Name: イメージング細胞膜の損傷および修復に関与する細胞内プロセス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-24T20:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 44 s
Description: 学ぶ細胞膜損傷修復におけるリソソーム外排とタンパク質動態の可視化法。蛍光色素とライブイメージングを用いて、傷害応答のカイネティクスを評価し、細胞傷害修復メカニズムの理解に貢献します。

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この作品は、フランスの筋ジストロフィー協会（AFM）によるADに健康補助金AR055686とAR060836およびポスドクの国立研究所によってサポートされていました。本研究で利用される細胞イメージング施設は、健康補助金HD040677の国立研究所によってサポートされています。

1。バルクを用いた撮像細胞膜修復（ガラスビーズ）創傷はこのプロトコルは、別々に負傷した細胞や治癒できないものをマークすることができます。 1：細胞のこれらの集団を定量化するには、次の3つの条件を使用する必要があります。試験（C1） -細胞のCa 2 +、2の存在下で修復させる。対照1（無損傷C2） -細胞のCa 2 +の存在下でインキュベートしたが、負傷していない、および3ている。コントロール2（なし修復C3） -細胞をCa 2 +の非存在下で修復することが許可されます。 <ol><li> 3無菌カバーガラス上で&gt; 50％コンフルエンスまで細胞を成長させ、シリコンO-リング上で37℃、転送カバーグラスPBSで37℃、およびC3で、CIMで二度C1とC2を洗う。 </li><li> C1とC2またはC3の上のPBS中のCIMにおける予め温めFITCデキストラン溶液100μlを加える。 </li><li>手動でバックカバースリップを傾けることによって穏やかに室温で、カバースリップ上に40mgのガラスビーズをロールC1およびC3上の形質膜を傷つけると30°の角度で前後6-8回。 注意：軽度の負傷のために、このように繰り返しの傷害を最小限に抑え、ガラスビーズが均一に分散していることを確認してください。サンプル間の損傷の再現性を向上させるために、同時に比較すべき異なるサンプルのガラスビーズ傷害を行う。 </li><li>ビーズのさらなる圧延を回避し、周囲のCO 2、37℃のインキュベーターにすべてカバースリップを転送し、修繕を5分間進行させる。 </li><li>ビーズが転動させることなく、37℃でCIM（C1及びC2）又はPBS（C3）で洗浄することによりガラスビーズおよびFITCデキストランを除去する</li><li>場所は、Oリングに戻ってカバースリップ、c3のC1とC2またはPBS中、CIM内の予め温めリジン固定可能TRITCデキストラン溶液100μlを加える。 </li><li>周囲CO 2で5分間37℃でインキュベートする。 </li><li>あらかじめ温めておいたCIMで二度カバース​​リップを洗浄し、室温で10分間、4％PFAで固定します。 </li><li> PBSで2回洗浄し、ヘキスト染料での室温で2分間インキュベートする。 </li><li>ウォッシュSAMPLエス回PBSで、落射蛍光顕微鏡を用いて実装培地および画像セルを用いてスライド上にマウントする。 </li><li>背景の赤と緑の染色強度を決定し、全ての試料（C1-C3）用の閾値赤と緑のチャンネルにこの値を使用するC2由来の細胞を使用する。 </li><li> A）グリーン（負傷し、修復さ）とb）の赤または赤と緑（負傷者の両方が、が、C1とC3のサンプルで）修復に失敗している細胞の総数を獲得。 </li><li>カウント&gt; 100緑の各条件や負傷者のすべてのセル（緑と赤）のパーセントとして、修復に失敗した細胞の割合を発現している細胞。 </li></ol> 2。レーザー損傷後の細胞膜修復の動態のライブイメージング<ol><li>あらかじめ温めておいCIMで細胞を洗浄した後、FM色素で、CIMにカバースリップを置く。 </li><li> 37℃に維持し、ステージトップインキュベーターでホルダーにカバースリップを配置</li><li>細胞膜1-2 mm 2の地域を選択し、のために照射&lt;;パルスレーザーで10ミリ秒。ピーク電力の40〜50％のソフトウェアを介してレーザパワーを減衰させる。最適な電力は、一貫性のことができますが、非致死傷害、これが使用されている個々の楽器や細胞株について、試行錯誤によって決定されなければならない。 </li><li>損傷前に開始し、エピ蛍光と明視野での修理、画像ごとに10秒を監視し、損傷後3〜5分間続行します。 注意：修理の制御のために、リピートをPBSで負傷した細胞は、FM色素を含有して2.1から2.4を繰り返します。 </li><li>修復の動態を定量するために、セルラFM色素の蛍光を測定し、画像化の過程強度（ΔF/F0）の変化をプロットする。このデータは、各条件で10年以上の細胞について平均し、必要に応じて、平均化したり、個々のセルの値としてプロットされるべきである。 </li></ol> 3。イメージング·バルク（ガラスビーズ）傷害誘導リソソームエキソサイトーシスサンプルは、&gt; 50％まで成長し、次の細胞が含まれる合流点：1。試験（C1） -のCa 2 +、2の存在下で修復させた細胞。対照1（C2、ノー損傷） - 細胞怪我もなく、一次抗体とインキュベートし、そして3もない。コントロール2（C;なし修復） - Ca 2 +の非存在下で修復することができた細胞。 <ol><li>洗浄は37℃でPBSを用いて37℃およびC3でCIMで二回C1及びC2をカバースリップシリコーンO-リング上に転送する。 </li><li> C3の上でC1とC2上のCIMにおける予め温めリジン固定可能TRITCデキストランのPBS中に100μlを加える。 </li><li>ステップ1.3のようにC1とC3に、細胞膜を傷つける。 </li><li>ビーズのさらなる圧延を回避し、周囲のCO 2、37℃のインキュベーターにすべてカバースリップを転送し、修繕を5分間進行させる。 </li><li>再び細胞にガラスビーズのないローリングを確保していない、冷たい増殖培地中でカバーグラスを洗浄することにより、ガラスビーズおよびTRITCデキストランを削除します。 </li><li>冷たい成長培地で2回カバースリップをすすぎ、Oリングに転送します。 </li><li> C1およびC3へコー​​ルド完全増殖培地中のラット抗マウスLAMP1抗体を100μlを加え、C2に寒さ、完全な増殖培地を追加します。 </li><li>抗体は4℃で30分間インキュベートしたカバーガラスを結合できるようにするには</li><li>冷たいCIMでカバーグラスを3回洗浄し、室温で10分間、4％PFAですべてカバースリップを修正して、CIMで3回すすいでください。 </li><li> RTで15分間溶液を遮断する100μlのすべてカバースリップをインキュベートする</li><li> 4℃でアレクサフルーア100μlの15分間488抗ラット抗体をすべてカバースリップをインキュベート</li><li> PBSで2回洗浄し、ヘキストでの室温で2分間インキュベートする。 </li><li> PBSで2回細胞を洗浄、エピ蛍光顕微鏡を用いた実装メディアやイメージを使用して、スライド上にマウントします。 </li><li> C2細胞の画像を用いて、赤色（TRITCデキストラン）で非特異的バックグラウンド染色を決定し、緑（アレクサフルーア488抗体）チャネルおよびスレッシュホールドに全てのサンプル（C1-C3）用の赤と緑のチャネルを、これらのバックグラウンド染色値を使用する。&lt;/李&gt; <li>負傷した細胞中のLAMP1染色（緑）の強度を測定するために、C1とC3から&gt; 100赤の標識された細胞を使用してください。成功した実験にはC3のセル内のランプ1染色はC1からの細胞よりも有意に低くなります。 </li></ol> 4。細胞膜損傷のライブイメージングは​​、細胞内の人身売買をトリガ<ol><li>蛍光標識 （リソソーム8用など CD63-GFP）または蛍光色素9を使用して、適切なレポーターをトランスフェクトすることにより、目的のコンパートメント。 </li><li>蛍光色素で標識リソソームについては、FITC-デキストランを含有する増殖培地中で50％コンフルエンスまで増殖させた細胞をインキュベート</li><li> CO 2インキュベーター中（目的の細胞株によるデキストランとの十分なエンドソーム標識に必要な以上）デキストランは2時間エンドサイトーシスすることができます。 </li><li>許可するように温めておいた増殖培地で細胞を洗浄して、CO 2インキュベーター内で2時間、その中に培養するすべてのリソソームに蓄積したデキストランをエンドサイトーシス。 </li><li>イメージングの前に、予め温め、CIM内のカバーガラスを洗浄し、37℃で、ステージトップインキュベーターにカバースリップホルダーに取り付ける</li><li> （細胞全体に動きのため）広視野またはTIRF（細胞表面およびエキソサイトーシスでの移動）イメージングを実施 - FITCデキストランラベルリソソームが混雑していない細胞は、個々のリソソームの動きとエキソサイトーシスを画像化するために理想的です。 </li><li>イメージング顕微鏡用TIRFレーザーを揃える：使用60Xまたは&gt; 1.45 NAの100X目標を。メーカーのアプローチを用いて入射全反射レーザー光に対する角度を設定します。 </li><li> 40〜50％の減衰でパルスレーザで、&lt;100ミリ秒のための小さい（1-2 mm 2）で領域を照射することにより、細胞膜を傷つける。 </li><li>目的の細胞におけるエキソサイトーシスの動態に応じて、少なくとも2分以上4-6フレーム/秒で負傷、画像セルをセルにリソソームの応答をモニターする。 </li></ol>

<ol><li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li>
<li>Togo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+plasma+membrane+stimulates+rearrangement+of+microtubules+and+lipid+traffic+toward+the+wound+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site.</a> Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).</li>
<li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2%2B-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li>
<li>Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbing+confers+resistance+against+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Blebbing confers resistance against cell lysis.</a> Death Differ. 18, 80-89 Forthcoming.</li>
<li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li>
<li>Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wound+repair+in+Drosophila+occurs+through+three+distinct+phases+of+membrane+and+cytoskeletal+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling.</a> Cell Biol. 193, 455-464 (2011).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+VII+restricts+fusion+pore+expansion+during+lysosomal+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis.</a> PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).</li>
<li>McNeil, P. L., Clarke, M. F., Miyake, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wound+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell wound assays.</a> Protoc. Cell Biol. Chapter 12, (2001).</li>
<li>McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+introduction+of+molecules+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct introduction of molecules into cells.</a> Protoc. Cell Biol. Chapter 20, (2001).</li>
<li>Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).</li>
<li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li>
<li>Benink, H. A., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentric+zones+of+active+RhoA+and+Cdc42+around+single+cell+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds.</a> Cell Biol. 168, 429-439 (2005).</li>
<li>Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+constitutive+exocytosis+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Cell Biol. 149, 23-32 (2000).</li>
<li>Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((docking+and+exocytosis+of+single+secretory+granules+in+live+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells.</a> 388, 474-478 (1997).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaiswal%2C+JK+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , Wiley and Sons Inc. 4.12.1-4.12.15 (2003).</li>
<li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+events+at+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging single events at the cell membrane.</a> Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

インビボでの細胞膜傷害は、これらを模倣するために開発された生理学的ストレスおよびいくつかの実験的アプローチの種々発生する。これらの皿を、それらを掻き落としたり、狭い穴の注射器9,10を通じて継代することにより接着細胞の細胞膜を傷つけています。このような傷害後の細胞を懸濁液で治癒し、それらが正常組織中でそうであるように、細胞外マトリックスに接着されていない。このような生体力学的傷害5 に模倣されないように、コレステロールなどの脂質を抽出することにより、化学的には、ALTER細胞膜孔形成毒素の使用など、まだ他のもの。このように、細胞損傷のために使用される方法は、修復応答について学ぶことができるかに影響することがあります。これは、細胞傷害アッセイの選択だけでなく、注意を行使するだけでなく、より良好なインビボでの機械的傷害を模倣するアプローチを選択する必要がある。このようなアプローチは、細胞の単層が負傷しているスクラッチ損傷が含まれる（メスまたは針）とガラスビーズの損傷（損傷が付着した細胞寝返りガラスビーズによって引き起こされる...

細胞膜は、細胞と細胞外環境との間の障壁を提供することで、細胞の完全性を維持します。正常な生理的しきい値だけでなく、侵入する病原体の存在を超えて、化学的、電気的、または機械的刺激は、細胞膜への傷害におけるそれぞれの結果とは、この傷害を修復するために、その後の細胞応答を誘発することができます。細胞膜へのこれらの損傷に耐えるために、細胞を修復するための効率的なメカニズムを有する。このメカニズムは、カルシウム依存性であり、他の中のようなアネキシンやMG53のようなタンパク質の細胞内輸送だけでなく、このような怪我を細胞膜1-7エンドソーム、リソソーム、ゴルジ派生小胞やミトコンドリアなどの細胞内区画を必要とする。しかし、損傷した細胞膜の修復に関与する分子および細胞内イベントのシーケンスの詳細はよくわかっていないままです。 細胞の修復応答は、耳の中に分離され得るLY及び後期応答。分の時間スケールに数秒以内に起こる初期の応答は、成功した細胞修復または細胞死に至る後期応答の性質を決定するのに途方もなく重要である。バルク生化学的および細胞分析に基づいて、エンドポイントアッセイは、修理中の分子や細胞プロセスの関与を確立に貢献している。しかし、原因細胞修復応答の不均一性及び迅速性のために、エンドポイントアッセイは、修理に至る一連の事象の運動および空間の詳細を提供することができない。細胞膜の制御された傷害を有効にして、細胞膜の修復と高い空間分解能と時間分解能で、関連する細胞内応答を監視できるようなアプローチは、理想的には、そのような研究に適しています。ここで、そのようなアプローチが提示されている。プロトコルの二つは、細胞膜修復のリアルタイム動態およびレーザinjの次の生細胞における修復過程に関連付けられている細胞内応答をモニターするためのアプローチを記載ユリィ。これらの生細胞イメージングに基づくアッセイを補完するものとして、エンドポイントアッセイはまた、個々の細胞および関連する細胞内応答のモニタリング修復のための集団ベースの測定を提供するが記載されている。これらのアプローチは、細胞膜の損傷に応答して輸送およびリソソームのエキソサイトーシスをモニターするために使用されているそれらの有用性を実証する。

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H1387</td><td>CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)</td></tr> <tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP410</td><td>CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+pH 7.4)</td></tr> <tr><td>FITC デキストラン (リジン固定可能)</td> <td>Invitrogen</td><td>D1820</td><td>2 mg/ml in CIM or PBS</td></tr><tr><td>ガラスビーズ</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr> <tr><td>の調製に使用TRITC デキストラン (リジン固定可能)</td><td>Invitrogen</td><td>D1818</td><td>2 mg/ml in CIM or PBS</td></tr><tr><td>PFA 16%</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>4% in PBS</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1/10 000 in PBS</td></tr><tr><td>FM dye</td><td>Invitrogen</td><td>T3163</td><td>1 & micro;g/&micro;l CIM または PBS</td></tr><tr><td>FITC デキストラン</td><td>Sigma</td><td>FD40S</td><td>2 mg/ml 中 増殖培地</td></tr><tr><td>LAMP1&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-19992</td><td>1/300 in growth medium</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21470</td><td>1/500 in blocking solution</td></tr><tr><td>封入剤</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher</td><td>12-545-86</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底 petridish</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>シリコンOリング</td><td>Bellco</td><td>1943-33315</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップホルダー</td><td>Bellco</td><td>1943-11111</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>A-7816</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>12001-566</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>MP1400-500H</td><td>成長培地に使用:10% FBS、DMEMペ</td></tr><tr><td>ニシリン/スレプトマイシン</td><td>VWR</td><td>12001-350</td>の1% P/S <td>成長培地に使用:10% FBS、DMEMの1% P/S</td></tr><tr><td>鶏血清</td><td>シグマ</td><td>C5405</td><td>CIM中の5%鶏血清は、免疫染色中の溶液をブロックするために使用されます</td></tr><tr><td>PBS(Ca2+およびMg2+フリー)</td><td>VWR</td><td>12001-664</td><td></td></tr><tr><td>落射蛍光顕微鏡</td>オ<td>リンパスアメリカ、PA</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>TIRFイルミネーター&nbsp;</td><td>オリンパスアメリカ、PA</td><td>Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)</td><td></td></tr><tr><td>落射蛍光照明</td>器 <td>Sutter Instruments, Novato CA</td><td>Lambda DG-4 (DG-4 30)</td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Photometrics, Tucson, AZ</td><td>Evolve 512 EMCCD&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>画像取得・解析ソフトウェア</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. デンバー, コロラド州</td><td>Slidebook 5</td><td></td></tr><tr><td>Pulsed laser</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. デンバー, コロラド州</td><td>Ablate (3iL13)</td><td></td></tr><tr><td>ステージトップインキュベーター</td><td>東海hit, 日本</td><td>INUBG2ASFP-ZILCS</td><td></td></tr></tbody></table>

イメージング細胞膜の損傷および修復に関与する細胞内プロセス

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

癒すために傷ついた細胞の能力は、基本的な細胞プロセスですが、治癒損傷細胞に関与する細胞および分子メカニズムはほとんどわかっていない。ここでアッセイは、局所的な損傷後の培養細胞の治癒能力および速度を監視するために記載されている。第一のプロトコルは、同時に数百の細胞の細胞膜修復能を評価するためのエンドポイントベースの手法を記載している。第二のプロトコルは、パルスレーザによる局所的な損傷後の個々の細胞における細胞膜修復の動態をモニ​​ターするリアルタイム画像化のアプローチを記載する。治癒負傷した細胞が損傷部位に特異的なタンパク質と細胞内コンパートメントの輸送を伴うように、第3のプロトコルが同時に負傷した細胞の何百ものそのような人身売買のイベント（リソソームエキソサイトーシス）を評価するには、上記のエンドポイントベースのアプローチを使用し、最後のプロトコルについて説明TIRFのミクロスと共にパルスレーザー傷害の使用を記載高い空間分解能と時間分解能で負傷した細胞では、個々の細胞内コンパートメントのダイナミクスを監視するためのコピー。ここプロトコルは、培養筋細胞における細胞膜の修復およびリソソームのエキソサイトーシスの間のリンクを調べるため、これらのアプローチの使用を記載しているが、それらは、他の接着性の培養細胞と、選択した細胞内コンパートメントにそのまま適用することができる。

単一細胞イメージングのためにここで説明するプロトコルは、細胞膜修復（プロトコール1及び2）、修復中のリソソームの細胞内輸送および融合（プロトコル3および4）の能力および速度を監視することである。 プロトコル1は、すべての傷ついた細胞をマークし、修復に失敗したものが負傷細胞を同定することができますバルクアッセイを示す。無傷細胞（ 図1A）は、非標識のままで、図1で示す結果は、FITCデキストランの存在下でガラスビーズにより損傷した細胞（ 図1Bおよび1C）緑色に標識される。細胞はCa 2 +を負傷した（緑色）のほとんどの存在下で修復させると細胞が修復するために管理し、TRITCデキストラン（ 図1B）によって（赤）マークされていません。細胞を、Ca 2 +の非存在下で修復させると、損傷した細胞の多くはまた、TRITCデキストラン（Fi様赤色...

治癒損傷した細胞の処理は細胞膜の損傷部位に特異的なタンパク質および細胞内コンパートメントの輸送を伴う。このプロトコルは、これらのプロセスを監視するためのアッセイを説明しています。

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

本実験の全体的な目的は、目的の処理が損傷細胞の修復に及ぼす影響を観察し、損傷細胞の修復を助ける細胞内プロセスを研究することです。これは、完全な細胞膜を通過できない蛍光染料の存在下で細胞を損傷させ、損傷細胞がこれらの染料の浸入を阻止する能力およびそのキネティクスを評価することによって達成されます。次なるステップとして、損傷した細胞膜における細胞内タンパク質の出現をモニタリングし、目的の細胞内コンパートメントが損傷細胞膜に融合することで修復に寄与する能力を特定します。次に、損傷の速度論をモニタリングするため、標的となる細胞内コンパートメントと損傷した細胞膜との融合を観察します。このコンパートメントの誘導融合の結果、損傷した細胞表面におけるlysosome associated membrane protein 1の出現増加と、損傷細胞によるリソソーム内容物の分泌のライブイメージングに基づき、細胞膜損傷の修復がリソソームのエキソサイトーシスに関連していることが示されました。これらの手法は、細胞の損傷と修復における重要な課題を解明するのに役立ちます。例えば、これらを用いて、細胞膜の局所的な損傷に対してどのタンパク質や細胞内コンパートメントが反応するかを特定し、その反応のキネティクスを評価することができます。本手順の実演を行うのは、私の研究室のポストドクターであるAurelia D fourとhamma stra twoです。治癒した損傷細胞と治癒しなかった損傷細胞を個別に標識します。3つの実験条件に合わせて、細胞を滅菌済みのカバースリップに播種します。細胞が50%以上のコンフルエンスに達するまで培養し、C1とC2を37 °CのCIMで2回洗浄します。C3は37 °CのPBSで洗浄します。次に、カバーガラスをシリコンOリング上に移動させます。適切なバッファーで予熱したfitzy dextran溶液を100 µL加えます。室温でカバーガラス上に40 mgのガラスビーズを加え、カバーを手動で傾けることで、C1およびC3の細胞膜を損傷させます。軽度の損傷を与えるため、30度の角度で6〜8回往復させます。ガラスビーズが均一に分散していることを確認し、損傷の繰り返しを最小限に抑えることで、サンプル間の損傷の再現性を向上させます。比較対象となる異なるサンプルのガラスビーズによる損傷操作は、ビーズのさらなる転がりを避けるため、同時に行います。すべてのカバーガラスを、周囲のCO2濃度に設定した37°Cのインキュベーターに移し、ビーズを転がさないように注意しながら、5分間修復を進行させます。バッファーまたはPBSで洗浄し、ガラスビーズとフィッツィデキストランを除去します。次に、カバーガラスをOリングの上に戻し、あらかじめ温めておいた100 µLのリシンを添加します。固定可能なトリジーデキストラン溶液を用い、周囲のCO2条件下で37°Cで5分間インキュベートします。カバースリップをあらかじめ温めておいたCIMで2回洗浄し、PBSで2回洗浄した後、4% PFAを用いて室温で10分間固定します。Hersch染料で2分間インキュベートし、PBSで2回洗浄した後、封入剤を用いてサンプルをスライドガラスに封入します。次に、C2サンプルを用いて、エピ蛍光顕微鏡で細胞をイメージングします。背景の赤色および緑色の染色強度を決定してください。その後、この値を閾値として、すべてのサンプルの赤色および緑色チャンネルに適用します。緑色に染まっている細胞の総数をスコアしてください。また、CサンプルおよびC3サンプルにおいて、赤色または赤色と緑色の両方に染まっている細胞をスコアしてください。次に、各条件で緑色の損傷細胞を100個以上カウントし、修復に失敗した細胞の割合を、全損傷細胞に対するパーセントとして算出して下さい。50%以上のコンフルエンスまで成長した細胞を、あらかじめ温めておいたCIMで洗浄し、FM色素を含むCIMを用いてカバーガラスをマウントします。37°Cに維持されたステージトップインキュベーター内のホルダーに設置してください。一貫したが致死的な影響を与えない最適な出力を用いて、細胞膜の領域を選択します。これを達成するために、パルスレーザーを用いてサンプルを10ミリ秒未満照射します。ソフトウェアを通じてレーザー出力をピークパワーの40〜50%に減衰させ、損傷前から損傷後の3〜5分間まで、2〜10秒ごとにエピ蛍光、蛍光、および明視野でモニタリング、修復、および画像取得を行います。修復のキネティクスを定量化するために、細胞のFM色素蛍光を測定します。イメージング過程における強度の変化を算出します。各条件で10個以上の細胞のデータを平均化し、平均値または個々の細胞の値としてプロットしてください。C oneおよびC twoのカバーガラスを洗浄します。37 °CでCIMを用いて培養準備を行い、37 °CのPBSでC3を洗浄します。その後、サンプルをシリコンOリング上に移します。あらかじめ温めておいた100 µLのリシン固定化トリスデキストランを加えます。先に示したように、C1およびC3の細胞質膜を損傷させます。その後、ビーズがさらに転がらないように注意しながら、すべてのカバーガラスを周囲CO2濃度の37 °Cインキュベーターに移し、5分間修復を進行させます。次に、ガラスビーズとFicoll dextranを除去するため、カバースリップを冷たい増殖培地で洗浄します。この際、ガラスビーズが細胞上を転がらないように注意してください。カバースリップを冷たい増殖培地で2回すすぎ、OリングのC1およびC3へ移します。冷たい完全増殖培地で調製した100 µLのラット抗-US lamp 1抗体を加え、C2にも冷たい完全増殖培地を加えて抗体の結合を促します。冷たいCMで3回洗浄した後、カバースリップを4 °Cで30分間インキュベートします。すべてのカバーガラスを4% PFAで室温にて10分間固定します。その後、CIMで3回洗浄します。次に、すべてのカバーガラスを100 µLのブロッキング溶液で15分間インキュベートし、続いて100 µLのAlexa Fluor 488抗ラット抗体で15分間インキュベートします。PBSで2回洗浄し、さらに2回のPBS洗浄後、HER stainを用いて室温で2分間インキュベートします。サンプルをスライドにマウントし、C2細胞の画像を用いて落射型蛍光顕微鏡で撮影します。赤色および緑色チャンネルにおける非特異的なバックグラウンド染色を決定します。これらの背景染色値を、すべてのサンプルのレッドチャンネルおよびグリーンチャンネルの閾値として使用します。C1およびC3から得られた100個以上のレッドラベル細胞を用いて、損傷細胞におけるLamp1染色の強度を測定します。実験が成功していれば、C3のLamp1染色細胞の強度は、C1の細胞よりも有意に低くなります。蛍光色素によるリソソームのラベル付けを行うには、fitc-dextranを含む増殖培地中で、コンフルエンスが50%になるまで細胞を培養し、インキュベートします。デキストランを細胞培養インキュベーター内で2時間エンドサイトーシスさせます。あらかじめ温めておいた増殖培地で細胞を洗浄し、CO2インキュベーター内で2時間インキュベートして、イメージング前にエンドサイトーシスされたすべてのデキストランがリソソームに蓄積するようにします。カバースリップをあらかじめ温めておいたCIMで洗浄し、37 °Cのステージトップインキュベーター上のカバースリップホルダーにCIMを用いて固定します。イメージングのために、fitzy dextranで標識されたリソソームが密集していない細胞を選択します。個々のリソソームの移動とエキソサイトーシスを観察します。細胞全体におけるリソソームの移動について、ワイドフィールド画像を撮影します。あるいは、細胞表面での移動を確認し、エキソサイトーシスをモニターするためにターフ画像を取得します。前述のように、放射線照射によって細胞膜を損傷させ、細胞傷害に対するリソソームの反応をモニターします。目的とする細胞のエキソサイトーシスのダイナミクスに応じて、1秒あたり4〜6フレームの速度で少なくとも2分間、またはそれ以上の時間、細胞をイメージングします。このバルクアッセイでは、すべての損傷細胞が標識され、修復に失敗した細胞が特定される一方で、損傷していない細胞は未標識のままとなります。fitzy dextran存在下でガラスビーズにより損傷を受けた細胞は、カルシウム存在下で修復させた場合に緑色に標識されます。細胞を修復させた場合、損傷した細胞のほとんどは修復に成功し、trissy dextranでは標識されません。カルシウムが存在しない場合、損傷した細胞のほとんどはtrissy dextranによって赤色に標識されます。この実験では、細胞内へのFM色素の流入をモニタリングすることにより、細胞膜修復のキネティクスを評価します。FM色素でインキュベートした際、正常な細胞では細胞内染色はほとんど、あるいは全く見られません。細胞膜に局所的なレーザー損傷を与えると、FM色素が細胞内に入り込み内膜に結合し始めるため、FM色素の蛍光が急激に増加します。これは、レーザー損傷後の細胞膜の修復能がカルシウムに依存しているためです。カルシウムが存在する状態で損傷を受けた細胞は修復が可能であり、これにより損傷後1分以内にFM染料の進入が停止します。対照的に、カルシウムがない状態で修復を試みた細胞は修復に失敗し、その結果、染料が進入し続け、損傷から4分後でもFM染料の蛍光が連続的に増加します。したがって、細胞膜の修復はFM染料染色のプラトー（飽和状態）へと導きます。細胞膜の修復機能が欠如していると、染料が継続的に流入し、プラトーに達しません。バルクガラスビーズによる損傷手法を用いることで、損傷に応答した小胞やタンパク質の細胞表面への転移をモニタリングすることができます。ここでは、トリシィデキストラン存在下で細胞に損傷を与えます。したがって、損傷していない細胞は赤色に標識されませんが、損傷したすべての細胞は赤色に標識されます。なお、一次抗体で処理されていない未損傷の細胞では、細胞表面のLAMP1の標識はバックグラウンドレベルであることをに留意してください。しかし、細胞が損傷し、カルシウム存在下で回復させると、リソソームがエキソサイトーシスを起こすため、損傷した細胞の表面でLAMP1の染色のレベルが上昇します。この細胞表面におけるLamp1標識の増加は、カルシウム不在下で治癒させた細胞では大幅に低くなります。したがって、細胞表面のLamp1染色の強度が強い細胞の数を定量すること、および損傷を受けた個々の細胞における細胞表面のLamp1染色のレベルを測定することの両方が、損傷によって誘発されるリソソームエキソサイトーシスを行う細胞能力の指標となります。この実験では、個々のリソソーム融合のキネティクス、性質、および場所を直接的にモニタリングします。細胞膜損傷への応答として、パルスレーザーで細胞を損傷させ、細胞表面のリソソームをTurfイメージングで撮影することで、個々の細胞における損傷誘発性リソソームエキソサイトーシスのモニタリングが可能になります。この図では、左パネルに位相差イメージング、中央パネルにTurf顕微鏡法で可視化した細胞を示しています。右側のパネルは、損傷から105秒後の同一細胞のターフ画像を示しています。ここでは、損傷によってリソソームが細胞膜へリクルートされ、それに続いてエキソサイトーシスが起こる様子が示されています。このリソソームは、損傷前のターフ画像では見えませんが、損傷後に細胞膜に到達し、検出可能になります。小胞が細胞膜に近づくにつれ、TURF照明による励起が強まり、リソソーム内のfitzy DExTストランドの蛍光が最大値に達します。融合孔が開くと、リソソーム内のpHが中和され、それによってfitzy DExTストランドの蛍光の消光が解除されます。続いて、DExTストランドが小胞から細胞外へ放出されるため、ZI蛍光が側方に拡散し、小胞の蛍光が徐々に減少します。これにより、リソソームのさまざまな損傷誘発反応を測定することが可能です。このビデオを視聴することで、細胞が大きな局所的損傷から回復する能力をモニタリングする方法、および修復プロセスに反応し、それを促進する細胞内コンパートメントやタンパク質をモニタリングする方法について十分に理解できるはずです。さらに、異なるタグを用いたバイタルラベル標識、コンパートメント、またはタンパク質を用いた実験を行うことで、損傷への反応やIND細胞の修復への関与をモニタリングすることが可能です。

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