Name: 微細加工チャネルにおける細胞移動の研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 学ぶ微細加工チャネルを用いた細胞移動の定量解析法。PDMSチップで樹状細胞の移動速度を顕微鏡で追跡し、薬剤処理の影響を評価できます。制限環境下での細胞動態を正確に測定する実験手法です。

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著者は大幅キュリー研究所（CNRS UMR144）でPICT IBiSAプラットフォームを認める。この作品は、からの補助金によって賄われていた。AM.LD欧州研究評議会（Strapacemi 243103）、協会国立はMPと午前·ラ·ルシェルシュ（ANR-09-PIRI-0027-PCVI）、InnaBiosanté基盤（Micemico）を注ぐ。 AM.LD.にLDとERC Strapacemi若手研究助成金

重要な注意：このプロトコルは、希望するマイクロチャネルのための形状を含む、型が既に行われていることを前提としています。金型の調製に関するさらなる情報は既に10を出版されました。このプロトコルはまた、骨髄DCは文化が知られていることを前提としています。 1。チップ製造<ol><li>プラスチックカップ中の重量比10:1でPDMS油及び硬化剤を混合する。徹底的に両方の化合物を混ぜて。 </li><li>金型ベアリングマイクロチャネル上でミックスをキャスト。全体の高さは0.5〜1センチメートルの間でなければなりません。 </li><li> 1時間の間に真空ジャーベルで気泡を除去。 </li><li> 65℃で2時間オーブンで後者を配置することによって、金型で硬化PDMS </li><li> PDMSは、室温であると、外科用ブレードを用いて構造の周りに大きな部分をカットして、金型（ 図1A）からそれをはがす。 </li><li>細胞は（通常は2ミリメートル）を注入し、PDMSのサイズを変更されるドリル穴移行が評価されるであろうガラスボトムディッシュ（ 図1B）のサイズに合わせて、外科ブレード。先に進む前に、レンズクリーニングペーパーを使って皿から残っている埃を取り除きます。これは、ステップ1.10に記載のガラスへのPDMSの結合を促進する。 </li><li>構造側に粘着テープを貼り付けし、剥離することによりチャネルを含むサイズ変更PDMSチップを清掃してください。 </li><li>粉塵及びPDMS小粒子を除去するために70％エタノール中でPDMS片を30秒間超音波処理する。きれいな空気を吹き付けて、その後すぐにそれらを乾燥させます。 </li><li> 300トルで30秒の間にプラズマ処理空気（または酸素）によって、PDMS（上向き構造体）と培養皿をアクティブにします。 </li><li>恒久的に基板に、PDMSを固執する接触の両方で活性化された表面に置きます。必要に応じて、ポリマーおよびディッシュ（ 図1C）のガラスとの間の接触を強制的にPDMSの上に少し押して、金属鉗子を使用しています。 </li><li> 65°CのFOのオーブンでチップをインキュベート結合を強化するため、R 1時間。 </li></ol> 2。マイクロチャネルのコーティング<ol><li> 1分間300トルで空気プラズマにより全体構成をアクティブにします。これは次のステップのチャンネルへの液体の侵入を推進していきます。 </li><li>水中で10μg/ mlので急速にフィブロネクチンとチップのエントリ穴を埋める。例えば、PEGのような他の基質は、チャネル壁への細胞接着を修飾するために使用することができる。液体は全体の構造全体に広がることを注意してください。これは簡単に、通常の光の下または通常の明視野顕微鏡を用いて目で確認することができます。 NOTE：拡散が困難になっている、非常に小さい構造では、チャネル内の液体の侵入を少なくとも15分の間に真空ジャーベル構造を配置することによって強制することができる。コーティング蛍光基質の効率を検証する（ 図2）を用いることができる。 </li><li>フィブロネクチンの吸着または任意の他のコーティングにsubstを可能にするために室温で1時間インキュベートチャネルの壁に対する割合。 </li><li>構造が非結合基材を除去するために、PBSで3回洗浄します。 </li><li>洗浄後、議定書3に進むか、後で使用する（24時間の最大値）、4℃でチップを格納します。 </li></ol> 3。セル負荷<ol><li>プレートからPBSを除去して、細胞培地でマイクロシステムを埋める。媒体とのチャネルを飽和させるために1時間インキュベートしてみましょう。 注：分子阻害剤のような薬物を含む実験のためには、右の濃度の薬剤を含む培地でチャンネルをプレインキュベートすることをお勧めします。さらに、いくつかの薬物は、有効濃度を低下させるPDMS構造体に可溶化する傾向がある。一部のソリューションは、この問題11-12に対抗するために提案されている。 </li><li>浮遊DCを削除し、培養液でフラッシュすることにより、半接着細胞を回収する。血球計数器を用いて細胞を数える。 注：核イメージングでは、ヘキスト33342染色はインで事前に達成することができ完全培地中の200 ng / mlの時に染料と30分の間に2×10 6の細胞をcubating。プロトコルを続行する前に色素の過剰を取り除くために遠心分離により二回洗浄します。 </li><li> 5分（時間および速度は細胞の種類に応じて異なっていてもよい）中に300×gで細胞を遠心し、培地を捨てる。 20×10 6細胞/ mlの濃度に達するようにペレットを希釈する。 </li><li>プレートから培地の過剰を削除し、マイクロピペットを用いて、PDMS構造のエントリの穴を空にします。各エントリの穴に1×10 5個の細胞の量に到達するために細胞溶液5μlのエントリを入力します。 NOTE：高細胞密度は、チャネルによる細胞の接触に有利に働くことが要求される。低細胞密度は、チャネルと、実験の失敗の内側の細胞の少数をもたらし得る。 </li><li>インキュベーター内で37℃で30分間、マイクロチップをインキュベートする。実験皿に完全培地の2ミリリットルを追加します。 注：全体のPDMS構造は、bになりませんeは実験中の細胞の乾燥を避けるために覆わ。 2mlの十分でない場合、完全にPDMS構造体を覆うように、より多くの培地を加える。 </li></ol> 4。イメージング<ol><li>顕微鏡下のプレートを配置する前にレンズクリーニングティッシュと料理の外部底面を清掃してください。 </li><li>多数の細胞内移行を分析するには、CO 2と温度を装備ビデオ顕微鏡で10倍と広い視野照明（ 図3）を使用します。細胞追跡を容易にするために、ヘキスト染色およびUV光は（ステップ3.2参照）を使用することができる。移行は、移行​​中に細胞構造の高解像度を得るために、共焦点顕微鏡を用いて分析することができる。 </li><li> 10Xのタイムラプス顕微鏡検査のために、期待されるセル速度（5ミクロン/分の速度で移行した樹状細胞のため、通常2分）に応じた時間周波数を選択します。 注：ここに記載されているプロトコルは、nを行いますオトは、細胞遊走パラメータの分析を含む。いくつかのポイントは、時間経過の映画から情報を抽出するためにどのように進めるかについて、読者に助言するために議論に記載されています。 </li></ol>

<ol><li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+a+physically+integrated+molecular+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li>
<li>Lämmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
<li>Schor, S. L., Allen, T. D., Harrison, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+through+three-dimensional+gels+of+native+collagen+fibres%3A+collagenolytic+activity+is+not+required+for+the+migration+of+two+permanent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell migration through three-dimensional gels of native collagen fibres: collagenolytic activity is not required for the migration of two permanent cell lines.</a> J. Cell. Sci. 41, 159-175 (1980).</li>
<li>Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decisions+about+dendritic+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decisions about dendritic cells: past, present, and future.</a> Annu. Rev. Immunol. 30, 1-22 (2012).</li>
<li>Faure-André, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendritic+cell+migration+by+CD74%2C+the+MHC+class+II-associated+invariant+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendritic cell migration by CD74, the MHC class II-associated invariant chain.</a> Science. 322 (5908), 1705-1710 (2008).</li>
<li>Renkawitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+force+transmission+in+amoeboid+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptive force transmission in amoeboid cell migration.</a> Nat. Cell Biol. 11 (12), 1438-1443 (2008).</li>
<li>Jacobelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confinement-optimized+three-dimensional+T+cell+amoeboid+motility+is+modulated+via+myosin+IIA-regulated+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions.</a> Nat. Immunol. 11 (10), 953-961 (2010).</li>
<li>Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchinson, T., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+stimulation+and+constrained+cell+migration+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 7 (12), 1783-1790 (2007).</li>
<li>Moreau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).</li>
<li>Heuzé, M. L., Collin, O., Terriac, E., Lennon-Duménil, A. M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+in+confinement%3A+a+micro-channel-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration in confinement: a micro-channel-based assay.</a> Methods Mol. Biol. 769, 415-434 (2011).</li>
<li>Ren, K., Zhao, Y., Su, J., Ryan, D., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convenient+method+for+modifying+poly%28dimethylsiloxane%29+to+be+airtight+and+resistive+against+absorption+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Convenient method for modifying poly(dimethylsiloxane) to be airtight and resistive against absorption of small molecules.</a> Anal. Chem. 82 (14), 5965-5971 (2010).</li>
<li>Ren, K., Dai, W., Zhou, J., Su, J., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Teflon+microfluidic+chips%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Whole-Teflon microfluidic chips.</a> PNAS. 108 (20), 8162-8166 (2011).</li>
<li>Maiuri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+World+Cell+Race%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The first World Cell Race.</a> Curr Biol. 22 (17), 673-675 (2012).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここでは、単一の実験で多数の細胞の遊走特性を研究するための方法として、マイクロチャネルからなる装置を記載している。この実験系は、内因性の遊走細胞によって組織に見閉じ込められた環境制約を模倣。しかし、単一の次元に移行を強制することにより、自動細胞追跡とmeasurablesの抽出（ 図5）を容易にします。我々はまた、我々のデバイスは、蛍光顕微鏡と互換性があり、従って、細胞運動性（ 図4）の異なる段階の間、細胞小器官の位置を研究するために適合させることができることを示している。 プロトコル内の重要なステップは、チャネルの品質です。これは、ガラス表面にPDMSの良い付着を制御することが重要である。スティッキングのトラブルが表示されたら最初に確認する事が両面の清潔さとプラズマクリーナーの一つです。重要であり得る他のパラメータは、目でロードされた細胞の電子密度。自発的遊走は、チューブへの侵入を容易にするために、チャネルへの細胞の近接を必要とし、最適な数は、各細胞型について評価すべきである。 <p class="jov...

マイグレーションは、開発、免疫応答および組織再生を含む多細胞生物における多くの生理学的プロセスに重要である複雑な細胞機能である。また、このような腫瘍の浸潤および転移などの特定の病的状態は、細胞運動性1に依存している。これらの理由から、細胞遊走、基本および翻訳の両方の研究との関連で研究の主要な分野となっている。 インビボでは 、ほとんどの組織が ​​豊富な細胞外マトリックスおよび高細胞密度によって特徴付けられる。細胞移動は、従って、生理的条件下で、複雑な閉じ込められた環境で発生する。古典的には、最も可能性の高い歴史的な理由や技術的な限界のために、細胞移動は、監禁などの組織に見られる環境プロパティの多くを再現していないフラットな2D系で研究されている。また、2Dでの運動性のために必須である細胞接着などの要因は、最近necessaではないことを示したされていますRILY 2Dにし、他の環境での細胞運動を支配する機構は2異なっていることを示唆し、 生体内でまたはゲルの内部移行に必要。いくつかのシステムは、細胞外マトリックス組成物3の特性をrecapitulating目指す組織の複雑な性質、最も有名なものコラーゲンゲルを模倣するために開発されている。ここでは、限られた環境下で1次元での研究細胞移動を可能にする簡単な補完的な方法として、マイクロチャネルを提案する。 このシステムでは細胞は、それらが自然に入るその中にマイクロチャネルに沿って移動する。遊走細胞はその後、おそらくそれらの極性を強化管状ジオメトリを採用し、チャンネルの形状を取得する。チャネル内のセルの直線運動は、自動細胞追跡実験からの定量パラメータの抽出を可能にする。技術的な観点から、このシステムは、簡単で柔軟性があります。 coatinチャネル壁のgを操作することができ、チャネルのサイズおよび形状を適合させることができ、多数のセルは、単一の実験で分析することができる。このシステムはまた、スケールアップすることができる細胞の運動性に関与する分子の中距離スクリーン解析を実行する。ここで説明するプロトコルは、細胞モデルとして樹状細胞（DC）を用いて標準化されている。彼らは4。 インビトロ 、DCは自然発生的に限られた環境の中を移動することが示されている特異的な免疫応答の開始と維持に参加し、したがって、マイクロチャネル5,6に細胞運動を研究するための優れたモデルであるように、これらの細胞は、免疫システムの鍵となる。重要なことに、このシステムは、Tリンパ球、好中球、または腫瘍細胞を7-9などの他の運動性の細胞型の遊走を分析するために拡張することができる。

<table><tbody><tr><td>ポリジメチルシロキサン(PDMS)</td><td>GEシリコーン</td><td>RTV615</td><td>90%シリコーンベースと10%硬化剤のパッケージ</td></tr><tr><td>コアサンプルカッター</td><td>テッド・ペラ・イント。</td><td>ハリスユニコア</td><td>直径 2.5 mm</td></tr><tr><td>ガラス底ディッシュ</td><td>WPI</td><td>フルオロディッシュ FD 35-100</td><td></td></tr><tr><td>超音波洗浄機</td><td>ブランソン超音波</td><td>ブランソン 200</td><td></td></tr><tr><td>プラズマ洗浄機</td><td>ハリックプラズマ</td><td>PDC 32 G</td><td>少量サンプル用(35皿)。より大きなバージョンも利用可能</td></tr>です <tr><td>ウシ血漿からのフィブロネクチン</td> シ<td>グマ アルドリッチ</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>ポリリジングラフト PEG(Pll-g-PEG)</td><td>Susos</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>TOCRIS</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

微細加工チャネルにおける細胞移動の研究

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

ここで説明する方法は、1次元での閉じ込め下で細胞遊走の研究を可能にする。これは、物理的な制約によって細胞に偏光された表現型を与える微細加工されたチャネルの使用に基づいている。前後に移動：内部のチャンネルと、細胞は2つの可能性を持っている。指向性が制限され、この簡略化は、細胞遊走の自動追跡および細胞移動を説明するための定量的なパラメータの抽出を容易にする。これらのパラメータは、運動中の細胞の速度、方向の変化、一時停止が含まれる。マイクロチャネルはまた、蛍光マーカーの使用と互換性があり、したがって、高解像度での細胞移動の際に細胞内小器官及び構造の局在化を研究するのに適している。最後に、チャネルの表面は、チャネルまたは走触性の研究の粘着特性の制御を可能にする、異なる基質で官能化することができる。要約すると、システム時間記載やがては独立した実験の標準化と再現性を容易にする、幾何学的形状と環境の生化学的性質の両方が制御された条件で大細胞数の移動を分析することを意図している。

各実験において、PDMSの表面は。前と（ステップ2.4）で洗浄した後、図2に示す蛍光分子、PLL-gの-PEGでコーティングされたチャネルを図調査の関心に適合分子でコーティングされる。このような実験は、チャンネル内のコーティングの均一性を制御することができる。 セルの負荷後に、ビデオ顕微鏡は、細胞移動に追従して行うことができる。 図3Aは、DC細胞を追跡するために適切な密度でマイクロチャネルに移行する場合の例を示している。位相コントラストおよびヘキスト染色の両方は、（説明を参照）は、この目的のために使用することができる。技術は、より高い解像度で、蛍光共焦点顕微鏡と互換性があり、細胞小器官または細胞構造を追跡するために使用することができる。 図4Bは LifeActGFPを発現するDCを移行中の重合アクチンの動的な一例を示す。 細胞の定量化の例DCを移行中で分析運動性を図5</s...

一次元閉じ込められた微小環境における細胞の自発的な遊走を研究するための定量的方法が記載されている。この方法は、微細加工されたチャネルを利用し、単一の実験では、異なる条件下で多数の細胞の遊走を研​​究するために使用することができる。

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

本実験の全体的な目的は、自発的な限定細胞遊走を研究するための微細加工チャネルを作製することです。まず、チャネルを含むポリメチルメタクリレート（PMMA）、SUBOXANE、またはPDMSチップを作製します。次に、チャネル内をフィブロネクチンまたは他のコーティング基質でコーティングし、デバイスの機能化を行います。数回の洗浄後、細胞遊走を研究するために樹状細胞をマイクロシステムにロードします。顕微鏡観察と画像解析に基づき、細胞種や処理によって速度に差があるという結果が得られます。従来の2次元遊走などの既存手法に対するこの技術の主な利点は、細胞の幾何学的構造と閉じ込め状態を考慮できる点にあります。一般的に、この手法に不慣れな方は、各ステップで求められる精度が高いため、困難に直面することがあります。まず、プラスチックカップの中でPDMSオイルと硬化剤を重量比10:1で混合し、両方の化合物を十分に混ぜ合わせ、マイクロチャネルを備えたモールド上にキャストします。全高は0.5〜1cmにする必要があります。真空デシケーター内で1時間かけて気泡を除去した後、65 °Cのオーブンに2時間置いてモールド内のPDMSを硬化させます。PDMSが室温まで冷却された後、外科用メスで構造体の周囲を大きく切り出し、モールドから剥がします。次に、細胞を注入する位置に穴を開け、遊走能を評価するガラスボトムディッシュに適合するように、外科用メスでPDMSのサイズを調整し、洗浄します。粘着テープを構造の側面に貼付および剥離させることでチャネルを形成し、サイズ調整したPDMSチップの断片をソニケーションします。次へ進む前に、70% ethanol中で30秒間処理し、ほこりや微細なPDMS粒子を除去してください。その後、レンズクリーニングペーパーを使用してディッシュから残ったほこりを取り除きます。300 Militで30秒間エアプラズマ処理を行い、PDMSと培養皿を活性化させます。必要に応じて、活性化させた両方の表面を接触させ、PDMSを基板に永久的に密着させます。金属製ピンセットを用いてPDMSの上から軽く押し、ポリマーと皿のガラスとの接触を促します。その後、チップをオーブンに入れ、65 °Cで1時間インキュベートします。結合力を強めるため、構造全体を300 millitorrの空気プラズマで1分間活性化させます。これにより、次のステップにおけるチャネルへの液体の導入が促進されます。次に、チップの入口穴に10 micrograms per milliliterのフィブロネクチン水溶液を速やかに注入します。チャネル壁への細胞接着性を修飾するために、ポリエチレングリコールなどの他の基質を使用することも可能です。液体が構造全体に広がっているか注意して確認してください。これは、通常の光の下で目視で、または通常の明視野顕微鏡を用いて簡単に確認できます。次に、フィブロネクチンまたはその他のコーティング基質がチャネル壁に吸着するように、構造体を室温で1時間インキュベートします。最後に、チャネルとディッシュからすべての液体を除去し、新鮮なリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に5分間浸漬することで、未結合の基質を洗い流します。プレートからPBSを除去し、マイクロシステムに細胞培地を満たします。プレートを1時間インキュベートし、チャネル内を培地で飽和させて、イメージング用の細胞を回収します。浮遊している樹状細胞を除去し、培養培地でプレートをフラッシングして、半接着細胞を回収します。その後、細胞数をカウントします。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測後、300 ×gで5分間遠心分離し、培地を除去します。ペレットを再懸濁し、細胞濃度が20 million cells/mLになるように希釈します。プレート上の余剰な培地を取り除き、PDMS構造の導入孔内を空にします。マイクロピペットを使用します。次に、各エントリーホールに細胞溶液を5 µLずつ分注し、1 × 10⁵ cellsになるように満たします。インキュベーター内でマイクロチップを37 °Cで30分間インキュベートした後、イメージングのために実験ディッシュに完全培地を2 mL加えます。まず、プレートを顕微鏡の下に配置する前に、レンズクリーニングティッシュでディッシュの底面外側を清掃します。多数の細胞の遊走を解析する場合、細胞トラッキングを容易にするため、CO2および温度制御機能を備えたビデオ顕微鏡を用い、10倍の倍率とワイドフィールド照明を使用してください。10倍倍率でのタイムラプス顕微鏡観察については、テキストプロトコルで説明した通り、Hirsch染色とUV光を使用することが可能です。予想される細胞速度に応じて時間周波数を選択します。分速5µmの速度で移動する樹状細胞の場合、通常は2分に設定します。各実験において、PDMSの表面は研究目的に適した分子でコーティングされます。この図では、チャネルが蛍光分子でコーティングされています。洗浄前後のポリリジン修飾ポリエチレングリコールの状態を示しています。このような実験により、チャネル内におけるコーティングの均一性を制御でき、細胞導入後のビデオ顕微鏡観察によって細胞遊走を追跡することが可能です。ここでは、細胞の追跡に適した密度でマイクロチャネル内を移動する樹状細胞の例を示します。この目的には、位相差顕微鏡観察とHERCH染色の両方が利用可能です。また、この手法はより高解像度の蛍光共焦点顕微鏡とも互換性があり、LifeAct GFPを発現して移動する樹状細胞における重合アクチンのダイナミクスに示されているように、オルガネラや細胞構造の追跡に使用できます。遊走する樹状細胞で解析された細胞運動性の定量化の例をここに示します。野生型または Y 27 632 dihydrochloride 処理した樹状細胞から得られた Kraft は、この薬剤が細胞の収縮性と遊走の十分に特性評価された阻害剤であることを示しており、速度の変化を検出するシステムの能力を検証するために使用されました。kogsをさらに解析することで、時間の関数として細胞の位置とサイズを抽出でき、細胞遊走を記述するさまざまなパラメータの研究が可能になります。自作のソフトウェアを用いて核の位置をイメージングし、遊走速度を追跡した。樹状細胞の平均速度は毎分約6 µmであった。薬剤投与により、その速度は有意に低下した。この例は、単一の実験で大量の細胞を定量化できる本手法の有用性と、薬剤処理によって誘発される差異を検出できる本システムの有用性を示しています。習得後、適切に実施すれば、ここで実演する手法は3時間で完了させることができます。この手法は、移動分野の研究者が、制御された限定的な環境における細胞移動を研究するための道を切り開きました。

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Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

がん幹細胞の移動を調査するための区分するマイクロ流体デバイスが記載されている。この小説のプラットフォームは、生存細胞の微小環境を作成し、生細胞運動の微視的な可視化を可能にします。非常に運動性のがん細胞は、潜在的に、より効果的な将来の治療法につながる積極的な浸潤の分子メカニズムを研究するために隔離されています。...

区分するマイクロ流体デバイスとライブセルイメージングを使用した癌幹細胞の移行の評価

phagokinetic運動追跡アッセイは、細胞の動きを評価するために使用される方法です。具体的には、アッセイは、定量的な方法で時間をかけてケモキネシス（ランダム細胞の運動性）を測定します。アッセイは、コロイド金でコーティングされたカバースリップ上で彼らの動きの測定可能なトラックを作成する細胞の能力を活用しています。...

Phagokineticトラック運動アッセイによる細胞遊走の定量的評価

生細胞遊走試験のための顕微鏡検査室における接着剤および可溶性勾配のアセンブリのための方法が記載されている。エンジニアリング環境は、ソリューションの勾配と防汚表面と接着剤のトラックを結合し、したがって1つは、指導の手がかりの相対的な重要度を決定することができます。...

蛍光顕微鏡を用いたイメージング細胞遊走用接着剤及び可溶性グラデーションを作成する

細胞の移動は、人間の発達と生命の重要な部分です。細胞遊走を変化させるメカニズムを理解するために、3Dコラーゲンマトリックスの走化性を調査するための平面勾配拡散システムを提示します。...

3Dコラーゲンマトリックス中の走化性を調査するために、平面グラデーション拡散システム

多くのマイクロ流体デバイスは、エレクトロタキシスの研究で使用するために開発されています。しかし、これらのチップのいずれも、細胞に対する化学的および電界(EF)の影響を同時に効率的に研究することはできません。私たちは、エレクトロタクシス研究で使用するために、より適切に制御された共存するEFおよび化学刺激を提供するポリメチルメタクリレートベースのデバイスを開発しました。...

マルチチャンネルデュアル電界マイクロ流体チップを用いて、肺癌細胞の走電性の研究

このプロトコルはまた、ポリマーマトリックスからの薬物の拡散速度を決定するために使用される化学誘引物質に応答した細胞遊走を測定するためのカスタマイズ可能な方法を詳述します。...

細胞移動を測定するためのカスタマイズ可能な商工会議所

化学的および酸素勾配の制御は、細胞培養に不可欠です。この論文では、細胞遊走研究のための化学的勾配と酸素勾配の組み合わせを確実に生成できるポリジメチルシロキサン-ポリカーボネート(PDMS-PC)マイクロ流体デバイスを報告しています。これは、高度な機器を必要とせずに生物学研究室で実用化できます。...

垂直化学的酸素勾配の下で細胞移動研究のためのポリジメチルシロキサン - ポリカーボネートマイクロ流体デバイス

発達における集団細胞移動、創傷治癒、癌転移は、多くの場合、成長因子またはシグナル伝達分子の勾配によって導かれる。ここでは、トラクション顕微鏡とマイクロ流体システムを組み合わせた実験システムと、生化学的勾配下での集団移動の仕組みを定量化する方法のデモンストレーションを行います。...

化学的集団移動のためのマイクロ流体学と統合された牽引顕微鏡

このプロトコルでは、生理学的に関連する微小血管環境を再現し、白血球接着/遊走カスケード全体を再現することができる生体模倣マイクロ流体アッセイが、炎症性疾患における白血球 - 内皮細胞相互作用を研究するために採用される。...

炎症時の白血球-内皮細胞相互作用を研究するための微生理学的システム

ここでは、粒状ハイドロゲルの界面内および界面への3D細胞遊走を定量的に評価するためのプロトコールを紹介します。...

粒状ハイドロゲル生体材料内および粒状ハイドロゲル生体材料内への三次元細胞移動の定量化

学ぶ微細加工チャネルを用いた細胞移動の定量解析法。PDMSチップで樹状細胞の移動速度を顕微鏡で追跡し、薬剤処理の影響を評価できます。制限環境下での細胞動態を正確に測定する実験手法です。

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