細胞毒性活性を測定するための細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ

この手順の全体的な目的は、細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイを用いて、抗原特異的CD8 T細胞の細胞毒性活性を測定することです。まず、目的のペプチド存在下でエフェクターCD8 T細胞を6日間増殖させます。次に、ターゲットとなるCD4 T細胞に目的のペプチドをパルスし、その後、未パルスCD4 T細胞と混合します。続いて、エフェクターCD8 T細胞とターゲットCD4 T細胞を、異なるエフェクター対ターゲット比で6時間共培養します。

最終ステップとして、ペプチド負荷したターゲットCD4 T細胞の殺傷能およびエフェクターCD8 T細胞の数をフローサイトメトリーで定量します。最終的に、溶菌ユニット（lytic units）で表される抗原特異的CD8 T細胞の固有の殺傷能を算出することができます。この手法の、アロリリースアッセイ（aro release assay）のような手法に対する主な利点は、不死化細胞株ではなく、実際の標的細胞である自己由来の一次標的細胞を使用することです。

また、エフェクター細胞数は単一細胞レベルで定量可能です。それでは、私の研究室の研究助手が、CD8陽性エフェクター細胞を単離する手順を実演します。まず、自家凍結保存されたPBMCを37 °Cのウォーターバスで融解し、次に最大50 mLの完全培地で細胞を洗浄します。

計数後、complete mediaを用いてpbmcを5 million cells/mLの濃度に希釈し、IL-2および目的のペプチドを培養液に添加します。次に、細胞懸濁液を1 mLずつ96ウェルプレートの各ウェルに播種します。3日間の培養後、上清の半分を新鮮なcomplete mediaに交換します。6日間の培養後、マルチチャンネルピペットを使用して細胞を滅菌リザーバーに移し、細胞の計数および洗浄を行います。

ペレットを分離バッファーを用いて50 million cells/mLの濃度で再懸濁し、14 mLラウンド底チューブ内でPBMCをhuman CD8陽性T細胞濃縮カクテル（50 µL/mL cells）とともに室温でインキュベートする。10分後、anti-CD8 IgG結合磁気粒子（150 µL/mL）を加え、さらに5分間インキュベートした後、分離バッファーを追加して細胞懸濁液を7 mLにする。チューブを分離マグネットにセットする。5分後、チューブをマグネットにセットしたまま、細胞を15 mLコニカルチューブに注ぐ。次に、細胞の少量を分注し、2% FBS添加PBS中でanti-CD3およびanti-CD8抗体を用いて4°Cで30分間染色する。

フローサイトメトリーにより、細胞の純度がCD8陽性95%以上であることを確認します。次に、5本のスクリューキャップチューブに完全培地を225 µLずつ加え、細胞を1:2から1:32まで段階的に希釈します。CD4陽性の標的細胞を単離するために、まず自己凍結保存末梢血単核細胞（PBMC）を37 °Cのウォーターバスで融解します。

解凍した細胞を、10 mLの培地が入った50 mLコニカルチューブに移します。実演した通りに磁気ビーズ分離法を用いてCD4発現T細胞を濃縮し、フローサイトメトリーによりCD4陽性T細胞の純度が95%以上であることを確認します。細胞数をカウントした後、2本の15 mLコニカルチューブに分注し、温めたPBSで洗浄します。その後、ペレットをPBSで20 million cells/mLの濃度で再懸濁します。

細胞を遮光条件下に置いた後、CD4陽性T細胞の半分を、最終濃度 0.2 millimolar に調整した調製直後のCFSE highワーキングソリューションで、もう半分を最終濃度 0.04 millimolar に調整した調製直後のCFSE lowワーキングソリューションで、37 °C、5% CO2条件下で15分間染色します。染色期間の終了後、細胞を遠心分離し、ペレットを1 milliliter の加温した完全培地に再懸濁して、標識反応を停止させます。CFSE lowのCD4陽性T細胞を、完全培地中にて目的ペプチドの最終濃度 5 µg/milliliter で、細胞培養インキュベーター内で45分間パルス刺激します。

インキュベーション後、CFSE高発現および低発現のT細胞集団をそれぞれ洗浄します。不完全培地で2回洗浄し、両方の細胞懸濁液を不完全培地を用いて1 mLあたり200,000 cellsとなるように再懸濁します。その後、CFSE高発現集団とCFSE低発現集団を1:1の比率で混合します。

次に、丸底96ウェルプレートの各ウェルに、混合したターゲットCD4陽性T細胞を100 µLずつ加えます。その後、各CD8陽性T細胞懸濁液を1 µLずつ、デュプリケートで播種し、最終的に1ウェルあたり200 µLの容量とします。基礎的なアポトーシスを測定するため、ターゲット細胞のみを3ウェルに播種し、その後、共培養系を細胞培養インキュベーターで6時間インキュベートします。インキュベーション完了後、細胞をV底96ウェルプレートに移し、PE標識ペプチドMHCテトラマーを用いて各ウェルを15分間染色します。

細胞培養インキュベーター内で、2% FBS添加PBSで細胞を洗浄し、洗浄後、遮光条件下で4°Cにて30分間細胞を染色します。再度、ペレットを100 µLのPBS希釈2% ホルムアルデヒドに再懸濁し、フローサイトメトリーで細胞を解析します。共培養後、これらのドットプロットに示されるように、細胞の解析およびゲーティングを行います。

未刺激またはペプチド刺激した生存CFSE high標的細胞とCFSE low標的細胞の比率を、前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）による小規模なゲートを用いて解析します。まず、Live/Dead陰性かつCD4陽性のT細胞でゲートを作成し、CFSEを用いてプロットして、CFSE low細胞とCFSE high細胞の比率を解析します。次に、死細胞および生細胞のエフェクター細胞と標的細胞の総数を算出するため、より広範囲なFSC/SSCゲートを作成します。6時間のインキュベーション後、CD8陽性かつテトラマー陽性のT細胞、およびCFSE lowのCD4陽性T細胞をプロットし、エフェクター細胞と標的細胞の比率を解析します。

次に、CD8陽性テトラマー陽性細胞でゲーティングし、エフェクターCD8陽性T細胞の総数を決定します。標的細胞の総数は、CD4陽性T細胞、CFSE low、および生細胞・死細胞の陽性および陰性細胞でゲーティングして決定します。CFSE low細胞に対するCFSE high細胞の標的比は1:1です。

CD4陽性の標的細胞をエフェクター細胞不在下で培養すると、この比率は劇的に低下します。CFSE low陽性のパルス細胞を、抗原特異的なCD8陽性エフェクターT細胞を含むCD8陽性T細胞集団全体と共にインキュベートした場合についてです。

比率が低下するにつれて、CFSE low CD4陽性ペプチド刺激標的細胞は、生死判定陽性になり始めます。エフェクター細胞を希釈することでCFSE比率が回復し、最終的に生存しているペプチド刺激CFSE low CD4陽性標的T細胞数が回復します。その後、特異的溶細胞率をエフェクター細胞対標的細胞比の関数として対数スケールでプロットできます。グラフに示されているように、プロットから線形回帰を算出し、近似曲線の式を用いて溶細胞単位を算出します。

これは、抗原特異的CD8陽性T細胞の固有の細胞溶解能を決定し、ドナー間で結果を比較するために、100万個の標的CD4陽性T細胞の30%を殺傷させるのに必要なCD8陽性エフェクターT細胞の数です。このビデオを視聴することで、サイトメトリーを用いて抗原特異的CD T細胞の細胞毒性活性を測定する方法について十分に理解できるはずです。この手法は、ご自身のT細胞タイプにも簡単に適用することが可能です。