Name: の収集と分析シロイヌナズナ師部はEDTA-促進法を用いた滲出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-23T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学ぶシロイヌナザの師部滲出液収集法。EDTA処理により師管要素の閉塞を防ぎ、代謝物質・タンパク質・RNAを分析可能。植物の長距離シグナル伝達と環境ストレス応答の研究に応用できます。

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1。植物の作製<ol><li> シロイヌナズナの種子を直接土の上またはMSプレート上で発芽することができます。 12時間日長（22℃の日、15℃夜14）とグロースチャンバーで4〜6週間のために植物を育てる。週に二度に一度水草。水やりのために下部トレイを使用してください。上から水植物をしない、トレイは再散水前に乾燥することができます。収穫時の植物は十分な水分補給であることを確認してください。 </li></ol> 2。ソリューションおよび料理の準備<ol><li> K 2-EDTA溶液：冷蔵庫に保管することができます100 mMのK 2-EDTA溶液の原液を作る。コレクション当日は、1〜5人が（一部EDTA溶液で4部の水）の20mM K 2-EDTA溶液を得るために解決策を希釈。 </li><li>途中の20mM K 2-EDTA溶液を用いてガラスやペトリ皿（直径7〜15センチメートル）を記入してください。 EXのためにさまざまな治療法（からサンプルを収集した場合十分な制御および塩ストレス植物や異なる遺伝子型）が、それぞれの治療のために別々の料理を準備。 </li><li> 20mMのK 2-EDTA溶液1.4 mlの1.7ミリリットルの反応管の所望の数を埋める。脱イオン水またはミリポア水をオートクレーブ1.4ミリリットルとの反応管の等しい数を記入してください。 </li><li>上の植物を設定するベンチにペーパータオルを入れて、一つの新しいカミソリの刃を取得し、手袋を着用。 </li></ol> 3。師部滲出液のコレクション（ 図1のフローチャートに示すように） <ol><li>収穫ロゼットはロゼットの中心葉柄近くの根元にカミソリの刃でそれらを切断することによって四から六週齢の植物から離れる。 </li><li>直ちに20 mMのK 2-EDTAを含む皿に葉を配置。葉柄の切り口が（ 図2）を溶液中に浸漬されていることを確認します。 </li><li>かつて15葉が優しくお互い例えば、tの上に葉を積み重ね、（約三から四植物）収集されている帽子切断葉柄は、互いに整列される。葉柄の基部（約1mm）で再編集し、直ちに20mMのK 2-EDTA溶液で反応管の一つにリーフを移す。彼らは少しロールアップされた場合の葉は最も簡単にフィットします。これは、細胞の損傷を引き起こす可能性があるために葉を絞る避ける、したがって、葉の細胞のコンテンツのコレクションにつながる。 </li><li>より多くの材料が必要な場合は、緩やかに湿紙タオルでサンプルを覆う。もし別の治療や遺伝子型からのサンプルの収集のために料理の新しいセットを使用してください。 </li><li>一度にすべてのサンプルを反応管に配置され、暗闇の中で、光のいずれかで滲出液を収集します。 </li><li>暗い、ライン湿紙タオルを持つ大規模な浅い皿の床で収集のため。湿ったペーパータオルで皿どちらカバーに葉を充填した反応管でラックを置いたり通気用スリットを黒いプラスチックバックに入れた。キャビネットや暗い部屋で全体のセットアップを置き。 </li><li>光でコレクションのために、湿ったペーパータオルで明確なプレキシガラス容器の底を並べる。コンテナ内の葉に満ちた反応チューブでラックを配置し、それを閉じます。 </li><li> 1時間後、削除は、コンテナと反応管からそっと出て、すべてのEDTAを除去するために、蒸留脱イオン水またはミリポア水で十分に洗い流してください。このステップは、次の3つの目的があります（1）（2）それはSDS-PAGEおよびクロマトグラフィーEDTAの干渉を排除し、細胞への最小限に被害にEDTAを除去し、（3）カット/損傷から蓄積された任意の化合物を除去し細胞。直ちにオートクレーブ水を含有する調製した反応管に移し、滲出液の収集のための加湿コレクション容器に戻す。滲出液のRNAの抽出のために使用する必要がある場合、この時点で、RNase阻害を追加します。オプション：タンパク質分析が所望される場合プロテイナーゼ阻害剤を添加することができる。 </li><li>意図された収集時間の後、引き出し、discaRD葉とさらに使用するための液体N 2で師部滲出液を凍結。拡張ストレージが必要な場合は、-80サンプルと店舗℃で凍結乾燥</li><li> シロイヌナズナの場合には、代謝産物は既に1時間、排泄物の収集後に検出することができる。少ない豊か成分の分析が計画されれば、5-8時間、コレクションがお勧めです。 シソのような大規模な工場では、より長い収集時間（8時間）が推奨されています。 15葉から収集された滲出液は、mRNA抽出のためのSDS-PAGEゲル（タンパク質）、GC-MS（糖及び代謝物）で1車線のため、通常は十分です。脂質分析のために2-3のサンプルのプーリングは（30-45葉から滲出液）が推奨されており、明確な結果につながる。 </li></ol> 4。その後の分析では、（ビデオのために我々は4.4のみを表示） <ol><li>タンパク質解析のために、15μlの水と30μlのLämmliバッファ内の再懸濁したサンプルは、95〜熱が℃で5分間、すぐに任意の電話をスピンダウンrecipitatesとSDS-PAGEゲル（45μlのローディングポケット）に試料全体をロードします。タンパク質量が非常に低いので、サンプルはコロイドクマシーや他の敏感な汚れで染色されるべきである。 </li><li>文献14に記載されているように砂糖と小さな代謝産物解析のために、乾燥した試料を誘導体化エージェントを追加。 </li><li> mRNAをRT-PCR、マイクロアレイ又はRNA-配列分析を用いて分析することができる。 </li><li>次のようにドラフトでメタノール（1:1）：各サンプルにメタノール、数秒間ボルテックスし、4分間遠心：クロロホルムの等量を追加直ちに脂質分析クロロホルムに対するプール二から三のサンプルとパーティションを用400 x gで。テフロンキャップと上相と繰り返しパーティション3倍以上とガラス管の下側（有機相）を収集します。 N 2気流下で合わせた有機相を乾燥し（薄層クロマトグラフィー、さらなる分析に提出：TLC 14、37、液体クロマトグラフィー-質量分析：LC-MS 14）。 </li></ol>

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</ol>

我々は、開示することは何もありません。

師滲出物のEDTA-促進コレクションは、非常に単純で最小限の装備を必要とし、ほとんどの植物に適用することができる。全体的に、この方法はより種から篩排出物を分析する能力を拡張する。滲出液が希釈されているが、それは多くの異なるサンプルを収集したり、多くの植物から材料を多量にスケールアップすることは容易である。そして、これは非常に低濃度であり、見過ごされる新規な化合物の検出を可能にする。 この方法は、複数の植物種に使用され、この原稿に記載されているものについて説明したように動作することができる。新しい種が模索されている場合は、変更を必要とするかもしれない二つの側面は、使用される葉や滲出の時間数です。ほとんどの場合、七時五十五時間滲出は適していなければならない。プロトコル部分で説明したように新たな植物種で、この方法の使用を確認するために、滲出液を収集する必要があり、その後の分析の一つ以上のnは4実行されるeeds。観測された信号の強度に応じて、回収量がスケールアップする必要があるかもしれない。前者は師部滲出液の少ない豊富であるため、一般的には、脂質やタンパク質分析は、砂糖及び代謝物の分析よりも、より多くの材料が必要になります。 EDTA-促進滲出コレクションは切断面と同様に、EDTAの潜在的に有害な効果を伴うため、いくつかの点を考慮する必要があります：（1）EDTA、1時間インキュベートした後、葉柄は、十分に洗浄しなければならない。これは、細胞を損傷または抽出を妨げる可能性が傷ついた細胞から得られた任意の化合物と同様にEDTA自体を削除します。 （2）正と負のコントロールが得られたデータは、師部樹液からではなく怪我細胞（以下の重要なステップを参照）に由来していることを確認するために含まれる必要があります。 （3）師部樹液が滲出液収集時にアクティブにすることができるいくつかの酵素が含まれていません。したがって、いくつかのケースでは、foのを収集するために有用であり得る時間のrは異なる量。 （4）水に滲出を関与方法なので、化合物の絶対的な定量化はできません。 重要なステップ：任意のセルを傷つけるだけでなく、適切なコントロールの使用など（。リファレンスを参照14）ではないために、サンプルの処理中に、このメソッドが正常に使用するための鍵は、注意を使用することである。一つの適切なコントロールは、EDTAとの事前処理なし師部滲出液のコレクションです。このケースでは師部自体を封印され、全く滲出液を採取することはできません。傷ついた細胞に由来する任意の汚染物は、ここで検出されます。第二の制御は、滲出液中の糖の分析であろう。 シロイヌナズナでは、ショ糖は1:4 1：08（REF 8、14）の間でのショ糖比は果糖で、師部樹液内で優勢な代謝物であるべきである。 RNA抽出のためにRNアーゼ阻害剤の使用が必要である。加えて、以前にdescribとの陽性対照ED師部局在するmRNA（UBC9：ユビキチン結合酵素9、At4g27960、8、14）と例えばの負の制御葉緑体mRNA（ルビスコLSU）がお勧めです。 滲出液は、活性酵素が含まれているため、時間の経過は、師部プロファイルに必ず変更を行うことをお勧めします単に収集時間の変動によるものではない。いくつかのケースでは、プロテイナーゼインヒビターを使用することが有益であり得る。しかし、研究者は、収集した滲出液を濃縮し、任意の追加された化合物は、主に集中されることされることを、心に留めておく必要があります。プロトコル内の第2の重要なステップは、EDTA下葉柄のrecuttingです。このステップでは、二重の目的を果たす：こうして師部樹液の自由な流れを可能にする新しいプラグの形成を防止しながら、まず、任意の密封されたふるいプレートを除去します。第二に、カットしながら生成された木部にキャビテーション気泡を除去し、これにより木部輸送を可能にします。第二の切り込みのサイズが決まる使用植物のS。大きな葉柄 ​​と植物では、それが最初のカット、上記の数ミリ（最大1 cmまで）でなければなりません、 シロイヌナズナなどの植物では,1-2 mmと十分です。 この方法の使用は、発達や医学の影響をシグナリングしている可能性が師部滲出液における新規化合物の発見につながることができます。それは師部へのアクセスの欠如に起因する植物科学内で少し研究された分野であった長距離脂質シグナリング、でより綿密な外観を求めている。

植物は悪条件を逃れるために移動することはできません。従って、それらは、環境ストレスを検出するためのメカニズムを開発誘発し、植物全体に関連する信号を送信し、それに応じて開発を調整しなければならなかった。 2つのトランスポートシステムは、水、栄養素および他の（シグナリング）の化合物の分布が存在する。最初は、木部であり、一般的に工場全体の根に取り込まれた水やミネラルを輸送した。二つ目は師部です。師のビューはシンプル同化輸送システムからのRNA、タンパク質、ウイルス、脂質や他の小分子ための導管に変更されました。それは同化において重要な役割を果たしており、栄養素輸送、生物と非生物的ストレスへの応答、ならびに植物の成長と発展した。それは、今では植物18の&quot;情報スーパーハイウェイ&quot;と呼ばれています。 師部柔組織、​​並びに特殊なコンパニオンセリウム：師は、いくつかの細胞型から構成されているLLSおよびふるい要素。篩要素は、長距離移動の部位である。遮るもののない縦の流れを可能にするために、ふるい要素は最も小器官と同様、核が欠けているとせいぜい限られた翻訳機構21、33が含まれていると考えられている。なお、コンパニオン細胞は、タンパク質および師部·ストリームに走行他の化合物を合成すると考えられる。これらの化合物は、次いで、原形質連絡を介して篩要素に搬送され、長距離信号4,16として機能することができる。 化合物のいくつかのグループは、師の滲出で見つけることができます： <ul><li>糖は、多くの場合、光合成の産物であるとストレージのための植物の他の部分への &quot;エネルギーを運ぶ&quot;分子としてまたはビルディングブロックとして輸送される。しかし、彼らはまた、不凍液として、または化合物のシグナルとして機能することができます。 </li><li>タンパク質はまた、師部滲出で見つけることができます。彼らは、代謝酵素を含むが、シグナル伝達機能も持っている。 One examp発達シグナルとして働くタンパク質のLEは、開花の誘導だけでなく、植物の季節的な落葉を通知開花軌跡T蛋白質、です。6 </li><li>核酸は、mRNA、小さなマイクロRNAを、およびウイルスRNAの形で篩滲出物中に存在する。彼らは主にシグナル27、28、39に関与するように見える。同時に、ほぼすべてのアミノ酸についてのrRNA及びtRNAをウリ科植物は、42の篩樹液で観察されている。それらは選択的に篩管システムに転送するように見える。のtRNAは、翻訳装置にアミノ酸を転送する機能のために必要な修正を示しています。しかし、むしろ翻訳に関与するよりも、彼らはこのプロセスを阻害するように見える。代わりに、彼らは、サイトカイニンの源として役立つ、または植物42の代謝状態を通知することができます。 </li><li>脂肪酸、オキシリピン、および他の脂質も篩滲出3、13、14、23で発見されている。 JasmoNIC酸、病原体感染22、29、31、32への応答の一部として、師を通してオキシリピン移動します。最も師脂質の役割はまだ不明であるが、そのうちのいくつかは、おそらく機能4をシグナリングしている。 </li></ul>植物の師部での作業での課題は、負傷により自体を封印するために、その能力にある。そこに師部滲出液を収集するために使用される4つの主要な方法は、まだ彼らは選択種でのみ動作します： 1）ウリ科植物では、葉柄のカットを介して篩滲出物の合理的な量を得ることができる。損傷菌の汚染との初期液滴が除去されると、それは純粋な師部樹液1、15合理的に大量に得ることができる。しかし、増加収集時間を、液体クロマトグラフィーアプローチ（未発表）のために、それはますます不向きこの滲出液が厚くなっています。最近の出版物は、種に応じて、この師部樹液がeitheから派生されていることを、示唆しているrは束状（FP）またはextrafascicular師（EP）と、それはふるい素子（FP）から&quot;移動&quot;師部樹液を含まないが、それはまた、木部40を含む他の細胞型からの汚染を受けやすい、41 。 2）第2のアプローチは、茎や葉柄に浅い切り傷や刺し傷を通して師部樹液を得ることである。この方法は、ルピナス17、25、36ウリ科植物、及びセイヨウアブラナ 12に首尾よく使用されている。ここで負傷した細胞からの汚染は最小限であり、非常に純粋な滲出。しかし、植物はそれを非常に選択的に穿刺だけふるい要素に挑戦しているので、健康でよく骨抜きにする必要があります。木部血管がニックしている場合は、すべての滲出液が木部流に引き込まれる。これは非常に壊れやすい、または非常に木質化葉柄や茎の植物には不向きの方法になります。 3）アブラムシstylectomyはアブラムシがふるい要素に自分のスタイレットを挿入することができますnは、レーザーでアブラムシを取り除く。師部樹液は、残りのスタイレット2、9、10、35、38を通って染み出している。理論的には、アブラムシによって感染することができる任意の植物が、このアプローチを用いることができる。しかし、ほとんどの温室または成長室マネジャーは、病原体の使用をサポートしていません。また、アブラムシは、彼らの唾液19、33と師部にいくつかのタンパク質を導入する。これは、30を再プログラム限定転写につながると師部構成26を変更する可能性を秘めている。 4）ここに記載されている方法は、師部樹液のEDTA-促進滲出です。この方法は、師部20の封止を防止するためにEDTAを用いている。 EDTAは、Ca 2 +さもなければ師部をシールするプロセスに参加するイオンをキレート。 EDTAは、細胞傷害30に導くことができるが、いくつかのグループは、セルの微細構造またはphloeは20 mMまでこの方法を使用し、10mMのEDTAから濃度の有害な影響は観察されなかったMロードと輸送5、24。任意の損傷効果並びにクロマトグラフィー及びゲル電気泳動によるEDTAの干渉を低減するため、植物は1時間後に水中に移動され、滲出液のみを保存部14は、 使用される。したがって、むしろEDTAに滲出より、師部、水（EDTA-促進滲出）にexudatedされています。それは師部滲出液の収集のためのストレートフォワード、低コスト、ローテクな方法である。篩樹液この方法は、タンパク質、小分子、脂質、およびRNAを分析するために使用して得られる多くの植物において成功裏に使用されている。実験の限られた量の単子葉植物11で実行されているが、この方法は、双子葉植物（ シソ 17、20、 シロイヌナズナ 8、13、14、 ポプラ 7）に対してより適切であると思われる。滲出液の収集が蒸散を介して排出物の損失を避けるために湿度の高い環境で発生する必要がある。植物に応じて、1〜2時間のためにEDTAでインキュベーションです師部/ふるい素子の封止を防止するのに十分。コレクションは、その後水に発生することがあります。これは、EDTAは、セル構造および安定性に及ぼす負の影響を防ぐ利点を有する。また、HPLCまたはSDS-PAGEのような方法でEDTAの干渉を排除。それがシロイヌナズナに適用されることが示されている。大きい植物のため、EDTAおよび滲出コレクション内のインキュベーションがスケールアップするとビーカーではなく1.7ミリリットル反応チューブで実行されています。

<table><tbody><tr><td>K2-EDTA</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>ED2P-500G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>浅いガラスまたはプラスチックのペトリ皿(7-15cm)</td><td>PYREXまたはコーニング</td><td></td><td>清潔で浅い皿は動作します</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>EMD</td><td>CX1054-1</td><td>ヒュームフード内の容器のみ メタ</td></tr><tr><td>ノール</td><td>J.T.Baker</td><td>9070-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>スクリューキャップチューブ</td><td>VWRインターナショナル</td><td>53283-800</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>スクリューキャップチューブ</td><td>Sun Sri</td><td>13-425</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>エッペンドルフ管デン</td><td>ビル</td><td>C2170</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

の収集と分析<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;師部はedta-促進法を用いた滲出

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

植物の篩部は、長距離輸送（写真）だけでなく、生物的または非生物的ストレスを伝えるシグナルのように同化するために不可欠である。これは、糖、アミノ酸、タンパク質、RNA、脂質および他の代謝物が含まれている。師部の構成と機能を理解する上で大きな関心、従って、これらの分子の多くとの役割がありますが、植物の開発やストレス応答におけるその重要性は、まだ決定されていない。師部分析の一つの障壁は時師シール自体が負傷という事実にある。結果として、師部樹液が得られるから植物の数が限られている。追加機器なしで、いくつかの植物種から師部滲出液の収集を可能にする一つの方法は、ここで説明EDTA-促進師滲出コレクションされています。使いやすいであるが、それは細胞の負傷につながる行い、ケア、損傷したセルの内容を削除するために取らなければならない。さらに、いくつかのコントロールが滲出​​液の純度を証明する必要です。それはむしろその内容の唯一の相対定量が発生する可能性が師部樹液（多くの種では不可能）のダイレクト·コレクションより滲出ですので。他のものよりもこの方法の利点は、それが多くの草本又は木本植物種（ シソ 、 シロイヌナズナ 、 ポプラ 、 等 ）で使用され、最小限の機器と訓練を必要とすることができることである。それは、タンパク質、糖、脂質、RNA、ウイルスおよび代謝物のその後の分析に使用することができる浸出液の合理的に大量につながる。それは、両方の研究と同様に教示実験室で使用できることを十分に単純である。

それは師部樹液の複雑さが植物が最適な応答を発達やストレス信号を変化させ送信方法の質問への答えであることが過去数年にわたって明らかになってきた。 EDTA-促進師部滲出を使用すると、他のアプローチに適していない、経済的又は生理学的興味のある植物から篩滲出物を分析する機会を提供することができる。 この方法は、 師部に局在するタンパク質を同定、開発やストレス（ 図3）に応答してレベルの変化を検出するのに十分な篩滲出物の収穫を可能にする。図に示すように、タンパク質は、まだ、非常に低濃度であるのレベルはLC-MS/MSを用いて後続のプロテオミクス実験のためにまたはウェスタンブロット分析のために十分に高い。ウリ科植物における知見は、茎の切削水ポテンシャルバランスの崩壊とそれに続く水の流入につながることを示唆しているとアポプラスト41から可能な汚染物質。まだ一から八時間に至るまでの時間は、 シロイヌナズナにおける師部タンパク質プロフィール/組成（唯一絶対量がGuelette ら異なります ）には影響しませんのために収集、タンパク質の量が収集され、見つかったタンパク質のパターンは、種（ シロイヌナズナの間で異なります。 シソ 、レーンIおよびNI）とトリートメント（別の日の長さで成長シソ 、レーンIおよびNI）で。結果タンパク質性信号を可視化することができるように、同定し、続いた。 mRNAおよびマイクロRNAは 、この方法によって篩滲出物において同定することができる。しかし、RNアーゼ阻害剤による治療は、拡張滲出時にmRNAの分解を防止する必要がある。師部を公知の間に篩要素は、機能葉、ルビスコ小または大サブユニットを含んでいないので（赤血球又はRBCL、それぞれ）mRNAは、ネガティブコントロールとして使用することができるローカライズされたユビキチン結合酵素等のmRNAは陽性対照（ 図4）として用いることができる。 同様に、 糖または小代謝産物は GC-MS又はLC-MSのいずれかを使用して分析することができる。ここでは、篩滲出物がほぼ全解糖経路12を含む機能性酵素を大量に含んでいることに言及すべきである。したがって、いくつかの時点を使用すると、滲出液収集時代謝過程を明らかにすることができる。例を図5に示されている：全滲出物において、スクロースが最も豊富な代謝産物であるが、これは1時間回収した後に最も明らかである。しかし、5時間後に比率をフルクトースへのショ糖はわずかに減少している。同じ滲出液が一時間のために収集し、次の4時間ベンチに放置すると、比をフルクトースへスクロース師に積極的に酵素は部屋の温度でのショ糖の分解につながる滲出ことを示唆し、はるかに大きい程度に低減され温度（もっとピークの解釈のために14を参照）。これは、システムがその活力34を失うまで師のロードとふるい要素に伴細胞から分子の輸送が滲出中に続けることが調査結果と一致している。 師部滲出液中の脂質とは、拡張子によって、長距離脂質シグナリングは、植物科学への関心のかなり最近のフィールドである。その疎水性の性質に起因する脂質低濃度でしか存在しており、可溶化のための他の分子に結合することができる。まだ十分な材料の収集は視覚化するために、EDTA-促進滲出により（TLC; 図6）と（LC-MS、 図7）を識別する、いくつかの植物種から師部脂質を。同図が示すように、それはいくつかの脂質種を識別し、分離することが可能である。 LC-MSは、異なる脂質種を識別し、differeに脂質プロファイル内の変更を監視することができNT遺伝子型や治療。これは植物の開発やストレス応答時の脂質の役割の研究を可能にします。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig1.jpg" width="600px" /> シロイヌナズナやシソの師部滲出のコレクションの1。フローチャート図 。異なる経路は青色で示されている異なる最終製品につながる。 RNA、RNA分解酵素阻害剤（100 U / mlの、ロシュ）を調製するための篩部滲出液を収集するに水に添加される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig1highres.jpg" target="_blank">大きな画像を表示するには、ここをクリック</a> 。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig2.jpg" width="600px" /> 図2。収集師部滲出液のための材料のセットアップイオン。セットアップは、プロトコル手順3.1から3.4に必要なすべての資料が表示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig2highres.jpg" target="_blank">大きな画像を表示するには、ここをクリック</a> 。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig3.jpg" width="600px" /> 図3師の二つの異なる植物種の滲出、 シロイヌナズナ （AT）とシソ （IおよびNI、別の日の長さ）で見つかったタンパク質MW：分子量マーカー（レーン2）。タンパク質は、10〜20％勾配SDS-PAGEを用いて分離した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig3highres.jpg" target="_blank">大きな画像を表示するには、ここをクリック</a> 。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig4.jpg" width="600px" /> 図4。分析ルビスコ小と大サブユニット（それぞれ赤血球とRBCL、）とユビキチン結合酵素（UBC）のmRNAの存在。 mRNAはシロイヌナズナの葉（L）、葉柄（P）、および師部の滲出液（PH）から収集された、PCRを用いて可視化した転写および特定の転写産物を逆転。図はGuelette らから変更されました。14。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig4highres.jpg" target="_blank">大きな画像を表示するには、ここをクリック</a> 。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig5.jpg" width="600px" /> 師部の図5。GC-MSプロファイルは倍の量が異なるために収集滲出。収集時間の5時間（B）〜1時間コレクション（）から蔗糖変更の方法相対量に注意してください。室温で &quot;インキュベーション&quot;に続いて1時間採取後のプロファイルを滲出<html> 4時間温度（RT）（C）。葉の代謝物プロファイル（D）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig5highres.jpg" target="_blank">大きな画像を表示するには、ここをクリック</a> 。 <img alt="図6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig6.jpg" width="600px" /> 図6。 シソ （左）とシロイヌナズナ （右）の葉と師部の滲出液から脂質を比較薄層クロマトグラム。アスタリスクは、師部滲出液のための特定の脂質を示す。 DGDG：digalactosyldiacylglycerol; PG：ホスファチジル; MGDG：monogalactosyldiacyglycerol; シロイヌナズナ脂質を表示する数字の一部がGuelette らから変更されている14。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig6highres.jpg" target="_blank">大きな画像を表示するには、ここをクリック</a> 。 NT &quot;のfo：キープtogether.withinページ=&quot;常に &quot;&gt; <img alt="図7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig7.jpg" width="600px" /> 図7 LC-MS /陰イオンモードを用いたシロイヌナズナの師部の滲出液（クロロホルム相）の脂質プロファイル。上部のグラフ（変異体）、および底部（野生型、B）は、2つの異なる遺伝子（矢印で示す）との間の脂質プロフィールの違いを示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig7highres.jpg" target="_blank">大きな画像を表示するには、ここをクリック</a> 。

師部樹液の成分だけでなく、そのロードと長距離輸送のメカニズムの知識は、植物の開発とストレス/病原体応答と輸送を同化の長距離シグナルの理解に不可欠である。本稿では、EDTA-促進法を用いて師部滲出液のコレクションを記述します。

の収集と分析<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;師部はEDTA-促進法を用いた滲出

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

本手順の全体的な目的は、Arabidopsisやその他の植物から篩管滲出液を回収し、その内容物を分析すること、または篩管流中の化合物の存在を確認することです。これは、まず、篩管要素の閉塞を防ぐために、花弁を切り取り、EDTAカリウム中でインキュベートすることによって達成されます。次のステップでは、その後の分析を妨げたり、長時間の曝露によって細胞を損傷させたりする可能性がある残留EDTAを除去するため、花弁を十分に洗浄します。次に、フローEM滲出液を水中に回収します。最終ステップとして、LC-MS/GC-MS、ゲル電気泳動、および薄層クロマトグラフィーによる後続分析のためのサンプル調製を行います。最終的に、EDTAで促進されたphem滲出を用いることで、代謝物や脂質、タンパク質、RNAなどのphem含有量を分析および確認することが可能です。植物は不利な環境条件から逃れることができません。そのため、環境信号を植物全体に伝え、成長・発達を変化させることで対応するための、非常に効率的で迅速なシステムを必要としています。こうしたシグナル伝達経路の一つに植物フローがありますが、その組成を理解することは非常に困難です。流体内容物の採取および分析には、EDTAを用いたフロー鎮静法を使用します。この手法はもともとPerillaにおいてkingらによって開発されましたが、他の種にも容易に適用可能です。本手順のデモンストレーションは、私の研究室の学部生であるElenaとUSが、手順の開始前に行います。採取当日まで、12時間の光周期に設定した育成室でArabidopsisを4〜6週間栽培します。あらかじめ調製しておいた100 millimolarカリウムEDTA溶液を水で希釈し、最終濃度を20 millimolarにします。次に、直径7〜15 centimeterのガラスシャーレ2枚に、20 millimolarカリウムEDTA溶液を半分まで満たします。完了後、1.7 mL反応チューブに20 mMカリウムEDTA溶液を1.4 mLずつ満たします。次に、同数の反応チューブにミリポア水を1.4 mLずつ満たします。育成チャンバーから4〜6週齢の植物を取り出し、ロゼットの中心に近い花弁の基部をカミソリで切断して、ロゼット葉を採取します。切断端を溶液に浸した状態で、葉を直ちに20 millimolar potassium EDTAを含むディッシュに入れます。3〜4個の植物から計15枚の葉を採取したら、切断した花弁同士が揃うように、それらを慎重に重ねます。花弁の基部を再度切断し、葉をそっと丸めます。次に、浸出液を回収するため、20 millimolar potassium EDTAを含む反応チューブの1つに、丸めた葉をそっと挿入します。暗所で、大きな浅い皿の底に濡れたペーパータオルを敷きます。葉を入れた反応チューブがセットされたラックを皿の中に配置し、通気口のある黒いプラスチック袋に入れます。次に、装置全体を滲出液回収用のキャビネットに入れます。透明なプレキシガラス容器の底に、濡れたペーパータオルを敷きます。葉を入れた反応チューブがセットされたラックを容器に入れ、蓋を閉じてください。容器からラックを取り出した1時間後、反応チューブから葉を取り出します。蒸留水で葉を十分に洗浄し、EDTAを完全に除去します。直ちに、ミリポア水が入った反応チューブに葉を移し、ラックを加湿容器から取り出した後、滲出液を回収するために、再び加湿容器に戻します。5〜8時間後、チューブから葉を取り出し、流出物を液体窒素で凍結させ、-80°Cのフリーザーで保存します。翌日のさらなる解析に向けて、脂質分析の準備としてサンプルを融解させます。次に、2〜3個のサンプルを抽出し、混合溶液に同量のクロロホルムとメタノールを加えます。混合物を数秒間ボルテックスします。次に、サンプルを400 gsで4分間遠心分離します。終了後、上層を用いて分液操作をさらに3回繰り返し、底層の有機相をガラスチューブに回収します。合わせて回収した有機相を窒素気流下で乾燥させ、薄層クロマトグラフィーおよびLCMS分析に供します。この方法を用いることで、phem滲出液を十分に回収し、phemに局在するタンパク質の同定や、発生またはストレスに応じたそれらのレベルの変化を解析することが可能になります。場合によっては、タンパク質の分解を防ぐためにプロテアーゼ阻害剤の使用を検討してください。本例に示すように、タンパク質の含有量は非常に少ないものの、そのレベルは後続のプロテオミクス実験を行うのに十分な量です。LCMSまたはウェスタンブロット解析を用いたキュウリ科植物における知見から、茎の切断は水ポテンシャルのバランスの崩壊を招き、その結果、切り口から水や潜在的な汚染物質が流入することが示唆されています。しかし、1時間から8時間の範囲で採取時間を変えても、flow Mタンパク質のプロファイルおよび組成に影響は見られませんでした。採取されるタンパク質の量および検出されるタンパク質のパターンは、種および処理によって異なります。その結果、タンパク質のシグナルを可視化、同定し、追跡することが可能になります。また、この手法を用いることで、フロム滲出液中のmRNAおよびmicroRNAを同定することも可能です。ただし、長い滲出時間におけるmRNAの分解を防ぐために、RNA阻害剤による処理が必要となります。Cエレメントは機能的な葉緑体を含まないため、rubisの小サブユニットまたは大サブユニットmRNAを陰性対照として使用でき、一方でユビキチン結合酵素のような局在が既知のpH flu m局在mRNAを陽性対照として使用できます。同様に、糖や低分子代謝物はGCMSまたはLCMSを用いて分析可能です。なお、phem滲出液には、ほぼ全ての糖新生経路を含む多数の機能的酵素が含まれていることに留意してください。したがって、複数のタイムポイントを用いることで、滲出液の回収中における代謝プロセスを明らかにできる可能性があります。すべての滲出液において、スクロースが最も豊富な代謝物でした。これは、1時間の回収後に最も顕著に現れます。しかし、5時間後には、スクロースとフルクトースの比率はわずかに低下します。同じ滲出液を1時間収集し、その後さらに4時間ベンチ上に放置した場合、スクロースとフルクトースの比率は大幅に低下します。これは、根圏滲出液中の活性酵素が室温でのスクロース分解を促進していることを示唆しています。加えて、5時間の連続回収においてスクロースとフルクトースの比率がわずかに減少したにとどまるという事実は、篩管の充填および伴細胞から篩管要素への分子輸送が、システムが活力を失うまで滲出中に継続している可能性があるという知見と一致しています。篩管滲出液中の脂質、ひいては長距離脂質シグナリングは、植物科学において比較的新しい関心分野です。脂質はその疎水性のため、低濃度でしか存在せず、可溶化のために他の分子に結合している可能性があります。しかし、EDTAによる滲出の促進により、いくつかの植物種から流体および脂質を可視化し、同定するための十分な試料を回収することが可能になります。ここで示すように、薄層クロマトグラフィーを用いて、いくつかの脂質種を分離することができます。LCMSを用いれば、異なる脂質種を同定し、異なる遺伝子型または処理による脂質プロファイルの変化をモニタリングすることが可能です。これにより、植物の発達およびストレス応答における脂質の役割の研究が可能になります。この手法に習熟し、適切に実施すれば、最短3時間で完了させることができます。ただし、ほとんどのサンプルについては、5時間から8時間の回収時間を推奨します。このケースでは、早朝から葉の採取を開始することを推奨します。この手順は他の植物にも応用可能であり、新規のフロー化合物の発見や確認につながる可能性があります。この手順を行う際は、1時間後からPDLを十分に観察してEDTAを除去すること、また、他の細胞の内容物による汚染を防ぐために葉を絞らないことが重要です。加えて、手袋を着用することで、皮膚から混入する可能性のある汚染物質からサンプルを保護することができます。汚染を防ぐため、タンパク質、RNA、または代謝物サンプルに対して適切なコントロールを使用してください。推奨されるコントロールはテキストプロトコルに記載されています。本手法により、植物フローの組成に関する新たな知見を得ることができました。我々はフォーム滲出液の中から、床という水圏環境では想定されないいくつかの脂質を同定することができました。これにより、我々や他の研究者は長距離脂質シグナリングという概念を導入することとなり、それは現在、インプラント研究という刺激的な新しい分野へと発展しています。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

空間固有のフィトクロム応答の分子基盤は、組織および器官特異的フィトクロムの欠陥を示すトランスジェニック植物を用いて検討されている。マイクロアレイ解析に続いてソート蛍光活性化細胞により誘導されるフィトクロム発色団の枯渇を示す特定の細胞の単離は、空間的な固有のフィトクロム反応に関与する遺伝子を同定するために活用されています。...

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ</em

の細胞特異的な分析<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;蛍光活性化細胞選別を使用した葉

ここでは、 シロイヌナズナの細胞培養というラベルのN 15、完全に標識されていないとの混合物をベース洗剤に耐性と洗剤の可溶性膜にし、 生体内で植物の形質膜の分画するための堅牢な方法が記載されている。手順は、シグナリングプロセスを理解するために、比較プロテオミクス研究のために適用される。...

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結晶セルロース蓄積中の高解像度の定量化<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;ルーツは、組織特異的な細胞壁の変更を監視します

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大規模なネイティブ蛋白質: 蛋白質および蛋白質の蛋白質組成を分析するためのプロトコルの紹介: ナタネから核酸複合体 (ナタネ)ブルーを組み合わせて 3 D ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) アプローチを使用して篩部の滲出液ネイティブ (BN) 質量分析による同定が続く変化の 2...

タンパク質とリボ核蛋白質複合体の 3 D ページのナタネから師部 Sap サンプリング

担鉄細胞の潜在的な地上システムで微量栄養素のバイオアベイラビリティと売り上げ高に貢献環境試料の急速なスクリーニングのためのプロトコルを提案します。...

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シロイヌナズナにおける浸透性ストレスシグナル伝達のプロファイリングのためのホスホプロテオミクス戦略

根の滲出液の分泌は、通常、ストレス条件下での植物の外部解毒戦略です。このプロトコルでは、非標的メタボローム分析 を介して...

代謝産物生産に対するフタル酸ジ(2-エチルヘキシル)の影響を研究するためのアルファルファ根滲出液の収集

ここでは、シロイヌナズナの花粉水分補給プロファイルを測定するための改善された方法について説明します。新しい方法は、より高い解像度を提供し、非侵襲的であり、再現性が高いです。このプロトコルは、受粉の初期段階を規制するプロセスをより細かく解剖するための新しいツールを表しています。...

シロイヌナズナの高分解能単粒in in vivo花粉水和バイオアッセイ

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最適化されたアポプラスティック洗浄収集法を用いたシロイナズナの葉から植物細胞外小胞の分離および精製

学ぶシロイヌナザの師部滲出液収集法。EDTA処理により師管要素の閉塞を防ぎ、代謝物質・タンパク質・RNAを分析可能。植物の長距離シグナル伝達と環境ストレス応答の研究に応用できます。

の収集と分析

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