25〜30イベント（ワーム）のソート率を目指す。数字率が高すぎる場合、それに応じてM9と、リザーバ内のワームを希釈する。レートがある場合x低、M9の小さな体積でより多くのワームを追加します。 </li><li>実験はnoncolonizedワームVSコロニー形成の非常に厳しい分離を必要とする場合は、「純粋な」から「一致確認」に設定します。これは、イベント内の2つのオブジェクトが互いに接近しすぎ発生した場合、または同じドロップで、機械ではなく、それを集めるよりも、ドロップを拒否していることを保証します。 </li><li>関心の人口をソートするには、サイズ（成虫を得るために）と蛍光強度（noncolonizedのための低、コロニー形成のためのすなわち高い）を示す軸周りのゲートを描きます。蛍光ゲーの値は経験的に決定されなければならない。 </li><li>ワームの並べ替えを開始するためにソート弁を開放してワームを収集するために、マルチウェルプレートまたはディスペンサーの下にペトリ皿を置きます。 </li><li>ソートされた集団は、関心の集団であることを顕微​​鏡下で確認するために、動物の小集団を収集します。いない場合は、それに応じてゲーティングパラメータを調整し、サンプル収集を続行します。 </li></ol>

<ol><li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+analysis%2C+sorting%2C+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Mol. Biol. , 275-286 (2006).</li>
<li>Dupuy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+analysis+of+in+vivo+spatiotemporal+promoteractivity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome-scale analysis of in vivo spatiotemporal promoteractivity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Biotechnol. 25, 663-668 (2007).</li>
<li>Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+Automated+High-throughput+Genome-wide+RNAi+Screens+in+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in elegans.</a> J. Vis. Exp. (60), (2012).</li>
<li>Doitsidou, M., Flames, N., Lee, A. C., Boyanov, A., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+for+mutants+affecting+dopaminergic-neuron+specification+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated screening for mutants affecting dopaminergic-neuron specification in C. elegans.</a> Nat. Methods. 5, 869-872 (2008).</li>
<li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).</li>
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<li>Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance%2C+danger%2C+and+the+extended+family%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tolerance, danger, and the extended family.</a> Annu. Rev. Immunol. 12, 991-1045 (1994).</li>
<li>Mariathasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopyrin+activates+the+inflammasome+in+response+to+toxins+and+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP.</a> Nature. 440, 228-232 (2006).</li>
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<li>Tenor, J. L., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+Toll-like+receptor+is+required+for+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">A conserved Toll-like receptor is required for Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> EMBO Rep. 9, 103-109 (2008).</li>
<li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reverse+genetic+analysis+of+components+of+the+Toll+signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A reverse genetic analysis of components of the Toll signaling pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Curr. Biol. 11, 809-821 (2001).</li>
<li>McEwan, D. L., Kirienko, N. V., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+translational+inhibition+by+Pseudomonas+aeruginosa+Exotoxin+A+Triggers+an+immune+response+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Host translational inhibition by Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A Triggers an immune response in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Host Microbe. 11, 364-374 (2012).</li>
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<li>Irazoqui, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+pathogenesis+and+host+responses+during+infection+of+C.+elegans+by+P.+aeruginosa+and+S.+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus.</a> PLoS Pathog. 6, (2010).</li>
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<li>Shapira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+role+for+a+GATA+transcription+factor+in+regulating+epithelial+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A conserved role for a GATA transcription factor in regulating epithelial innate immune responses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14086-14091 (2006).</li>
<li>Troemel, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p38+MAPK+regulates+expression+of+immune+response+genes+and+contributes+to+longevity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans.</a> PLoS Genet. , 183 (2006).</li>
<li>Twumasi-Boateng, K., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+immune+responses+from+pathogen+colonization+supports+pattern+recognition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dissociation of immune responses from pathogen colonization supports pattern recognition in C. elegans.</a> PLoS One. , 7 (2012).</li>
<li>Jakobsen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alkaloid+compound+harmane+increases+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans+during+bacterial+infection%2C+by+modulating+the+nematode%27s+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The alkaloid compound harmane increases the lifespan of Caenorhabditis elegans during bacterial infection, by modulating the nematode's innate immune response.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+intestinal+bacterial+proliferation+in+regulation+of+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Microbiol. 12, 49 (2012).</li>
<li>Troemel, E. R., Felix, M. A., Whiteman, N. K., Barriere, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsporidia+are+natural+intracellular+parasites+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 6, 2736-2752 (2008).</li>
<li>Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+with+soil+bacteria+enhances+p38-dependent+infection+resistance+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans.</a> Infect. Immun. 18, 514-520 (2013).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

我々が説明する方法は、ワームとその環境の間の相互作用に従うこと、ワームの外実体の蛍光標識を利用しています。我々はこの場合、分離は、病原体のラベリングに基づいていたなし（または光）負荷のものとは重い病原体負荷でワームを分離するために用いられた。その後の遺伝子発現分析は、それらが病原体負荷とは無関係であったことを示唆している二つのグループの間の免疫応答において差は認められなかった。応答を開始する信号は、物理的に、この信号は、PAMPであり得ることを示唆し、むしろ分泌されるのではなく、細菌と関連していることが他の場所で示された。まとめると、これらの結果は、PAMP認識がC.免疫応答を開始する役割を果たしているという仮説を支持虫 19。 上述の選別プロトコルの一つの利点は、両方のコロニー形成及びnoncolonizedワームは、単一集団から単離されることである。目あるnoncolonized対植民地化された動物の最適配分と人口を持つに依存します。発明者らは、Pでヤングアダルト、野生型ワームに感染するとき緑膿...

自動ワームのソートは、それがチューブ内に真っ直ぐに通過すると（通常はレポータータンパク質のトランスジェニック発現によって提供される）ワームに蛍光シグナルを測定することにより、オペレーティング·リダイレクション、コレクションチューブに/ウェルまたは廃棄物容器に応じてできるように、多くのFACSのようなものです研究者1が設定したパラメータをゲーティングする。 wormsorterは、多くの方法で研究を容易にすることができる。分析ツールとして、それを採用した例はほとんど千の遺伝子2プロモーター活性の時空間パターンを踏襲研究である。 しかしながら、wormsorterの主な用途は、標的遺伝子発現レベル又はウォーム3-5の軸に沿った蛍光タンパク質の局在化に続いて、遺伝子スクリーニングである。 ここでは、蛍光タグ付けされた病原体によるワームの定着を、以下に、wormsorterための新しいアプリケーションを記述します。これによりツールとして、我々はpathogとの関係に焦点を当てた植民地化/負荷と免疫応答備わり、ワームでの免疫応答の開始に責任のメカニズムに新たな洞察を得るために。 これまでに研究され、事実上すべての生物では、微生物病原体に対する自然免疫応答の開始は、病原体関連分子パターン（PAMP）の認識に依存し、かつ/または危険/損傷関連分子パターン（減衰させる）6,7。微生物の細胞壁の構成成分、その鞭毛、またはその脂質二重層6、最初に保存されている微生物の構造は、第二には、両方の放出された分子（ 例えば 、ATP 8）、改変されたタンパク質または改変された細胞プロセス9,10の他のマーカーが含まれています。両方のタイプの信号は、パターン分子の特異的結合の際に防御応答を導く一連の事象を活性化するパターン認識受容体（PRR）として指定されたタンパク質によって認識される。C.虫は tractaとして非常に有用であったBLEモデルは、宿主 - 病原体相互作用のさまざまな側面を分析するが、十分に理解されていない一つのことは、ワームに開始されるか免疫応答である。他の生物におけるパターン認識受容体（PRR）にオーソロガスである推定される受容体のどれものPAMPに結合することが示されておらず、他の生物における免疫応答のために極めて重要であるのPRRのオルソログの多くは、ワームの病原体応答に驚くほど限られた貢献度を示していると抵抗。例えば、グラム陽性病原体に抵抗するために不可欠であるショウジョウバエのToll受容体は、C言語で表現されているグラム陰性病原体ネズミチフス菌11からではなく、他のテストのグラム陰性からの保護に貢献する唯一のホモログ、TOL-1による線虫 、または陽性病原体11,12。これらの観察は、その免疫応答を示すデータと組み合わせる細胞のタンパク質翻訳hを破壊することによって誘導することができLEDなどのいくつかが提案することで虫は、主に減衰9,13,14を検出します。それにもかかわらず、免疫応答を誘導するために死んだ病原体の能力を記述するレポートは、PAMPの結合は、C.における病原体認識に重要な役割を有し得ることを示唆する虫 15,16。年齢に同期化された遺伝的に同一のCの免疫応答に焦点を当てたこれまでの研究虫集団は、細菌のグラム陰性病原体緑膿菌による腸のコロニー形成に大きな個体差を示した。 しかし、転写プロファイリング研究は、1事業体17,18として、これらの可変保菌集団を処理した。この変動を利用して、我々は、GFPを発現するPにさらさ線虫（Caenorhabditis elegans）の差別的植民集団を分離するための自動化されたwormsorterを中心にプロトコルを開発緑膿菌 。異なっ - 植民集団における遺伝子発現をFACI調べる病原体の負荷（および関連する損傷）との関係の評価と免疫応答をlitated とCに病原体認識についての新たな洞察を提供虫 19。下に我々はすべての蛍光標識された病原体に感染したワームのソートに適用することができるプロトコルを記述します。 潜在的なユーザーには、選別されることが必要虫数は、使用中のその後の分析およびプロトコルの性質に依存することに留意すべきである。例えば、マイクロアレイ遺伝子発現解析の場合には、&gt;千のワームは、標準的なプロトコルが使用される場合、十分なRNAを得るために必要とするが、増幅が用いられる場合約100ワームが十分である、材料の迅速な収集を可能にし、従って、ストレスを最小限にするワーム。

<table><tbody><tr><td>M9</td><td></td> <td>バッファー</td><td>wormbook.org</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma</td><td>R3501</td><td></td></tr> でレシピ <tr><td>自宅で</td><td></td>調製した<td>卵分調製液</td><td>水 50 ml 水 40 ml 漂白剤 10 ml 10 N 水酸化</td></tr>ナトリウム <tr><td>NGM プレート</td><td></td><td></td><td></td></tr> 10 ml で <tr><td>SKP プレート</td>を <td>wormbook.org で</td><td></td><td>レシピ SKP プレートNGMと同じレシピ:0.25%の代わりに0.35%ペプトンのみ</td></tr><tr><td>制御試験粒子</td><td>ユニオンバイオメトリカ</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr></tbody></table>

の自動分離<em&gt; c.虫</em&gt;可変細菌性病原体の植民地

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

wormsorterは蛍光レポーターの発現に基づいてワームを並べ替えることが一般的には、 線虫（Caenorhabditis elegans）の研究で使用されているFACS装置に類似した楽器です。ここでは、GFPを発現病原体によるコロニー形成の程度に応じてワームをソートするために、本器の代替使用状況を強調表示します。この新しい使用は、私たちは、ワームの腸や免疫応答の誘導の植民地との関係に対処することができました。一方、C.異なる病原体への虫の免疫応答は、それらを開始し何まだ不明ですが、文書化されている。 （相互に排他的ではない）2主な可能性が病原体関連分子パターンの認識、感染によって引き起こされた損傷の検出である。 2つの可能性を区別するために、病原体への暴露は、それが引き起こす損傷から解離されなければならない。グラムNによって広く保菌されたワームのwormsorter有効に分離植民同様に暴露されたワームの可能性が高い病原体の負荷による損傷はなく、またはわずかに、とegative病原緑膿菌 、。これらの異なる集団は、病原体負荷および転写免疫応答の誘導との間の関係を評価した。結果は、2つの病原体認識の可能性を支持し、解離していることを示唆している。

年齢をマッチさせた場合には、遺伝的に同一で虫はPにさらされている緑膿菌は 、広い分布がコロニー形成（ 図1A）のレベルで観察される。植民ワームからnoncolonizedの効率的な分離が（ 図1B）を達成することができ、ここで説明されたプロトコルの助けを借りて。 noncolonizedワームとは異なり、植民ワームは、低迷して減少し、排便19などの損傷の兆候を示している。後者は、ワームがPによって植民地化した理由かもしれ緑膿菌は困難、感染をクリアしています。これはnoncolonizedとしてソートワームが以前に定着していなかったことを示唆して記述されたプロトコルのための直接的な意味を持っています。直接この主張が正しいかどうかをテストするには、厳選された植民地化のワームは、仕分けの実験におけるものと同様の洗浄工程にかけ、その後、蛍光顕微鏡下で調べた。唯一の56分の4は、病原体をクリアしました。そのため、おそらく目ですnoncolonizedとしてソートものの中、以前に植民ワーム...

wormsorterは蛍光レポーターの発現に応じてワームをソートすることによって線虫（Caenorhabditis elegans）における遺伝子スクリーニングを容易にします。 GFPを発現病原体によるコロニー形成に応じて仕分けし、我々は、免疫応答を開始における病原体認識のよくわかっていない役割を調べるためにそれを利用する：ここでは、新たな使用方法を説明します。

の自動分離<em&gt; C.虫</em&gt;可変細菌性病原体の植民地

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

本実験の全体的な目的は、C. elegansにおける定着およびそれに伴う損傷が、自然免疫応答の開始にどのように寄与しているかを評価することである。これは、同調させた若年成体C. elegansの集団を、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するPseudomonas aeruginosaに曝露させることで達成され、これにより病原体の定着度に差がある虫の集団が作成される。洗浄後、定着度の異なる虫の集団を、完全に定着した個体と非定着個体という2つの極端なケースに焦点を当てて、純粋な集団に分離する。次に、これらの集団からRNAを抽出し、非病原性e coliで育成した虫と比較して免疫遺伝子の発現を評価します。免疫応答と定着の関係を調べるために、C. elegansのp arosaに対する自然免疫応答が病原体の定着から切り離し可能であることを示す結果が得られます。C. elegansにおける免疫応答の開始を研究するための他の手法に対する本手法の主な利点は、虫の集団における感染のばらつきに対処でき、感染プロセスの異なる側面を詳細に分析できる点にあります。本手法は、自然免疫における自然免疫応答の開始根拠など、重要な疑問にハイスループットに答えるのに役立ちます。また、遺伝的または環境的な操作が病原体の定着に対する耐能にどのような影響を与えるかという点も明らかにできます。まず、多くの線虫が成虫期に達するまで、E. coliを播種した数枚の線虫成長培地（NGMプレート）で線虫を培養します。次に、妊娠した個体を卵抽出液で処理し、同期化した培養株を得ます。続いて、細菌を播種した数枚の60 mm NGMプレートに、1枚あたり約150〜200個の密度で卵を分取します。数千匹のワームを得るには、最低15〜20枚のプレートが必要です。分級実験において、より多くのワームが必要な場合は、より直径の大きいプレートを使用し、1枚あたりの卵の数を増やしてスケールアップしてください。プレートを20 °Cで2日間インキュベートし、ワームがL4期または若成体期に達するまで育成します。卵の調製日の翌日に、GFP発現POSA培養液（PA 14 GFP）を、抗生物質を含む2 mLのKings B培地に接種します。この培養液を37 °Cで一晩振盪培養します。翌日、PA 14 GFP培養液を、アッセイに必要な数のスローキリングプレート（150 mmペトリ皿）に塗布します。飽和培養液を75〜100 µLピペッティングし、均等に塗布します。滅菌済みのガラス spreader を使用し、プレートを37 °Cで20〜24時間インキュベートします。PA 14 GFP のプレートをインキュベーターから取り出し、室温まで冷却します。一方、NGMプレートで培養した線虫を回収するには、プレート全体を覆うのに十分な少量のM9バッファーを加えます。プレートを静かに回して液体を混ぜ、液体を15 mLコニカルチューブに移します。線虫を底に沈殿させ、余分な液体を除去した後、最小限の液量で線虫をPA14 GFPプレートに転移させます。150 mmプレートを使用する場合、1枚のプレートに数百匹の線虫を配置することが可能です。p arosaに曝露させた若年成人虫について、プレートを25°Cで18〜21時間インキュベートします。これは、サンプルのソーティングを行う前に、コロナイズした個体と非コロナイズ個体が最適に分散して現れる時間枠です。装置が適切に動作していることを確認してください。重要な手順をここに概説しており、詳細はオンラインで確認できます。シースバルブの圧力を約5 PSIに設定し、シース液の流れが適切であることを確認します。ディスペンサーの下に15 mLのコニカルチューブを配置します。シースバルブをオンにし、ソーターバルブをオフにします。チューブをディスペンサーの下に60秒間保持します。チューブ内の液量は9～10 mLになるはずです。この範囲外である場合は、シース液の流量が正確なソーティングを可能にするよう、シースバルブの圧力を適切に調整します。まずシースバルブをオフにして、ソーティング速度をテストします。その後、リザーバーに約 25 milliliters のコントロール粒子溶液を加えます。コンピュータソフトウェア上でシースバルブとサンプルバルブをオンにします。コントロールパーティクルモードに移動し、acquireをクリックします。パーティクルの流速が秒あたり約5〜8個であり、飛行時間が40 µmパーティクルの幅とほぼ一致していることを確認してください。これにより、一度に1つの40 micronの物体のみが通過することが保証されます。値がこの範囲外にある場合は、適宜設定を調整してください。M9バッファーを用いて線虫を15 milliliterコニカルチューブに洗浄し、成虫が重力でチューブの底に沈むまで待ち、上澄み液を除去します。チューブに新鮮なM9バッファーを満たします。この操作を3〜4回繰り返します。これにより、大部分の幼虫と過剰な細菌が除去され、所要時間は約10分です。緩やかに回転する小型撹拌バーの入ったワームソーターのリザーバーにワームを添加します。緑色の光電子増倍管を600に、赤色および黄色の光電子増倍管を200に設定し、初期信号ゲインを調整します。データ収集を開始し、設定を調整します。1秒あたり25〜30イベントまたは個体のソート速度を目指してください。速度が高すぎる場合は、リザーバー内の線虫をM9バッファーで希釈し、適切に緩衝してください。レートが低すぎる場合は、少量のM nineを用いて線虫を追加してください。実験で、定着した線虫と定着していない線虫を非常に厳格に分離する必要がある場合は、コインシデンスチェックを「pure」に設定します。これにより、2つのオブジェクトが互いに近すぎる位置にあるか、または同一のドロップ内に存在する場合、装置がそのドロップを排除します。目的の集団を分取してソートするのではなく、サイズと蛍光強度を示す軸にゲートを設定します。蛍光ゲーティングの値は、経験的に決定する必要があります。次に、分取された線虫を回収するために、ディスペンサーの下にマルチウェルプレートまたはシャーレを配置します。次に、ソートバルブを開いて線虫のソートを開始します。少数の個体を回収し、顕微鏡下でソートされた集団が目的の集団であることを確認します。目的の集団でない場合は、ゲーティングパラメータを適宜調整し、サンプルの回収を続けます。遺伝的に同一で年齢を合わせたC. elegansをGFP発現P. arosaに曝露させると、コロニー形成レベルに大きなばらつきが見られました。そのため、웜ソーターを用いて非感染個体と感染個体を効率的に分離しました。非感染個体とは異なり、感染個体は緩慢な動きや排便回数の減少といった顕著な兆候を示します。後者が、P. arosaに感染した個体が感染を排除しにくい理由である可能性があります。線虫の定着状態に関わらず、4つの遺伝子がP arosaへの曝露と同様に誘導されたため、定量R-T-P-C-Rを用いてこれらの遺伝子の発現を測定した。これら4つの遺伝子は、C. elegansの免疫応答の一部であることが知られている。Lys twoはリゾシームをコードしており、正体不明の2つの遺伝子は特に感染に反応し、そのうちの1つは感染耐性にも寄与している。また、PGP fiveは感染および重金属ストレスに反応する。これらの結果は、定着およびそれに伴う損傷が免疫応答に必須ではないことを示した既報の結果を裏付けるものである。むしろ、病原体関連分子パターンがシグナルとして機能していることを示唆しており、定着していない動物（広範な損傷を受けていないと考えられる個体）においてPGP-5が誘導されるというデータは、C. elegansにおける免疫応答と一般的なストレス応答を制御する調節プログラムに重複があることを示唆している。この手法は、海いすしにおける免疫応答の開始に関する新たな知見を提供し得るが、感染プロセス以外にも、環境条件や遺伝子操作が定着や異なる病原体間の競合に及ぼす影響といった他の課題にも適用可能である。また、代謝物や化学物質の摂取や隔離など、線虫と環境とのその他の相互作用を追跡するためにも利用できる。本手順に従って分取された目的の集団は、遺伝子発現解析以外の一連の多様な目的に活用できる。これには、その後の感染または生存率アッセイ、あるいは行動実験のために生体動物を採取することが含まれます。この手法は、病原体への曝露および定着が、自然免疫と海辺の優雅さ（sea elegance.I）に及ぼす影響を研究するための有用な手段となります。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典:テイラー、MN、et.al。Caenorhabditis elegansと細菌の相互作用における不均一性を定量化するための単一ワームデータを用いたJ. Vis. 経験。(2022年)このビデオは、無菌で年齢が一致した Caenorhabditis elegans...

無菌 C.elegansにおける腸内細菌のコロニー形成の評価

出典: Petersen, C. ら、 『モデル線虫 Caenorhabditis elegansの自然微生物叢の分離と特徴付け』。 J. Vis. Exp. (2022年)この動画は、 Caenorhabditis elegansに関連する細菌種の分離と培養を示しています。C .

カエノラブディティス・エレガンス関連細菌の単離と培養

出典:Chen, Y. ほか。カエノラブディティス・エレガンスモデルにおけるエアロモナス感染の病原性と病因の評価。J. Vis. Exp.(2018年)このビデオは、 C. elegans を用いて エアロモナスの...

生存アッセイを用いたC. elegansにおけるエアロモナスの病因モデル化

出典: Le, T. A. N. , ほか、『カ エノルハブディティス・エレガンスの腸内透過性に対する細菌および化学物質の影響の測定』。 J. Vis. Exp. (2019年)このビデオでは、Pseudomonas aeruginosaに曝露されたC.

細菌曝露後の C. elegans における腸の透過性評価

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線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

ここでは適応可能、全体のホスト、ホスト病原体の相互作用を研究し、創薬に使用することが出来、高コンテンツ スクリーニング ツール...

高スループット、高コンテンツ、液体ベースのc. の elegans病態システム

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Caenorhabditis elegans は生物学の主要なモデル種の1つですが、ほとんどすべての研究は、その自然に関連する微生物の不在下で行われています。ここで説明する方法は、将来の機能的 C.エレガンス...

モデル線虫の天然微生物叢の分離と特性評価

学ぼう、ワームソーターを用いてGFP発現緑膿菌に感染したCaenorhabditis elegansを分離し、病原体定着と免疫応答の関係を解析する方法。この技術は感染の個体差を解明し、自然免疫の初期応答メカニズムを高スループットで研究するのに有用です。

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