Name: マウスの網膜血流の生体内ビデオ顕微鏡測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-26T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 学ぶマウスの網膜血流測定法。蛍光マイクロスフィアとデキストランを用いた生体内ビデオ顕微鏡により、血管径と血流速度を定量化し、網膜血流を正確に算出する技術です。眼科研究に有用です。

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NIH EY017599 (NRH) から資金提供を受けています。

動物の使用に関する手続きは、LSUHSC-Sの動物管理・使用委員会によって審査され、承認され、国立衛生研究所によって概説された基準に従って実施されました。
1. 灌流液の調製
<ol>
	<li>直径1.9μmのマイクロスフェアの1%(重量)ストック溶液を超音波処理します。</li>
	<li>~25-30 x 106 個の緑色蛍光マイクロスフィア (つまり、~10 μl のストック溶液) を 300 μl シリンジに取り出します。さらに240 μlの生理食塩水をシリンジに引き込んで、ミクロスフェアを希釈します。</li>
	<li>滅菌生理食塩水に溶解した2 x 106分子量蛍光デキストランの50 μL溶液を調製し、注射用量は3〜10 mg / kgの範囲です。デキストランは、注入の時間までアルミホイルで覆ったままにしておきます。</li>
</ol>
2. 動物の麻酔と血管カニューレ挿入
<ol>
	<li>血管カニューレの外科的挿入および顕微鏡対物レンズ下での固定位置決めのために、動物に麻酔をかけます。麻酔プロトコルの多くの選択肢が利用可能であり、さまざまな長所と短所、および全身パラメータへの潜在的な影響があります。多くの異なる選択肢の中には、ケタミン (100-150 mg/kg)、キシラジン (10 mg/kg)、およびアセプロマジン (2 mg/kg) の組み合わせ、またはケタミン (50 mg/kg) とペントバルビタール (50 mg/kg) の組み合わせがあります。記載されている手順は急性であり、ペントバルビタール (150 mg/kg) の過剰投与とそれに続く開胸術によって誘発される安楽死で終わります。終末期の処置には鎮痛薬を含める必要はありません。</li>
	<li>実験の残りの間、動物の下に加熱パッドを維持してください。</li>
	<li>その後の血管カニューレの外科的挿入中は、リン酸緩衝生理食塩水で目を湿らせてください。.</li>
	<li>その後の蛍光トレーサーの注入のために血管カニューレを準備します。シリンジ針の先端に長さ20cmのポリエチレンチューブ(例えば、内径0.28mm、外径0.61mm)を装着し、針の鋭利な端をあらかじめ止血器で前後に曲げて折っておきます。</li>
	<li>シリンジとチューブにヘパリン処理(25 U / ml)生理食塩水を入れます。</li>
	<li>下腹部の片側を剃り、切開して大腿静脈を露出させます。</li>
	<li>大腿静脈をカニューレするには、5.0縫合糸で血管を結び、血管を部分的に切開し(血管の直径の約半分)、チューブを血管に挿入し、カニューレ部分の周りに縫合糸を結んでチューブを固定します。</li>
</ol>
3. 生体内顕微鏡法の準備
<ol>
	<li>1%トロピカミド点眼液を一滴、続いて2.5%ヒプロメロース点眼液を滴下して、目の ?? 孔を拡張します。.</li>
	<li>5mmのガラスカバースリップで目を覆います。</li>
	<li>動物をプレキシガラスボードの上に置き、直立顕微鏡の顕微鏡対物レンズの下に配置します。頭の下に外科用ガーゼを戦略的に配置して、対物レンズを通って中心網膜と視神経乳頭に直接軸を通すようにします。</li>
	<li>顕微鏡で視神経乳頭にピントを合わせ、低倍率の4倍対物レンズとフルオレセインフィルターを使用して椎間板を見つけます。</li>
</ol>
4. 速度を測定するための蛍光微小球の注入
<ol>
	<li>4倍対物レンズを使用して、視神経乳頭を視野の中央にして網膜に焦点を合わせます。</li>
	<li>蛍光マイクロスフィア溶液を250 μl/min/kgの速度で注入します。</li>
	<li>視神経乳頭の周りの視認可能な網膜を、~8ミリ秒のカメラ露光時間を使用してビデオ記録します。</li>
	<li>十分な時間(1〜2分)のビデオが記録されたら、マイクロスフェアの注入を停止します。一部のマイクロスフェア溶液は未使用のままになる可能性があります。</li>
</ol>
5. 直径を測定するための蛍光プラズママーカーの注入
<ol>
	<li>4倍対物レンズを使用して、視神経乳頭を視野の中央にして網膜に焦点を合わせます。</li>
	<li>調製した蛍光デキストランの溶液をボーラスとして大腿静脈に注入し、ビデオ録画中に~5秒かけて行います。このビデオは、細動脈と細静脈の同一性を判断するのに役立ち、細動脈が最初に灌流されます。この手順は、カメラの露出時間を ~8 ミリ秒に設定して実行しますが、正確な露出時間は重要ではありません。</li>
	<li>10倍対物レンズと20-40ミリ秒の露光時間に切り替えて、表在性網膜の4-7細動脈と4-7細静脈のそれぞれをビデオにするための解像度を向上させます。視神経乳頭の中心が視野の 1 つの角にあるように、視認可能な網膜の約 1 象限に一度に焦点を合わせます (およびビデオ録画します)。顕微鏡の光が組織を照らす時間を最小限に抑えて、光/色素誘発性光毒性の可能性を減らす試みがなされるべきである17。</li>
</ol>
6. ビデオ解析
<ol>
	<li>マイクロメートルスケールを使用して、μm/ピクセルの変換用にビデオシステムをキャリブレーションします。</li>
	<li>画像処理ソフトで、録画した動画を再生します。</li>
	<li>蛍光デキストランのボーラス注入のビデオから、細動脈と細静脈を特定します。</li>
	<li>10X対物レンズで記録された4-7細動脈と4-7細静脈のそれぞれについて、蛍光デキストランで満たされた直径を測定し、視認可能な長さに沿って血管ごとに平均5回の直径</li>を測定します。
	<li>同じ細動脈と細静脈のそれぞれについて、選択バイアスを避けるために、各血管内の10の連続するマイクロスフェアストリークを使用して、蛍光マイクロスフェアのストリークの長さを測定します。ストリークの長さを露光時間で割って、マイクロスフェアの速度を計算します(例:160 μm/8 msec = 20 μm/msec = 2 cm/sec)。船舶ごとに 10 の速度を平均します。</li>
	<li>各容器の体積流量を次の式で計算します:流量=平均速度× π ×直径2/4。</li>
	<li>細動脈の流量を合計し、静脈の流量を個別に合計して、網膜全体の血流を求めます。</li>
</ol>

<ol><li>Wang, L., Fortune, B., Cull, G., McElwain, K. M., Cioffi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microspheres+method+for+ocular+blood+flow+measurement+in+rats%3A+size+and+dose+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Microspheres method for ocular blood flow measurement in rats: size and dose optimization.</a> Exp. Eye Res. 84, 108-117 (2007).</li>
<li>Wang, L., Grant, C., Fortune, B., Cioffi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+and+choroidal+vasoreactivity+to+altered+PaCO2+in+rat+measured+with+a+modified+microsphere+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal and choroidal vasoreactivity to altered PaCO2 in rat measured with a modified microsphere technique.</a> Exp. Eye Res. 86, 908-913 (2008).</li>
<li>Pouliot, M., Hetu, S., Lahjouji, K., Couture, R., Vaucher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+retinal+blood+flow+by+kinin+B%281%29+receptor+in+Streptozotocin-diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Modulation of retinal blood flow by kinin B(1) receptor in Streptozotocin-diabetic rats.</a> Exp. Eye Res. 92, 482-489 (2011).</li>
<li>Pouliot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+regional+measurement+of+retinal+blood+flow+in+rats+using+N-isopropyl-p-%5B14C%5D-iodoamphetamine+%28%5B14C%5D-IMP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative and regional measurement of retinal blood flow in rats using N-isopropyl-p-[14C]-iodoamphetamine ([14C]-IMP).</a> Exp. Eye Res. 89, 960-966 (2009).</li>
<li>Zhi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+and+quantitative+imaging+of+retinal+blood+flow+in+rats+with+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opti.+Express%22%5BJournal%5D)">Volumetric and quantitative imaging of retinal blood flow in rats with optical microangiography.</a> Biomed. Opti. Express. 2, 579-591 (2011).</li>
<li>Zhi, Z., Cepurna, W. O., Johnson, E. C., Morrison, J. C., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+intraocular+pressure+on+changes+of+blood+flow+in+the+retina%2C+choroid%2C+and+optic+nerve+head+in+rats+investigated+by+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opti.+Express%22%5BJournal%5D)">Impact of intraocular pressure on changes of blood flow in the retina, choroid, and optic nerve head in rats investigated by optical microangiography.</a> Biomed. Opti. Express. 3, 2220-2233 (2012).</li>
<li>Li, G., De La Garza, B., Shih, Y. Y., Muir, E. R., Duong, T. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-specific+blood-flow+MRI+of+retinitis+pigmentosa+in+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Layer-specific blood-flow MRI of retinitis pigmentosa in RCS rats.</a> Exp. Eye Res. 101, 90-96 (2012).</li>
<li>Muir, E. R., Renteria, R. C., Duong, T. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+ocular+blood+flow+as+an+early+indicator+of+diabetic+retinopathy+in+a+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Reduced ocular blood flow as an early indicator of diabetic retinopathy in a mouse model of diabetes.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 6488-6494 (2012).</li>
<li>Wright, W. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozagrel+attenuates+early+streptozotocin-induced+constriction+of+arterioles+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Ozagrel attenuates early streptozotocin-induced constriction of arterioles in the mouse retina.</a> Exp. Eye Res. 86, 528-536 (2008).</li>
<li>Lee, S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Losartan+and+ozagrel+reverse+retinal+arteriolar+constriction+in+non-obese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Losartan and ozagrel reverse retinal arteriolar constriction in non-obese diabetic mice.</a> Microcirculation. 15, 379-387 (2008).</li>
<li>Wright, W. S., Messina, J. E., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+diabetes-induced+retinal+vasoconstriction+by+a+thromboxane+receptor+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Attenuation of diabetes-induced retinal vasoconstriction by a thromboxane receptor antagonist.</a> Exp. Eye Res. 88, 106-112 (2009).</li>
<li>Wang, Z., Yadav, A. S., Leskova, W., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+streptozotocin-induced+microvascular+changes+in+the+mouse+retina+with+the+endothelin+receptor+A+antagonist+atrasentan%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Attenuation of streptozotocin-induced microvascular changes in the mouse retina with the endothelin receptor A antagonist atrasentan.</a> Exp. Eye Res. 91, 670-675 (2010).</li>
<li>Yadav, A. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+tempol+on+diabetes-induced+decreases+in+retinal+blood+flow+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of tempol on diabetes-induced decreases in retinal blood flow in the mouse.</a> Curr. Eye Res. 36, 456-461 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Yadav, A. S., Leskova, W., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+20-HETE+attenuates+diabetes-induced+decreases+in+retinal+hemodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of 20-HETE attenuates diabetes-induced decreases in retinal hemodynamics.</a> Exp. Eye Res. 93, 108-113 (2011).</li>
<li>Wright, W. S., Yadav, A. S., McElhatten, R. M., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+blood+flow+abnormalities+following+six+months+of+hyperglycemia+in+the+Ins2%28Akita%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal blood flow abnormalities following six months of hyperglycemia in the Ins2(Akita) mouse.</a> Exp. Eye Res. 98, 9-15 (2012).</li>
<li>Lee, S., Morgan, G. A., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozagrel+reverses+streptozotocin-induced+constriction+of+arterioles+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Ozagrel reverses streptozotocin-induced constriction of arterioles in rat retina.</a> Microvasc. Res. 76, 217-223 (2008).</li>
<li>Rumbaut, R. E., Sial, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phototoxicity+of+fluorescent+dye-labeled+albumin+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Differential phototoxicity of fluorescent dye-labeled albumin conjugates.</a> Microcirculation. 6, 205-213 (1999).</li>
<li>Tadayoni, R., Paques, M., Gaudric, A., Vicaut, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+and+leukocyte+dynamics+in+the+retinal+capillaries+of+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte and leukocyte dynamics in the retinal capillaries of diabetic mice.</a> Exp. Eye Res. 77, 497-504 (2003).</li>
<li>Walsh, M. K., Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+fluorescence+imaging+of+individual+retinal+ganglion+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse fluorescence imaging of individual retinal ganglion cells in mice.</a> J. Neurosci. Methods. 169, 214-221 (2008).</li>
<li>Shahidi, M., Wanek, J., Blair, N. P., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+mapping+of+chorioretinal+vascular+oxygen+tension+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional mapping of chorioretinal vascular oxygen tension in the rat.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 820-825 (2009).</li>
<li>Hughes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the rat.</a> Vis. Res. 19, 569-588 (1979).</li>
<li>Remtulla, S., Hallett, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+mouse%2C+and+comparisons+with+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the mouse, and comparisons with the rat.</a> Vis. Res. 25, 21-31 (1985).</li>
<li>Schmucker, C., Schaeffel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+biometry+in+the+mouse+eye+with+low+coherence+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo biometry in the mouse eye with low coherence interferometry.</a> Vis. Res. 44, 2445-2456 (2004).</li>
<li>Mulivor, A. W., Lipowsky, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-+and+ischemia-induced+shedding+of+venular+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Inflammation- and ischemia-induced shedding of venular glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1672-1680 (2004).</li>
<li>Harris, N. R., Whatley, J. R., Carter, P. R., Specian, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venular+constriction+of+submucosal+arterioles+induced+by+dextran+sodium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Venular constriction of submucosal arterioles induced by dextran sodium sulfate.</a> Inflamm. Bowel Dis. 11, 806-813 (2005).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

この生体内ビデオ顕微鏡検査の技術は、マウスだけでなくラットにも適用できます。このプロトコルはいくつかの仮定のみに依存していますが、私たちが説明したように、麻酔下および瞳孔拡張での使用に限定されています。その他の前提条件と制限事項は次のとおりです。
1. 目の屈折性に起因する光学倍率誤差が最小であると仮定します。他の18〜20で説明されているように、角膜とカバーガラスの間の空間を点眼液液層で埋める方法は、角膜の屈折力を打ち消す。原因不明の倍率は、長さと直径の測定に影響します。
2. 光学分解能の制限。通常、直径測定には10倍の対物レンズ(作動距離= 1.05 cm)を使用し、この対物レンズの開口数は0.25、公称分解能は~1.2 μm(測定の不確かさとほぼ同じ)です。この倍率での全体的な解像度は、カメラ/画像プロセッサの解像度によって制限されず、ピクセルビニングなしで0.47μm/ピクセルに相当し、2 x 2ビニングで0.94μm/ピクセルに等...

網膜は体内で最も代謝が活発な組織の1つであり、したがって寛大な血液供給を必要とします。この要求を満たすのは、網膜の外側部分の脈絡膜循環と、網膜の内側部分の網膜循環の2つの循環です。網膜灌流の研究は、糖尿病性網膜症、酸素誘発性網膜症、網膜動脈または静脈閉塞、および脳卒中の病理学的メカニズムと結果を理解するために不可欠です。網膜の血流を定量化するためにいくつかの方法が採用されており、各手法には長所、短所、制限、および仮定があります。これらの技術の中には、毛細血管前細動脈1,2に留まる直径7〜8μmのマイクロスフェアの注入、定量的オートラジオグラフィー3,4、光学微小血管障害-光コヒーレンストモグラフィー5,6、磁気共鳴画像法7,8、および生体内ビデオ顕微鏡法9-16があります。後者の利点には、網膜血管と流れの直接ライブ視覚化、いくつかの小さな仮定への依存性、およびビデオカメラが取り付けられた蛍光顕微鏡を持つラボの手頃な価格が含まれます。生体内ビデオ顕微鏡法9-16の以前の研究では、蛍光デキストランが血漿マーカーとして使用され、蛍光標識赤血球(ドナー動物由来)が速度マーカーとして使用されてきました。現在のプロトコルでは、赤血球の代わりに直径1.9μmの蛍光標識マイクロスフェアを使用して速度を測定し、この変更により血球ドナーの必要性がなくなります。

<table><tbody><tr><td>蛍光マイクロスフィア</td><td>Bangs Laboratories</td><td>FS04F/10584 (緑)</td><td></td></tr><tr><td>高分子量蛍光デキストラン</td><td>分子プローブ</td><td>D-7137 (緑);D-7139 (赤)</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡システム</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600FN + アタッチメント</td><td></td></tr><tr><td>4X 対物</td>レンズ <td>Nikon</td><td>Plan Fluor 4X</td><td>開口数 0.13; 作動距離 17.2 mm</td></tr><tr><td>10X 対物レンズ</td><td>Nikon</td><td>Plan 10X</td><td>開口数 0.25; 作動距離 10.5 mm</td></tr><tr><td>トロピカミド点眼液</td><td>ボシュロム</td><td>1% トロピカミド</td><td></td></tr><tr><td>ヒプロメロース点眼液</td><td>HUB 医薬品</td><td>2.5% Goniovisc</td><td></td></tr><tr><td>画像処理ソフトウェア</td><td>カリフォルニア大学サンフランシスコ校 Vale Lab</td><td>Micro-Manager</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡用デジタルビデオカメラ</td><td>フォトメトリクス</td><td>CoolSnap ES</td><td>1392 x 1040 ピクセル解像度; ピクセルサイズ 6.45 x 6.45 &mu;メートル</td></tr></tbody></table>

マウスの網膜血流の生体内ビデオ顕微鏡測定

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

網膜の血流の変化は、眼疾患や視覚機能障害の一因となるか、またはその結果となる可能性があります。したがって、変化した灌流の定量は、網膜の病状のメカニズムの研究に役立ちます。蛍光トレーサーの生体内ビデオ顕微鏡検査は、網膜血管系、特に網膜中心動脈から分岐する細動脈と網膜中心静脈につながる細静脈の血管径と血流速度を測定するために使用できます。血流速度は、細動脈の流れと別々の静脈の流れの合計を使用して、直径と速度から計算でき、総網膜血流の値が得られます。この論文と関連ビデオでは、この手法をマウスに適用する方法について説明しており、これには、1)麻酔をかけた動物の生体内顕微鏡観察のための眼の準備、2)血流速度を測定するための蛍光マイクロスフェアの静脈内注入、3)高分子量蛍光デキストランの静脈内注入、網膜微小血管系の顕微鏡的視覚化を支援する方法、 4)灌流された網膜のビデオを取得するためのデジタル顕微鏡カメラの使用、および5)ビデオを分析するための画像処理ソフトウェアの使用。同じ手法をラットの網膜血流速度の測定にも使用できます。

図1は実験から得られた動画の単一フレームを示しており、パネルA～DおよびF～Iでは、4倍の対物レンズを用いて8ミリ秒の露出時間（動画ファイルサイズを小さくするために2×2ピクセルのビニングを適用）で撮影された蛍光性マイクロスフィアのストリークが示されている。図1Eは、この図の他のパネルにおける網膜血管の配向を示している。動画のすべてのフレームに焦点の合った蛍光ストリークが存在するとは限らないが、解析に使用できる複数のストリークが含まれるフレームもある（e.g. パネルC、D、G、H、およびI）。本実験では、ほとんどの蛍光ストリーク（8ミリ秒の露出時間で撮影）は長さが120～170 µmの範囲にあり、これは1.5～2.1 cm/secの流速に相当する。
図2は、分子量2×106のフルオレセインイソチオシアネート標識デキストランをボーラス投与した際の動画から得られた9枚のフレームを示しており、選択したフレーム間の時間間隔は0.071秒（フレーム取...

生体内顕微鏡検査は、動物で網膜血管の直径、血流速度、および総網膜血流を視覚化および測定するために使用できます。

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

この手順の全体的な目標は、マウスの網膜血流を測定することです。これは、麻酔をかけたマウスのカニューレ挿入された大腿静脈を通して蛍光マイクロスフェアを最初に注入することによって達成されます。2番目のステップは、マウスの網膜血管を流れるマイクロスフェアをビデオ記録することです。次に、蛍光デキストランを大腿静脈から注入し、網膜血管を流れる様子を動画で撮影します。最後のステップは、網膜血流を計算するために、記録されたビデオから微小球の速度と血管の直径を測定することです。この技術の主な利点は、標準的な蛍光顕微鏡を使用して網膜の血流を正確に測定できることです。この方法は、血流の変化が糖尿病性網膜症にどの程度寄与するかなど、網膜領域の主要な質問に答えるのに役立ちます。ただし、この手法はマウスの網膜でデモンストレーションします。一般的な方法は、他の組織やラットにも使用できます。直径1.9ミクロンのマイクロスフェアの1%ストック溶液を超音波処理し、ストック溶液の10マイクロリットルを300マイクロリットルのシリンジに引き出し、次いで240マイクロリットルの滅菌生理食塩水をシリンジに引き込んでマイクロスフェアを希釈する。次に、蛍光デキストランの50マイクロリットル溶液を調製し、十分な滅菌生理食塩水に溶解して、注射用量が1キログラムあたり5ミリグラムになるようにします。次に、融合の時間までデキストランをアルミホイルで覆います。動物に麻酔をかけ、牽引ピンチで適切な麻酔をテストした後、動物の下に加熱パッドを置きます。リン酸塩緩衝生理食塩水で目を湿らせてください。次に、シリンジ針の鋭い先端を止血剤で前後に曲げて折っち切ります。次に、針の鈍い先端に長さ20センチメートルのポリエチレンチューブを置き、チューブにヘパリン化生理食塩水を入れます。次に、ミリリットルあたり25単位のヘパリン化生理食塩水を準備します。下腹部の片側を剃った後、注射器にヘパリン化生理食塩水を入れ、腹部と脚の間の移行部で1センチメートルの切開を行い、大腿静脈を露出させます。次に、大腿静脈の広がりのすぐ近位で血管を5T縫合糸で結びます。次に、容器の直径の半分を部分的に切開し、チューブをその軸に沿って水平から20〜30度の角度で血管に挿入します。カニューレ部分に縫合糸を結んでチューブを固定します。顕微鏡検査のために動物を準備するには、1滴の1%tropic aid眼科用溶液で眼の瞳孔を拡張し、続いて2.5%hyper melos眼科用溶液を滴下します。次に、5mmのガラスカバースリップで目を覆います。動物をプレキシガラスボードに置いた後、直立顕微鏡の顕微鏡対物レンズの下にボードを配置します。頭部の下に外科用ガーゼを敷き、対物レンズを通した直接軸を中心の網膜と視神経乳頭に通します。Forex対物レンズとフルオレセインフィルター

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