イメージング細胞膜の損傷および修復に関与する細胞内プロセス

次の実験の全体的な目標は、損傷した細胞の修復に対する望ましい治療の効果を観察し、損傷した細胞の修復に役立つ細胞内プロセスを研究することです。これは、無傷の細胞膜を通過できない蛍光色素の存在下で細胞を損傷させることで、損傷した細胞の動態とこれらの色素の侵入を防ぐ能力を評価することによって達成されます。第2のステップとして、損傷した細胞膜での細胞内タンパク質の出現をモニターし、損傷した細胞膜に融合することにより、目的の細胞コンパートメントが修復に関与する能力を特定します。

次に、損傷の動態を監視するために、目的の細胞コンパートメントと損傷した細胞膜との融合を監視します。このコンパートメントの誘発融合の結果が得られ、細胞膜損傷の修復は、リソソーム関連膜タンパク質の増加した出現、損傷した細胞表面での1つ、および損傷した細胞によるリソソーム内容物の分泌のライブイメージングに基づくリソソームエキソサイトーシスに関連していることが示されています。これらの方法は、細胞の損傷と修復における重要な問題に対処するのに役立ちます。

例えば、これらを使用して、どのタンパク質や細胞コンパートメントが細胞膜の限局性損傷に反応するかを決定し、その応答の動態を評価することができます。その手順を実演するのは、私の研究室のポスドク研究員であるAurelia D fourとhamma stra 2です。治癒した細胞と治癒しなかった細胞を別々にマークします。

3つの実験条件の滅菌カバースリップに細胞を播種します。細胞を50%以上のコンフルエンスに達するまで培養し、次にC 1とC 2をCIMで37°Cで2回洗浄します。C3をPBSで摂氏37度で洗います。

次に、カバースリップをシリコンOリングに転送します。100マイクロリットルの予温したfitzyデキストラン溶液を適切な緩衝液に加えます。.C oneとC3の原形質膜を傷つけるには、室温でカバースリップに40ミリグラムのガラスビーズを追加し、手動でカバーを傾けます。

軽傷の場合、30度の角度で6〜8回前後に滑ります。ガラスビーズが均一に広がっていることを確認し、繰り返しの損傷を最小限に抑えて、サンプル間の損傷の再現性を向上させます。比較する異なるサンプルのガラスビーズ損傷を同時に実行し、ビーズのさらなる転がりを避けます。

すべてのカバースリップを周囲CO2の摂氏37度のインキュベーターに移し、ビーズを転がさずに5分間修理を進めます。ガラスビーズとフィットしたデキストランをバッファーまたはPBSで洗浄して取り除きます。次に、カバースリップをOリングに戻し、100マイクロリットルの予温リジンを追加します。

固定可能なトリッシーデキストラン溶液 室温CO2で摂氏37度で5分間インキュベートします。カバースリップをプレウォームCIMで2回洗浄し、PBSを2回洗浄した後、室温で4%PFAで10分間固定します。Hersch色素で2分間インキュベートし、PBSを2回洗浄した後、封入剤を使用してサンプルをスライドにマウントします。

次に、C 2サンプルから落射蛍光顕微鏡を使用して細胞をイメージングします。背景の赤と緑の染色強度を決定します。次に、この値を使用して、すべてのサンプルの赤と緑のチャンネルをしきい値にします。

緑色のセルの総数を採点します。また、C 1 サンプルと C3 サンプルで赤または赤と緑の両方のセルをスコアリングします。次に、各状態について100を超える緑色の負傷した細胞を数え、修復に失敗した細胞の割合を損傷した全細胞の割合として表します。

50%以上まで増殖した細胞を事前に警告されたCIMで洗浄し、FM染料でCIMにカバースリップをマウントします。ステージトップインキュベーターのホルダーには、摂氏37度に維持されています。最適な力を使用して細胞膜の領域を選択し、一貫性がありながらも致死的ではない損傷を可能にします。

これを達成するには、パルスレーザーでサンプルを10ミリ秒未満照射します。ソフトウェアを介してレーザー出力をピーク出力の40〜50 %に減衰させて、損傷前に開始し、損傷後3〜5分間継続するエピ、蛍光、明視野で2〜10秒ごとに画像を監視、修復、取得します。修復の動力学を定量化するには、細胞FM色素の蛍光を測定します。

イメージングの過程で強度の変化を計算します。各条件の 10 個を超えるセルのデータを平均化し、平均化されたセル値または個々のセル値としてプロットします。C 1とC 2のカバースリップを洗います。

CIMで37°Cで培養し、C3をPBSで37°Cで洗浄します。次に、サンプルをシリコンOリングに移します。100マイクロリットルの温冷リジン固定可能なトリッシーデキストランを追加します。.

前述したように、C oneとC3の原形質膜を傷つけます。その後、ビーズのさらなる転がりを避けます。すべてのカバースリップを周囲CO2の摂氏37度のインキュベーターに移し、修理を5分間進行させます。

今ガラスビーズとTrixie dextranを取り外すには、細胞上のガラスビーズの転がりがないことを確認し、冷たい成長培地でカバースリップを洗います。カバーを冷間成長培地で2回すすぎ、Cリング1とC3のOリングに移します。100マイクロリットルのラット抗USランプ1抗体を低温完全増殖培地に添加し、低温完全増殖培地をC 2に添加して抗体結合を可能とします。カバースリップを冷やしたCIMで3回洗浄した後、摂氏4度で30分間インキュベートします。

すべてのカバースリップを4%PFAで室温で10分間固定します。その後、CIMで3回すすぎます。次に、すべてのカバースリップを100マイクロリットルのブロッキング溶液で15分間インキュベートし、続いて100マイクロリットルのofor、4 88抗ラット抗体を15分間インキュベー

PBSで2回洗浄し、PBSを2回洗浄した後、室温で2分間彼女の染色物でインキュベートします。サンプルをスライドにマウントし、C細胞2個の画像を使用して、エピ蛍光顕微鏡を使用してサンプルをイメージングします。赤と緑のチャンネルの非特異的なバックグラウンド染色を特定します。

これらのバックグラウンド染色値を使用して、すべてのサンプルの赤と緑のチャンネルをスレッショルド化します。C oneおよびC3の100個以上の赤色標識細胞を使用して、損傷した細胞におけるlamp oneの染色強度を測定します。成功した実験では、C3から細胞を染色するlamp oneは、蛍光色素でリソソームを標識するためのC oneからの細胞よりも有意に低くなります

デキストランを細胞培養インキュベーターで2時間エンドサイトースさせます。細胞をPrewarm増殖培地で洗浄し、CO2インキュベーターで2時間インキュベートして、イメージング前にすべてのエンドサイトースデキストランがリソソームに蓄積することを確認します。カバースリップをPrewarm CIMですすぎ、CIMをステージトップインキュベーターのカバースリップホルダーに37°Cで取り付けます。

イメージング用のリソソームで標識された固まったfitzyデキストランを持たない細胞に選択します。個々のリソソームの運動とエキソサイトーシス。細胞全体のリソソームの動きについて広視野画像を取得します。

細胞表面での動きとエキソサイトーシスのモニタリングのために、芝の画像を交互に取得します。先に示したように照射により細胞膜を損傷し、細胞損傷画像細胞に対するリソソームの応答を、目的の細胞におけるエキソサイトーシスの動態に応じて、少なくとも2分間以上、少なくとも2分間またはそれ以上監視します。このバルクアッセイでは、損傷した細胞はすべてマーキングされ、修復に失敗した細胞が特定されますが、損傷していない細胞は標識されないままです。

適性のあるデキストランの存在下でガラスビーズによって損傷した細胞は、カルシウムの存在下で細胞が修復されることが許可されると緑色にラベル付けされます。損傷した細胞のほとんどは修復に成功し、細胞が修復を許可されているときにトリッシーデキストランによってマークされません。カルシウムがない場合、損傷した細胞のほとんどもトリッシーデキストランによって赤くラベル付けされます。

この実験では、細胞内へのFM色素の侵入を監視することにより、細胞膜修復の動態を評価します。FMダイでインキュベートすると、無傷の細胞は細胞内染色をほとんどまたはまったく示しません。細胞膜の局所的なレーザー損傷に続いて、FM Dは細胞に入り始め、内膜に結合し始め、レーザー損傷後の細胞膜の修復能力がカルシウムに依存するため、FM色素の蛍光が突然増加します。

カルシウムの存在下で損傷した細胞は修復することができ、損傷後1分以内にFM色素の侵入が停止します。それどころか、カルシウムの非存在下で修復を許可された細胞は修復に失敗し、その結果、持続的な色素の侵入が生じ、したがって損傷後4分でもFM d蛍光が継続的に増加します。したがって、細胞膜の修復はFM色素染色のプラトー化につながります。

一方、細胞膜の修復が不足していると、染色体が連続して侵入し、プラトーに陥ることはありません。バルクガラスビーズ損傷アプローチは、損傷に応答した小胞およびタンパク質の細胞表面転座を監視するために使用できます。ここでは、細胞はトリッシーデキストランの存在下で損傷を受けます。

したがって、損傷していない細胞には赤色のラベルが付けられていませんが、損傷した細胞はすべて赤色にラベル付けされています。一次抗体で処理されていない無傷の細胞は、細胞表面ランプ1のバックグラウンドレベルでの標識を示していることに注意してください。しかし、細胞が損傷し、カルシウムの存在下で治癒すると、リソソームはエキソサイトーシスを起こし、したがって、損傷した細胞の表面に付着するランプワンのレベルが増加します。

この細胞表面ランプの1つの標識の増加は、カルシウムの非存在下で治癒することが許されている細胞でははるかに低いです。したがって、細胞表面ランプ1染色が高い細胞の数を定量化し、細胞表面ランプのレベルを測定することもできます。1。損傷した個々の細胞を染色することで、損傷によって引き起こされるリソソームエキソサイトーシスを受ける細胞の能力を測定できます。

この実験では、個々のリソソーム融合の速度論、性質、および位置を直接監視します。細胞膜の損傷に応答して、細胞はパルスレーザーによって損傷を受け、細胞表面のリソソームは芝イメージングによって画像化され、これにより損傷が引き起こす個々の細胞のリソソームのエキソサイトーシスを監視できます。この図は、左のパネルが位相コントラストイメージング、中央のパネルが芝生顕微鏡で可視化された細胞を示しています。

右のパネルは、負傷後105秒の同じセルの芝生の画像を示しています。ここでは、損傷が引き起こした細胞膜へのリソソームの動員と、それに続くエキソサイトーシスが示されています。このリソソームは、損傷前の芝生の画像には見えませんが、損傷後、リソソームは細胞膜に到達し、検出可能になります。

小胞が細胞膜に近づくにつれて、芝の照明によってよりよく励起され、リソソームフィットシーデックスストランド蛍光が最大値に達します。融合注入が開くと、これによりリソソームのpHが中和され、適合したDExT鎖の蛍光が消光されます。その後、DExT鎖が小胞から細胞外に排出され、ZI蛍光が横方向に広がり、小胞蛍光が徐々に減少してリソソームの様々な傷害誘発応答を測定することができます。

このビデオを見れば、大きな病巣損傷から細胞が修復する能力をモニタリングする方法や、修復プロセスに反応して助ける細胞内コンパートメントやタンパク質をモニタリングする方法を十分に理解できるはずです。異なるタグバイタルラベリング、コンパートメントまたはタンパク質を用いたさらなる実験を行い、損傷に対する応答およびIND細胞の修復への関与をモニターすることができる。