ショウジョウバエにおける温度嗜好挙動とその概日リズムの設計と解析

この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエの温度選好を決定することです。これは、最初にハエと装置を準備し、温度制御されたアルミニウムベースの周りに組み立てられることによって達成されます。装置内で温度が確立されると、ハエのコホートがロードされ、30分後に彼らの温度選好が採点されます。

最終的に、このアッセイはさまざまな実験条件で使用できます。たとえば、温度選好の概日リズム。この方法は、ターゲットリズムフィールドの主要な質問に答えるのに役立ちます。

この温度選好の目標リズムは、ロコモティブ・アクティビティとは異なるメカニズムによって制御されているため、このビヘイビア・アッセイは、これまでロコモティブ・アクティビティ・アプローチでは同定されていなかった新たな分子・細胞メカニズムの同定につながると期待されます。この方法は、温度や痛みの感覚など、感覚神経科学分野の重要な質問に答えるのにも役立ちます。この温度行動アッセイは非常に堅牢であるため、このアッセイにより、温度検出から処理までの神経回路をマッピングすることができ、感覚統合についてより深い洞察を得ることができます。

1212ライトダークサイクルで加湿インキュベーターでハエを育てます。このプロトコルでは、2つのそのようなインキュベーターを反対のスケジュールに設定する必要があります。夜間のインキュベーターは、通常の勤務時間中は暗くする必要があります。

夜間にインキュベーターにアクセスするときは、赤色のライトを使用してインキュベーターを照らします。性別および任意の比率で新たに孵化した20〜30匹のハエのコホートを収集し、アッセイで実行する前に2〜3日間インキュベーターに保管します。テストされた条件ごとに、少なくとも 5 つのコホートが必要です。

温度選好試験チャンバーを構築するには、プレキシガラスカバーをプレートの下のアルミニウムプレートにフィットするように設計する必要があります。ペルチェ素子を4つ設置します。各ペルチェデバイスは、ペルターが過熱するのを防ぐために、低温または高温を生成できる温度コントローラーに接続する必要があります。

コンピューター冷却システムは、アルミニウム板の温度を監視するために、水管、空冷ファン、および電源に接続されています。温度プローブはアルミニウム板の端に埋め込まれ、温度コントローラーに接続されています。カバーのプレートの冷側と高温側をそれぞれ摂氏12度と36度に設定します。

1つのレーン内のさまざまな位置に6つの温度プローブを取り付けます。装置は、摂氏25度、相対湿度65〜75%の環境制御された部屋に置きます。これらの条件を必ず監視してください。

部屋は、循環する空気が温度を不安定にしないように、光制御と良好な空気循環を備えている必要があります。グラジエントは、シャワーカーテンでテストエリアを保護します。光度が温度嗜好に影響を与える可能性があるため、装置には均一な光を使用する必要があります。

装置の電源を少なくとも30分間オンにします。プレートの表面に安定した温度勾配を確立するため。行動装置のカバーに撥水剤を塗布して、ハエがカバーの壁や天井を登らないようにします。

余分な撥水剤を拭き取り、必要に応じてカバーを25〜30分間駆動したままにし、30分後に両面テープを使用する場合があります。アルミ板の結露を拭き取ります。次に、プレキシガラスカバーをアルミニウムプレートに置き、6つのCクランプで固定します。

カバーが密封されていることは非常に重要です。プレートとカバーの間の空気温度をよく監視します。プローブがアルミニウムプレートまたはプレキシガラスカバーに触れないようにしてください。

カバーをプレート上で少なくとも15分間平衡化させます。最終的に、アルミニウム板とカバーの間の気温勾配は摂氏18度から32度の範囲になります 日中の行動実験の場合、ハエのバイアルを昼のインキュベーターから取り出し、夜間の行動実験の直前に光の中で行動アッセイをテストします。ハエのバイアルを夜のインキュベーターから取り出します。

それらをホイルで包み、赤いランプの下の暗い部屋の箱に入れます。暗い期間の実験では、行動実験が完了するまで、部屋の照明は常に消灯したままにする必要があります。ただし、吸引を使用して照明に赤いランプを使用できます。

荷重20〜25は、アルミニウム板の間のスペースに飛んでいきます。次に、ハエが逃げるのを防ぐために、穴をカバースリップで覆います。ハエを30分間動かします。

実験が完了したら、光の実験のために少なくとも2枚の写真を撮ります。暗い実験にはフラッシュを使用する必要があります。装置の温度を確認してください。

ハエを麻酔するために装置上部の穴の近くにある二酸化炭素のハエ接続チューブを取り除くために、室温と湿度に注意してください。再テストはしないでください。次に、プレートに付着した結露や水分を拭き取ります。

プレートのカバーを元に戻し、準備のためにクランプで締めます 次の実験では、次のように温度勾配を計算します。まず、プローブの位置と記録された温度に基づいて、定規を使用して温度プローブが配置されている場所を決定します。フライの最終位置の写真上の適切な位置にある各温度度を表す直線を描きます。

次に、摂氏1度の間隔ごとにハエの数を数えます。カバーの壁や天井にハエがいないようにします。各レーンの各温度範囲におけるハエの割合を計算し、次に各条件の平均優先温度を計算します。

少なくとも 5 つの試行からデータを収集します。次に、各試行の平均値を使用して、誤差のある平均優先温度を決定します。摂氏25度で育てられた通常のハエは、夕方よりも朝の方が気温が低いことを好みます。

日中は気温の好みが1〜1.5度上昇し、摂氏1.5度から2度上昇することが測定されました。昼から夜への移行時に減少が見られました。このアッセイは、変異型ハエの試験にも使用できます。

例えば、トリップで欠陥のある突然変異を持つハエの温度選好性は、1イオンチャネルが対照群の温度選好よりも高いことがわかった。このビデオを見れば、温度選好行動アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。この方法により、分子メカニズムと神経回路、ofaと時計、および脳がさまざまな環境手がかりと体内時計をどのように統合するかを調査できます。