Name: 細胞毒性活性を測定するための細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 学ぶ 細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイを用いて、抗原特異的CD8+T細胞の細胞傷害活性を測定する方法です。一次標的細胞を使用し、溶解単位を定量化することで、T細胞機能を正確に評価できます。

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この作業は、フロリダ州観光貿易経済開発局の支援を受けました。

1. エフェクターCD8+ T細胞の調製
<ol>
	<li>凍結凍結保存された自家PBMC(50 x 106細胞の2-3バイアル)を、液体窒素から37°Cの水浴に移すことにより解凍します。</li>
	<li>チューブを完全RPMI(4 mM L-グルタミン、100 U/mlペニシリンおよびストレプトマイシン、10% FBSを添加)で50 mLに充填して細胞を洗浄します。PBMCをカウントし、完全RPMIで細胞を5 x 106/mlの濃度で再懸濁します。</li>
	<li>特異的ペプチド(5 μg/ml)およびIL-2(10 ng/ml)をPBMCに添加します。</li>
	<li>96ディープウェルプレートで培養をセットし、各ウェルに1 mLの細胞懸濁液を播種します。</li>
	<li>3日間の培養後、細胞培養培地の半分を新鮮で完全なRPMIと交換します。</li>
	<li>6日間の培養後、マルチチャンネルピペットですべてのPBMCを回収し、無菌リザーバーに細胞を移します。</li>
	<li>PBMCを5 x 107/mlで14 mL丸底チューブの推奨分離バッファーでカウント、洗浄、再懸濁します。ヒトCD8+ T細胞濃縮カクテルを50 μl/ml細胞で添加します。混合し、室温で10分間インキュベートします。磁性粒子を150 μl/mLで添加し、5分間インキュベートします。</li>
	<li>分離バッファーを添加して、細胞懸濁液を最大7 mLにします。チューブを磁石に入れることにより、手つかずのCD8+ T細胞の免疫磁気分離に進みます。5分後、チューブを磁石に入れたまま、目的の細胞を新しい15 mLの円錐形チューブに注ぎます。少量のアリコートを取り、CD3およびCD8に対する抗体で細胞を1X PBS-2% FBSで4°Cで30分間染色します。その後、CD8+ T細胞の純度は、フローサイトメトリーを介して95%以上の期待純度で測定できます。</li>
	<li>CD8+ T細胞を450 μlに再懸濁し、完全RPMIで再懸濁します。</li>
	<li>225 μlの完全RPMIを5本のスクリューキャップチューブに加えます。</li>
	<li>225 μlのCD8+を次のチューブに移して、段階希釈液(1:2から1:32)を調製します(図1上部パネルを参照)。</li>
</ol>
2. 標的CD4+ T細胞の調製
<ol>
	<li>クライオバイアルを液体窒素から37°Cのウォーターバスに移すことにより、自家凍結保存されたPBMC(50 x 106細胞の1バイアル)を解凍します。</li>
	<li>細胞懸濁液を、10 mLのRPMIを含む50 mLの円錐形チューブに移します。</li>
	<li>細胞を洗浄し、PBMCを5 x 107 / mlで再懸濁し、分離バッファーを14 mLの丸底チューブに入れます。ヒトCD4+ T細胞濃縮カクテルを50 μl/ml細胞で添加します。混合し、室温で10分間インキュベートします。磁性粒子を100 μl/mlで添加し、室温で5分間インキュベー</li>トします。
	<li>分離バッファーを添加して、細胞懸濁液を最大7 mLにします。チューブを磁石に入れて、CD4+ T細胞の単離に進みます。5分後、チューブを磁石内に残したまま、目的の細胞を新しい15mlの円錐形チューブに注ぎます。少量のアリコートを取り、CD3およびCD4に対する抗体で細胞を1x PBS-2% FBSで4°Cで30分間染色します。その後、CD4+ T細胞の純度は、フローサイトメトリーを介して95%以上の期待純度で測定できます。</li>
	<li>CD4+ T細胞をカウントし、それらを2本の15 mLコニカルチューブに分割し、温かい1x PBSで洗浄します。</li>
	<li>温かいPBS中に0.4 μM CFSE高の作業溶液を調製します。</li>
	<li>10x CFSE高作業溶液の一部を温かいPBSで希釈することにより、0.04 μM CFSE低作業溶液を調製します。</li>
	<li>細胞を 20 x 106/mL の PBS で再懸濁し(CD4+ T 細胞の数が 10 x 106/ml 未満の場合は、0.5 mL の PBS に細胞を再懸濁します)、0.4 μM CFSE 高ワーキング溶液 (最終濃度 0.2 μM) を等量 1 個加えて CD4+ T 細胞の半分を染色します。例えば、1 mLの細胞に対して、1 mLのCFSEワーキング溶液を添加します。CD4+の残りの半分を、等量の0.04 μM CFSE低作動溶液(最終濃度0.02 μM)を1つ加えて染色します。細胞を37°C、5%CO2雰囲気中で15分間染色します。</li>
	<li>インキュベーション後、細胞を1,500 rpmで5分間ペレット化し、1 mLの温かい完全RPMIに再懸濁して標識反応をクエンチします。</li>
	<li>目的のペプチドを最終濃度5 μg/mlで完全RPMIに添加してCFSE低CD4+ T細胞をパルスし、5% CO2雰囲気、37°Cで45分間インキュベートします。</li>
	<li>CFSE高およびCFSE低CD4+ T細胞を完全RPMIで洗浄します。合計2回の洗浄を繰り返します。完全RPMI中に2×105細胞/mLの濃度で再懸濁します。</li>
	<li>2つのターゲット集団を1:1の比率(CFSE-High:CFSE-Low)で混合します(図1下のパネルを参照)。</li>
</ol>
3. コカルチャー
<ol>
	<li>CD8+ T細胞を希釈するごとに、100 μlを二重に播種し、丸底の96ウェルプレートに播種します。</li>
	<li>混合ターゲットCD4+ T細胞(100 μl)をエフェクター細胞の各希釈液に加え、最終容量を200 μlにします。</li>
	<li>基礎アポトーシスを測定するには、標的細胞のみで3つのウェルを播種します。</li>
	<li>共培養を5%CO2雰囲気中、37°Cで6時間インキュベートします。</li>
</ol>
4. フローサイトメトリーの染色と取得
<ol>
	<li>細胞をV底96ウェルプレートに移し、PE標識pMHC四量体で37°Cの5%CO2雰囲気中で15分間染色します。</li>
	<li>1x PBS-2% FBSで洗浄し、Far Red LIVE/DEAD固定死細胞、αCD3-Alexa700、αCD8-Percp、αCD4-Brilliant Violet 650で細胞を4°Cで30分間染色し、光から保護します。</li>
	<li>細胞を1x PBS-2% FBSで一度洗浄し、1x PBSに2%ホルムアルデヒドを入れた100 μlに再懸濁します。</li>
	<li>フローサイトメーターで細胞を採取します。</li>
</ol>

<ol><li>Appay, V., Van Lier, R. A. W., Sallusto, F., Roederer, M. Cytometry. 73, 975-983 (2008).</li>
<li>Betts, M. R., Harari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+function+of+protective+T+cell+immune+responses+in+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+HIV+AIDS%22%5BJournal%5D)">Phenotype and function of protective T cell immune responses in HIV.</a> Curr. Opin. HIV AIDS. 3, 349-355 (2008).</li>
<li>Roder, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+immunodeficiency+disorder+in+humans+involving+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells.</a> Nature. 284, 553-555 (1980).</li>
<li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J. Immunol. 171, 27-31 (2003).</li>
<li>Byers, A. M., Kemball, C. C., Moser, J. M., Lukacher, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+CTL+activity+by+polyoma+virus-specific+effector+and+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo CTL activity by polyoma virus-specific effector and memory CD8+ T cells.</a> J. Immunol. 171, 17-21 (2003).</li>
<li>Devevre, E., Romero, P., Mahnke, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LiveCount+Assay%3A+concomitant+measurement+of+cytolytic+activity+and+phenotypic+characterisation+of+CD8%28%2B%29+T-cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">LiveCount Assay: concomitant measurement of cytolytic activity and phenotypic characterisation of CD8(+) T-cells by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 311, 31-46 (2006).</li>
<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li>
<li>Mbitikon-Kobo, F. M., Bonneville, M., Sekaly, R. P., Trautmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+measurement+of+the+cytotoxic+capacity+of+human+primary+antigen-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ex vivo measurement of the cytotoxic capacity of human primary antigen-specific CD8 T cells.</a> J. Immunol. Methods. 375, 252-257 (2012).</li>
<li>Bryant, J., Day, R., Whiteside, T. L., Herberman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+lytic+units+for+the+expression+of+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Calculation of lytic units for the expression of cell-mediated cytotoxicity.</a> J. Immunol. Methods. 146, 91-103 (1992).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%28%2B%29+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8(+) T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li>
<li>Trautmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+metabolic%2C+functional%2C+and+cytolytic+differences+characterize+HIV-specific+CD8+T+cells+in+primary+and+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Profound metabolic, functional, and cytolytic differences characterize HIV-specific CD8 T cells in primary and chronic HIV infection.</a> Blood. 120, 3466-3477 (2012).</li>
<li>Hildemann, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Efficiency+of+Antiviral+CD4%28%2B%29+Killer+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High Efficiency of Antiviral CD4(+) Killer T Cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ここで説明するアッセイにより、CD8+ T細胞の主要な機能である細胞溶解活性の定量化が可能になります。以前の研究では、この機能と抗原特異的CD8 + T細胞のサイトカイン分泌との間の不一致が報告されているため、CD8 + T細胞のエフェクター機能を特徴付ける際には、この機能の正確な測定が最も重要です10,11。共培養インキュベーション時間が短く(6時間)、自家標的細胞を使用しているため、標的細胞の非特異的死滅率が低い。したがって、このアッセイは非常に特異的で信頼性があります。このアッセイは、さまざまな細胞サブセットを分析するために簡単に変更することもできます。エフェクターCD8+ T細胞は、 in vivo キリングアッセイ12で最近記載されたCD4+ T細胞などの他の細胞型に置き換えることができる。標的CD4+ T細胞は、標的細胞として自己B細胞を使用することについて以前に説明したように、他の細胞型に置き換えることもできます8。このシステムでは、抗原の起源も置き換えることができます。たとえば、標的細胞はペプチドでパルス化する代わりにウイルスに感染する可...

細胞溶解活性はCD8+ T細胞の主要な機能ですが、この目的で使用されるアッセイは煩雑で標準化が困難であるため、まだほとんど測定されていません。この機能の正確な測定は、CD8+ T細胞のエフェクター機能を特徴付ける際に最も重要であり、有効な細胞媒介性細胞毒性の信頼できる予測因子はまだ記載されていません1,2。ここでは、抗原特異的CD8+ T細胞の標的CD4+ T細胞上の細胞傷害活性を測定するための新しい機能アッセイを提案します。ゴールドスタンダードであるクロム放出アッセイの代替手段を提供するために、いくつかのアプローチが開発されています。ここでは、生きた標的細胞の死を測定する際の殺傷の全過程を明らかにする細胞ベースのアッセイを紹介します。この方法は、マウス4,5およびヒト6のin vitroでのフローサイトメトリーベースの細胞傷害性アッセイのプロトコルから導き出されました。このプロトコルでは、全CD8+ T細胞集団に含まれる抗原特異的CD8+ T細胞をエフェクター細胞として使用し、自家CD4+ T細胞を標的細胞として使用します。目的のエフェクターCD8+ T細胞をMHCI/ペプチド四量体7を用いて列挙する。標的細胞の死は、ペプチドをロード/ノンロードしたCD4+ T細胞の比率によって計算されます。我々は以前に、この方法が再現性があり、感度が高く、特異的であり、全CD8+ T細胞集団内のエフェクター細胞の数に依存しないことを示しました8。共培養アッセイにおけるエフェクター細胞と標的細胞の両方の数を列挙することにより、標的細胞を殺傷するCD8+ T細胞の内在的能力を計算し、溶解単位9で発現することができる。

<table><tbody><tr><td>EasySep ヒト CD4+ T 細胞濃縮キット</td><td>幹細胞</td><td>19052</td><td></td></tr><tr><td>EasySep ヒト CD8+ T 細胞濃縮キット</td><td>幹細胞</td><td>19053</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace CFSE 細胞増殖キット - フローサイトメトリー用</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>遠赤色 LIVE/DEAD 固定可能な死細胞</td><td>Invitrogen</td><td>L10120</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 マウス 抗ヒト CD3</td><td>BD</td><td></td><td></td>557943</tr><tr><td>ブリリアント バイオレット 650 抗ヒト CD4 抗体</td><td>バイオレジェン</td>ド <td>317435</td><td></td></tr><tr><td>PerCP 抗ヒト CD8 抗体</td><td>バイオレジェン</td>ド <td>344707</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 ミディアム 1x</td><td>VWR</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン 100x 溶液</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 - 金、熱不活性化</td><td>PAA</td><td>A15-252</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート;扱わ;Uボトム;蓋付き</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>25 ml 滅菌ポリスチレン、個別包装リザーバー</td><td>USA Scientific</td><td>2321-2230</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル U 底、滅菌 2 ml ディープウェルプレート</td><td>Thermo Scientific</td><td>275743</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-2 (v126)、研究グレード</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-096</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep バッファー、分離バッファー</td><td>幹細胞</td><td>20104</td><td></td></tr><tr><td>15 ml ポリプロピレン コニカル チューブ</td><td>BD ファルコン</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>14 ml 丸底チューブ、ポリプロピレン</td><td>BD ファルコン</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>ビッグ イージー イージーセップ マグネット</td><td>幹細胞</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>VWR</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>96-well;蓋付きV底プレート</td><td>Fisher</td><td>12-565-481</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド溶液、ACS 試薬、37 wt % in H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml スクリューキャップ マイクロチューブ、円錐形</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.005</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞毒性活性を測定するための細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

CD8+ T細胞の細胞溶解活性はめったに評価されません。ここでは、抗原特異的なCD8+ T細胞が同族ペプチドをロードしたCD4+ T細胞を殺す能力を測定するための新しい細胞ベースのアッセイについて説明します。標的CD4+ T細胞は2つの集団に分割され、2つの異なる濃度のCFSEで標識されます。一方の集団には目的のペプチドがパルス化され(CFSE-low)、もう一方の集団はパルス化されない(CFSE-high)こと。パルスCD4+ T細胞と非パルスCD4+ T細胞を同じ比率で混合し、精製したCD8+ T細胞の数を増やしてインキュベートします。ペプチド/MHCIテトラマー染色によって検出された抗原特異的エフェクターCD8+ T細胞を含むCD8+ T細胞との共培養後、自己標的CD4+ T細胞の特異的死滅をフローサイトメトリーで解析します。異なるエフェクター対ターゲット比で測定されたターゲットCD4+ T細胞の特異的溶解により、溶解単位であるLU30/106細胞の計算が可能になります。このシンプルでわかりやすいアッセイにより、CD8+ T細胞が標的CD4+ T細胞を殺傷する固有の能力を正確に測定できます。

図1の概略図に本アッセイのまとめを示します。精製したCD8+ T細胞（エフェクター細胞）を450 µlの完全RPMIで再懸濁し、225 µlのCD8+ T細胞を225 µlの培地を含む次のチューブに加えることで段階希釈を行いました（上段）。精製したCD4+ T細胞（標的細胞）をカウントして2本のチューブに分け、プロトコルに従って2つの異なる濃度のCFSE（高濃度および低濃度）で染色しました。CFSE-low CD4+ T細胞には目的のペプチドをパルスし、CFSE-high CD4+ T細胞はコントロールとして未負荷のままにしました。CFSE-highおよびCFSE-low CD4+ T細胞を2 x 105/mlで再懸濁し、1:1の比率で混合しました（下段）。混合したCD4+ T細胞を各ウェルに100 µlずつ播種しました。混合CD4+ T細胞を含む3つのウェルを、CD4+ T細胞単独のトリプリケート（赤色のウェル）として使用しました。残りの混合CD4+ T細胞を含むウェルに、各濃度のCD8+ T細胞希釈液100 µlをデュプリケートで添加しました（緑色のウェル）。6時間の共培養後、...

このプロトコルは、高感度の細胞ベースの細胞毒性アッセイについて説明しています。このアッセイは、エフェクターCD8+ T細胞の数が増加している場合の生標的CD4+ T細胞の頻度の減少を列挙することにより、抗原特異的CD8+ T細胞の細胞溶解活性の直接的な評価を可能にします。

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

この手順の全体的な目的は、細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイを用いて、抗原特異的CD8 T細胞の細胞毒性活性を測定することです。まず、目的のペプチド存在下でエフェクターCD8 T細胞を6日間増殖させます。次に、ターゲットとなるCD4 T細胞に目的のペプチドをパルスし、その後、未パルスCD4 T細胞と混合します。続いて、エフェクターCD8 T細胞とターゲットCD4 T細胞を、異なるエフェクター対ターゲット比で6時間共培養します。最終ステップとして、ペプチド負荷したターゲットCD4 T細胞の殺傷能およびエフェクターCD8 T細胞の数をフローサイトメトリーで定量します。最終的に、溶菌ユニット（lytic units）で表される抗原特異的CD8 T細胞の固有の殺傷能を算出することができます。この手法の、アロリリースアッセイ（aro release assay）のような手法に対する主な利点は、不死化細胞株ではなく、実際の標的細胞である自己由来の一次標的細胞を使用することです。また、エフェクター細胞数は単一細胞レベルで定量可能です。それでは、私の研究室の研究助手が、CD8陽性エフェクター細胞を単離する手順を実演します。まず、自家凍結保存されたPBMCを37 °Cのウォーターバスで融解し、次に最大50 mLの完全培地で細胞を洗浄します。計数後、complete mediaを用いてpbmcを5 million cells/mLの濃度に希釈し、IL-2および目的のペプチドを培養液に添加します。次に、細胞懸濁液を1 mLずつ96ウェルプレートの各ウェルに播種します。3日間の培養後、上清の半分を新鮮なcomplete mediaに交換します。6日間の培養後、マルチチャンネルピペットを使用して細胞を滅菌リザーバーに移し、細胞の計数および洗浄を行います。ペレットを分離バッファーを用いて50 million cells/mLの濃度で再懸濁し、14 mLラウンド底チューブ内でPBMCをhuman CD8陽性T細胞濃縮カクテル（50 µL/mL cells）とともに室温でインキュベートする。10分後、anti-CD8 IgG結合磁気粒子（150 µL/mL）を加え、さらに5分間インキュベートした後、分離バッファーを追加して細胞懸濁液を7 mLにする。チューブを分離マグネットにセットする。5分後、チューブをマグネットにセットしたまま、細胞を15 mLコニカルチューブに注ぐ。次に、細胞の少量を分注し、2% FBS添加PBS中でanti-CD3およびanti-CD8抗体を用いて4°Cで30分間染色する。フローサイトメトリーにより、細胞の純度がCD8陽性95%以上であることを確認します。次に、5本のスクリューキャップチューブに完全培地を225 µLずつ加え、細胞を1:2から1:32まで段階的に希釈します。CD4陽性の標的細胞を単離するために、まず自己凍結保存末梢血単核細胞（PBMC）を37 °Cのウォーターバスで融解します。解凍した細胞を、10 mLの培地が入った50 mLコニカルチューブに移します。実演した通りに磁気ビーズ分離法を用いてCD4発現T細胞を濃縮し、フローサイトメトリーによりCD4陽性T細胞の純度が95%以上であることを確認します。細胞数をカウントした後、2本の15 mLコニカルチューブに分注し、温めたPBSで洗浄します。その後、ペレットをPBSで20 million cells/mLの濃度で再懸濁します。細胞を遮光条件下に置いた後、CD4陽性T細胞の半分を、最終濃度 0.2 millimolar に調整した調製直後のCFSE highワーキングソリューションで、もう半分を最終濃度 0.04 millimolar に調整した調製直後のCFSE lowワーキングソリューションで、37 °C、5% CO2条件下で15分間染色します。染色期間の終了後、細胞を遠心分離し、ペレットを1 milliliter の加温した完全培地に再懸濁して、標識反応を停止させます。CFSE lowのCD4陽性T細胞を、完全培地中にて目的ペプチドの最終濃度 5 µg/milliliter で、細胞培養インキュベーター内で45分間パルス刺激します。インキュベーション後、CFSE高発現および低発現のT細胞集団をそれぞれ洗浄します。不完全培地で2回洗浄し、両方の細胞懸濁液を不完全培地を用いて1 mLあたり200,000 cellsとなるように再懸濁します。その後、CFSE高発現集団とCFSE低発現集団を1:1の比率で混合します。次に、丸底96ウェルプレートの各ウェルに、混合したターゲットCD4陽性T細胞を100 µLずつ加えます。その後、各CD8陽性T細胞懸濁液を1 µLずつ、デュプリケートで播種し、最終的に1ウェルあたり200 µLの容量とします。基礎的なアポトーシスを測定するため、ターゲット細胞のみを3ウェルに播種し、その後、共培養系を細胞培養インキュベーターで6時間インキュベートします。インキュベーション完了後、細胞をV底96ウェルプレートに移し、PE標識ペプチドMHCテトラマーを用いて各ウェルを15分間染色します。細胞培養インキュベーター内で、2% FBS添加PBSで細胞を洗浄し、洗浄後、遮光条件下で4°Cにて30分間細胞を染色します。再度、ペレットを100 µLのPBS希釈2% ホルムアルデヒドに再懸濁し、フローサイトメトリーで細胞を解析します。共培養後、これらのドットプロットに示されるように、細胞の解析およびゲーティングを行います。未刺激またはペプチド刺激した生存CFSE high標的細胞とCFSE low標的細胞の比率を、前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）による小規模なゲートを用いて解析します。まず、Live/Dead陰性かつCD4陽性のT細胞でゲートを作成し、CFSEを用いてプロットして、CFSE low細胞とCFSE high細胞の比率を解析します。次に、死細胞および生細胞のエフェクター細胞と標的細胞の総数を算出するため、より広範囲なFSC/SSCゲートを作成します。6時間のインキュベーション後、CD8陽性かつテトラマー陽性のT細胞、およびCFSE lowのCD4陽性T細胞をプロットし、エフェクター細胞と標的細胞の比率を解析します。次に、CD8陽性テトラマー陽性細胞でゲーティングし、エフェクターCD8陽性T細胞の総数を決定します。標的細胞の総数は、CD4陽性T細胞、CFSE low、および生細胞・死細胞の陽性および陰性細胞でゲーティングして決定します。CFSE low細胞に対するCFSE high細胞の標的比は1:1です。CD4陽性の標的細胞をエフェクター細胞不在下で培養すると、この比率は劇的に低下します。CFSE low陽性のパルス細胞を、抗原特異的なCD8陽性エフェクターT細胞を含むCD8陽性T細胞集団全体と共にインキュベートした場合についてです。比率が低下するにつれて、CFSE low CD4陽性ペプチド刺激標的細胞は、生死判定陽性になり始めます。エフェクター細胞を希釈することでCFSE比率が回復し、最終的に生存しているペプチド刺激CFSE low CD4陽性標的T細胞数が回復します。その後、特異的溶細胞率をエフェクター細胞対標的細胞比の関数として対数スケールでプロットできます。グラフに示されているように、プロットから線形回帰を算出し、近似曲線の式を用いて溶細胞単位を算出します。これは、抗原特異的CD8陽性T細胞の固有の細胞溶解能を決定し、ドナー間で結果を比較するために、100万個の標的CD4陽性T細胞の30%を殺傷させるのに必要なCD8陽性エフェクターT細胞の数です。このビデオを視聴することで、サイトメトリーを用いて抗原特異的CD T細胞の細胞毒性活性を測定する方法について十分に理解できるはずです。この手法は、ご自身のT細胞タイプにも簡単に適用することが可能です。

cell-based-flow-cytometry-assay-to-measure-cytotoxic-activity

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

細胞ベースのフローサイトメトリ法による細胞傷害活性の測定

このビデオは、がん細胞に対するサイトカイン誘導キラー(CIK)細胞の細胞傷害能力を測定するin...

サイトカイン誘導キラー細胞の細胞傷害性能を研究するためのIn vitroアッセイ

このビデオは、蛍光染色された標的細胞に対するナチュラルキラー細胞の溶解活性を示しています。この手法では、死細胞を染色し、フローサイトメーターを使用して生細胞と死細胞の標的細胞を定量することにより、NK細胞による細胞毒性の測定が可能になります。...

Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Flow Cytometric Analysis 用サンプル調製

このビデオでは、事前に活性化されたエフェクターT細胞によって誘導された癌細胞のアポトーシスアッセイを紹介しています。これらの細胞を蛍光核でマークされたがん細胞と共培養することにより、カスパーゼ切断可能な蛍光基質が添加されます。アポトーシスがん細胞は、核内で異なる色を示し、二重の蛍光を発します。この二重蛍光は、がん細胞がアポトーシスを受けていることを示しています。...

がん細胞に対する事前活性化CD8+ T細胞の細胞毒性を研究するためのIn vitroアッセイ

我々は、腫瘍標的細胞とインキュベートした場合、T細胞の細胞傷害活性を測定するための単一セルハイスループットアッセイが記載されている。この方法では、空間的に定義された比率で、T細胞と標的細胞を閉じ込めるために、サブナノリットルウェル（〜100,000ウェル/配列）の高密度、エラストマー配列を採用しており、エフェクター -...

T細胞の定量的なハイスループットシングルセル細胞毒性アッセイ

全血細胞毒性アッセイ（WCA）は、蛍光顕微鏡および自動化された画像処理をハイスループット細胞測位技術を組み込むことによって開発された細胞毒性アッセイである。ここでは、抗CD20抗体で処置したリンパ腫細胞の定量的な細胞傷害性分析を提供するために、ヒト全血中でリアルタイムに分析することができる方法について説明します。...

ヒト全血でのリアルタイム細胞毒性アッセイ

簡単かつ信頼性のある方法は、異なるNK細胞サブセット内の脱顆粒、サイトカインおよびケモカインの産生などNK細胞機能のセットを分析するために、ここで説明されています。...

NK細胞の機能を監視するためのサイトメトリーに基づくアッセイを流します

この研究は、ヒトの血液サンプル中のNK(Natural...

ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析

流れ cytometry ベースの人間のナチュラル...

ヒト NK 細胞活性の評価の流れのフローサイトメトリーを用いた細胞毒性の試金

ここでは、1つのT細胞とがん標的細胞を内包したダブルエマルジョン液滴を作製し、細胞死を1細胞レベルで調べる方法について述べる。この方法により、大規模なT細胞集団内の細胞傷害性分子と標的細胞のアポトーシスの両方を二重に定量できます。...

キメラ抗原受容体T細胞を単一細胞レベルで評価するための液滴ベースの細胞毒性アッセイ

このプロトコルは、生細胞イメージングとフローサイトメトリーを用いて、ヒトの自然なキメラ抗原受容体介在および抗体依存性細胞毒性を一貫して測定するための標準化された in vitro.

キメラ抗原受容体および治療用抗体によって増強されるNK細胞毒性の定量化:生細胞イメージングおよびフローサイトメトリー

学ぶ 細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイを用いて、抗原特異的CD8+T細胞の細胞傷害活性を測定する方法です。一次標的細胞を使用し、溶解単位を定量化することで、T細胞機能を正確に評価できます。

細胞毒性活性を測定するための細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ

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