植物タンパク質複合体の翻訳後修飾の同定

この手順の目的は、まず植物体内で目的のタンパク質にタグを付けて一過性または安定的に発現させ、植物タンパク質複合体に関与するタンパク質の翻訳後修飾を特定することです。次に、植物組織から全タンパク質を抽出し、目的のタンパク質を免疫共沈降させます。その後、免疫共沈降させたタンパク質をアクリルアミドゲルで分離し、目的のゲルバンドからタンパク質を回収して消化します。

次に、タンパク質試料を質量分析に供します。最終的に、質量分析の結果から、リン酸化などの翻訳後修飾の動的な変化を検出することができます。キナーゼと基質をin vitroでインキュベートする代替手法とは異なり、この手法ではタンパク質をプランター内で発現させます。

したがって、どのキナーゼがリン酸化に関与しているかを知る必要はありません。この手法は、ストレス、環境変化、または病原体認識に反応して信号がどのように伝達されるかなど、植物生物学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。活性化された抵抗性タンパク質複合体のリン酸化部位の特定に加えて、この手法はあらゆる植物タンパク質複合体のあらゆる翻訳後修飾に幅広く適用可能です。

一般的に、この手法に不慣れな方は、大量の抽出物を扱うことや、1日でプロトコルの多くのステップを遂行することに慣れていないため、苦労することがあります。一過性発現では、アグロバクテリウムのtohinv株を定常期まで培養します。遠心分離機を用いて3000 Gsで5分間遠心し、アグロバクテリウムを回収します。

ペレットを浸透バッファーで再懸濁します。4週齢のNCOA hamana植物に、1 mLの針なしシリンジを用いて手動で、または0.02%の界面活性剤を用いて真空状態でアグロバクテリアを浸透させます。浸透後2〜5日で回収します。

浸潤させた葉を採取し、液体窒素で凍結させ、-80°Cで保存します。次に、乳鉢と乳棒を用いて、20 gの植物組織を液体窒素で磨砕し、20 gの組織に対して80 mLの冷やしたバッファーCを加えます。よく混ぜ合わせ、氷上で解凍します。

次に、最高速度で10秒間のホモジナイズを3回繰り返します。ホモジナイゼートをろ過し、4°Cで30,000 Gsにて30分間遠心分離します。その間に、100 µLの適切なアフィニティーマトリックスに500 µLの冷えたブロッキングバッファーDを加え、4°Cで5分間静置した後、1 mLの冷えたバッファーDで3回洗浄します。次に、葉抽出液の上清を取り除き、0.45 µmのシリンジフィルターに通します。

氷上で新しいチューブにろ過します。粗抽出液を分注します。免疫ブロット用です。

5×のSDSページ用ローディングバッファーを加え、ボルテックスしてサンプルを煮沸し、変性させます。バッファーDに懸濁したアフィニティーマトリックスを50 µLずつ各チューブに加えます。4 °Cで2時間、緩やかに回転させながらインキュベートし、遠心分離してアフィニティーマトリックスをペレット化します。

その後、免疫ブロット用に非結合抽出液の一部を分注します。チューブの底に約500 µLを残し、それ以外の液は廃棄します。ワイドボアチップを用いて、スラリー溶液を再懸濁します。

両方のチューブから混合スラリー溶液を単一の1.5 milliliterチューブにまとめます。ベンチトップ遠心機を用いて5秒間のパルス遠心を行う操作を3回繰り返し、アフィニティーマトリックスを沈殿させ、1 milliliterの冷やしたバッファーDで3〜5回洗浄した後、上清を除去します。シリンジ針で余分なバッファーDを除去し、適切な溶出バッファー200 microlitersを用いて、定常的に振とうしながら溶出させます。3つのEITを単一のチューブに回収します。

次に、30 µLの吸収樹脂を用いてタンパク質を濃縮し、ボルテックスします。5分間静置して樹脂を沈殿させ、上清を捨てます。沈殿したアフィニティマトリックスまたは吸収樹脂に50 µLの1×SDS-PAGEサンプル調製バッファーを加え、ヒートブロックまたは遠心機を用いて80～100 °Cで10分間加熱します。

煮沸したアフィニティーマトリックスを10,000 ×gで2分間遠心分離します。上清を5 µL分注して免疫ブロッキングを行い、他の画分とともに10 cm長のSDS-PAGEゲルに供して、質量分析によるリン酸化タンパク質の分離および同定を行います。

残りの45 µLをSDS-PAGEゲルにロードし、コロイダル・クマシーブリリアントブルーで染色します。その後、十分な量の水で洗浄し、できれば一晩置いて脱色します。

次に、清潔なメスを用いて、目的のバンドをゲルから切り出し、ゲルスライスを2〜4 mmの立方体に細切してサンプルをチューブに移します。脱色されるまで、50%アセトニトリルおよび50 mM炭酸水素アンモニウムでゲル片を洗浄します。その後、溶液をピペットで吸い取ります。

ゲルの断片を取り除かないように注意します。100% アセトニトリルでサンプルを5分間脱水し、遊離液体を除去します。次に、10 mM DTTを用いてタンパク質のジスルフィド結合を還元するため、56 °Cで30〜45分間、振盪しながらインキュベートします。その後、遊離液体を除去し、システイン残基をアルキル化します。

55 millimolar クロロアセトアミドを加え、室温・暗所で20〜30分間放置します。遊離した液体を除去し、その後、50% アセトニトリルでゲル片を2回、各10分間洗浄します。遊離した液体を除去します。

次に、ゲル片を100%アセトニトリルで5分間脱水し、Triptych Digestに向けて遊離液を除去します。40 µLのトリプシン作動液を用い、ゲル片が浸る十分な量の消化バッファーを加え、10分間再水和させます。37 °Cで一晩インキュベートして消化を行い、5%ギ酸を用いて5〜10分間超音波処理を行い、ゲル片からペプチドを抽出します。

その後、上清を新しいチューブに移し、凍結乾燥機または真空濃縮機を用いてペプチドを乾燥させ、サンプルを-20 °Cで保存します。この実験では、Nacoa hamanaからP-R-F-P-T-Oキナーゼ複合体を精製しています。35 SPTOを発現する形質転換NACOA hamanaに35 SPRF flagを一過性に導入し、Anti-Flag M two arosを用いて複合体を免疫沈降させました。免疫ブロットの結果は、標的となるPRFタンパク質の効率的な免疫沈降を示しており、抗体検出および質量分析によって、PTOおよび相互作用するエフェクタータンパク質の両方がPRFとともに共精製されたことが示されています。

ここでは、Anti-Flagを用いてPTOタンパク質を標的とする戦略をとりました。PTOのリン酸化部位を特定するために、戦略を変更しました。

PRF複合体と遊離型の両方を含むPTOタンパク質の総量をAnti-Flag M2アガロースで免疫沈降させ、SDS-PAGE分画、ゲル内トリプシン消化、および質量分析に供した結果、その配列の約80%をカバーするPTOペプチドが得られた。興味深いことに、PTOペプチドの一連の単一リン酸化部位が同定された。なお、二重リン酸化部位は、いずれか一方のエフェクタータンパク質が存在する場合にのみ同定された。

タンパク質複合体の構成成分を特定し、目的タンパク質の翻訳後修飾を検出するためには、十分な量の植物タンパク質を得ることが重要です。質量分析を用いてリン酸化などの修飾をマッピングするには、適量のアッセイ用タンパク質が必要となるため、本手順に従った後、ゲル上に少なくともかすかなバンドが確認できる必要があります。また、免疫複合体の活性化がどのように機能的免疫につながるかといったさらなる疑問を解消するために、複合成分の同定などの他の手法を用いることができます。

有機緩衝液、細菌、およびカミソリBBLの取り扱いは非常に危険な場合があるため、手袋や白衣の着用などの予防策を講じることを忘れないでください。