植物タンパク質複合体の翻訳後修飾の同定

この手順の全体的な目標は、植物タンパク質複合体に関与するタンパク質の翻訳後修飾を最初に一過性または安定的に扁平に発現するタグタンパク質を同定することです。次に、植物の組織から全タンパク質を抽出し、目的のタンパク質を免疫沈降させます。次に、免疫沈降タンパク質をアクリルアミドゲル上で分離し、目的のゲルバンドからタンパク質を抽出して消化します。

次に、タンパク質サンプルを質量分析に提出します。最終的に、質量分析の結果は、リン酸化などの翻訳後修飾の動的変化を検出することができます。キナーゼを基質とin vitroでインキュベーションするなどの代替法とは異なり、この方法はプランターでタンパク質を発現します。

したがって、どのキナーゼがリン酸化に関与しているかを知る必要はありません。この方法は、ストレス、環境変化、病原体の認識に応答してシグナルがどのように伝達されるかなど、植物生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法は、活性化耐性タンパク質複合体の部位であるリン酸化の同定に加えて、あらゆる植物タンパク質複合体の翻訳後修飾に広く適用できます。

一般的に、この方法に不慣れな人は、大量の抽出物を扱うことに慣れておらず、1日でより多くの手順を実行するプロトコルに慣れていないため、苦労するでしょう。一過性発現のためには、アグロバクテリウムトーヒン株を固定相まで成長させます。アグロバクテリアを3000Gで5分間遠心分離して回収します。

ペレットと浸透緩衝液を再懸濁します。バッファ。今潜入します。生後4週間のNCOAハマナ植物で、アグロバクテリアを1ミリリットルの無針注射器で手動で使用するか、0.02%界面活性剤を真空にして浸潤後2〜5日で

浸潤した葉、葉を収穫し、液体窒素で凍結し、摂氏マイナス80度で保存します。次に、乳鉢と乳棒を使用して20グラムの植物組織と液体窒素を80ミリリットルの冷たい緩衝Cから20グラムに粉砕します。よく混ぜて氷の上で解凍します。

次に、10秒ずつのバーストを3回、全速力で均質化します。ホモジネートを濾過し、摂氏4度で30分間、30, 000Gで遠心分離します。その間4°Cで5分間の冷たいブロッキング緩衝液Dの500マイクロリットルで適した親和性のマトリックスの100マイクロリットルにそして冷たい緩衝D.Nextの1ミリリットルと3回洗浄しなさい、葉のエキスのsupernatを取除き、0.45マイクロメートルのシリンジを通して渡して下さい。

氷上で新しいチューブにろ過します。粗抽出物を分注します。イムノブロット用。

5つのXSDSページ読み込みバッファボルテックスを追加し、サンプルを沸騰させて変性させます。バッファーDに懸濁した50マイクロリットルのアフィニティーマトリックスを各チューブに加えます。4°Cで2時間穏やかに回転させてインキュベートし、遠心分離してアフィニティーマトリックスをペレット化します。

次に、免疫ブロット用の非結合抽出物のアリコートを取ります。残りの正気を捨て、チューブの底に約500マイクロリットルを残します。スラリー溶液をワイドボアチップで再懸濁します。

両方のチューブからの混合スラリー溶液を単一の1.5ミリリットルチューブにプールします。ベンチトップ遠心分離機を使用して5秒間3回パルスし、アフィニティーマトリックスを沈殿させ、1ミリリットルのコールドバッファーDで3〜5回の洗浄後にスーパーナトを除去します。3つのEITを1本のチューブに引っ張ります。

次に、30マイクロリットルの吸収樹脂ボルテックスを使用してタンパク質を濃縮します。5分間放置して樹脂を沈殿させ、スーパーネイトを捨てましょう。沈殿したアフィニティーマトリックスまたは吸収樹脂ボルテックスに50マイクロリットルの1つのXSDSページローディングバッファーを加え、ヒートブロック遠心分離機で摂氏80〜100度で10分間煮沸します。

煮沸されたアフィニティーマトリックスは、10, 000で2分間樹脂です。GSは、免疫ブロック用のスーパーナトの5マイクロリットルを分注し、他の画分と一緒に10センチメートルの長さのSDSページに実行します。質量分析によるリン酸化タンパク質の分離と同定のためのゲル。

残りの45マイクロリットルをSDSページのゲル染色液にロードします。コロイドカマシブリリアンスブルーのSDSページジェル。次に、ゲルを大量の洗浄と水で、できれば一晩保管します。

今、きれいなメスで、ゲルから目的のバンドを切り出し、ゲルスライスを2〜4ミリメートルの立方体にさいの目に切り、サンプルをチューブに移します。ゲル片を50%アセトニトリルと50ミリモルの重炭酸アンモニウムで汚れるまで洗います。次に、溶液をピペットで取り出します。

ジェル片をはがさないように注意してください。サンプルを100%アセトニトリルで5分間脱水し、遊離液を取り除きます。次に、タンパク質ジサルファイド結合を10ミリモルDTTで減少させ、摂氏56度で30〜45分間振とうしながらインキュベートし、ここで遊離液を除去してシステイン残基をアルキル化します。

55ミリモルのクロロアセトアミドを暗所の室温で20〜30分間加えます。.遊離液を取り出し、ゲル片を50%アセトニトリルで10分間2回洗浄します。遊離液を取り除きます。

次に、ゲル片を100%アセトニトリルで5分間脱水し、トリプティクダイジェストの遊離液を取り除きます。40マイクロリットルのトリプシン作業溶液で、ゲル片を覆うのに十分な消化緩衝液でゲル片を10分間再水和させます。摂氏37度で一晩インキュベートして消化を停止し、5%ギ酸でゲル片からペプチドを抽出し、5〜10分間超音波処理します。

次に、スーパーナットを新しいチューブに移し、凍結乾燥または真空濃縮器でペプチドを乾燥させ、サンプルを摂氏マイナス20度で保存します。この実験では、nacoa hamanaからP-R-F-P-T-Oキナーゼ複合体を精製し、35 SPTOを発現するトランスジェニックNACOAハマナを35 SPRFフラグで一過性に形質転換し、この複合体をAnti-Flag M two arosで免疫沈降させた。イムノブロットは、抗体検出および質量分析によって示されるように、PTOおよびPRFと共精製された相互作用エフェクタータンパク質の両方である標的PRFタンパク質の効率的な免疫沈降を示しています。

ここでの戦略は、Anti-FlagでPTOタンパク質を標的とすることでした。戦略が変更されました。PTOリン酸化部位を同定するため。

PRF 複合体と遊離型の両方を含む PTO タンパク質の総量を Anti-Flag M 2 aros で免疫沈降させ、SDS ページ分画、インゲル三連祭壇画消化、および質量分析を行った結果、その配列の約 80% に及ぶ PTO ペプチドが得られました。興味深いことに、PTOペプチドの単一リン酸化部位のセットが同定されました。二重リン酸化部位は、いずれかのエフェクタータンパク質の存在下でのみ同定されたことに注意してください。

タンパク質複合体の成分を同定し、目的のタンパク質の翻訳後修飾を検出するためには、十分な量の植物性タンパク質を摂取することが重要です。リン酸化のようなマッピング修飾には、質量分析による適度な量のタンパク質が必要であるため、この手順に従うと、ゲル上に少なくともかすかなバンドが明らかになるはずです。私のように、複雑な成分の同定は、免疫複合体の活性化がどのように機能的免疫につながるかなどの追加の質問に答えるために実行できます。

有機バッファー、バクテリア、カミソリBBLの取り扱いは非常に危険である可能性があるため、手袋やラップコートの着用などの予防策を講じることを忘れないでください。