の収集と分析シロイヌナズナ師部はEDTA-促進法を用いた滲出

この手順の全体的な目標は、シロイヌナズナまたは他の植物からフロム滲出液を収集して、その内容を分析したり、フロムストリーム内の化合物の存在を確認したりすることです。これは、最初に花びらをEDTAカリウムで切断してインキュベートし、海の要素の密封を防ぐことによって達成されます。2番目のステップは、花びらを徹底的に洗浄して、その後の分析を妨げ、長期暴露中に細胞を損傷する可能性のある残りのEDTAを取り除くことです。

次に、流れたEM滲出液を水に集めます。彼女の最後のステップは、L-C-M-S-G-C-M-Sゲル、電気泳動、および薄層クロマトグラフィーによるその後の分析のためにサンプルを調製することです。最終的に、EDTA促進フェム滲出液は、代謝物や脂質、タンパク質、RNAなどのフェム含有量を分析および確認するために使用できます。

植物は悪条件から逃れることはできません。その結果、プラント全体に環境信号を送信し、開発を変更することで対応するための非常に効率的で高速なシステムが必要とされています。これらのシグナル伝達経路の1つが植物の流れであり、その組成を理解するのは非常に複雑です。

私たちは、流れ内容物の収集と分析にEDTA促進流鎮静法を使用します。もともとはシソで王によって開発されましたが、他の種に簡単に変更することができます。この手順を実演するのは、この手順を開始する前に、私の研究室のElenaと米国の両方の学部生です。

Grow Arabidopsisは、収集日に12時間の撮影期間を設けて、成長室で4〜6週間を計画しています。以前に調製した100ミリモルのカリウムEDTA溶液を水で希釈して、最終濃度を20ミリモルにしました。次に、直径7〜15センチメートルのガラス皿2枚に、20ミリモルのカリウムEDTA溶液を半分まで満たします。

終了したら、1.7ミリリットルの反応チューブに1.4ミリリットルの20ミリモルカリウムEDTA溶液を入れます。次に、同数の反応チューブに1.4ミリリットルのミリポア水を入れます。生後4〜6週間の植物を成長室から取り除いた後、ロゼットの中央に近い花びらの付け根でカミソリの刃でロゼットの葉を切って収穫します。

すぐに葉を20ミリモルのカリウムEDTAを含む皿に入れ、ピールの切り口を溶液に沈めます。3〜4本の植物から15枚の葉を集めたら、切り取った花びらが揃うように優しく積み重ねます。花びらの根元を切直し、葉をやさしく転がします。

これに続いて、転がした葉を20ミリモルのカリウムEDTAを含む反応チューブの1つに静かに挿入し、滲出液を収集します。暗い線で、濡れたペーパータオルで大きな浅い皿の底。葉が充填された反応チューブを皿に載せたラックを配置し、通気用のスリットが入った黒いビニール袋に入れます。

次に、セットアップ全体を滲出液収集用のキャビネットに配置します。ライトラインで、濡れたペーパータオルで透明なプレキシガラス容器の底を並べます。リーフ充填反応チューブを入れたラックを容器に入れ、閉じます。

容器からラックを取り出した後、1時間後に葉を反応チューブから取り出します。葉を蒸留水でよく洗い、EDTAをすべて取り除きます。すぐに葉をミリポール水を含む反応チューブに移し、加湿容器からラックを取り出した後、滲出液を収集するために加湿容器に戻します。.

5〜8時間後、チューブから葉を取り出し、流れの滲出液を液体窒素で凍結し、摂氏マイナス80度の冷凍庫に保管します。翌日のさらなる分析のために、脂質分析の準備としてサンプルを解凍します。次に、2〜3個のサンプルを採取し、同量のクロロホルムとメタノールを結合溶液に加えます。

混合物を数秒間ボルテックスします。次に、サンプルを400 gで4分間遠心分離します。終了したら、上部相とのパーティションをさらに3回繰り返した後、下部の有機相をガラス管に収集し、結合した有機相を窒素の流れの下で乾燥させ、薄層クロマトグラフィーおよびLCMS分析に提出します。

この方法により、十分な量のフェム滲出液を採取して、フェム局在タンパク質と、発生またはストレスに応答したそれらのレベルの変化を特定できます。場合によっては、研究者はタンパク質の分解を防ぐためにプロテイナーゼ阻害剤を使用したいと思うかもしれません。ここに示すように、タンパク質の存在量は非常に少ないですが、そのレベルはその後のプロテオミクス実験に十分な高さです。

LCMSを使用したり、ウリ科のウェスタンブロット解析を行ったりした結果から、STEMの切断は水ポテンシャルバランスの乱れを引き起こし、その後の水の流入やアラストからの汚染物質の可能性が示唆されています。ただし、1時間から8時間の範囲での収集は、フローMタンパク質プロファイルおよびInOpSysの組成に影響を与えません。収集されるタンパク質の量と見つかるタンパク質のパターンは、種や処理によって異なります。

その結果、タンパク質シグナルを可視化、同定、追跡することができ、この方法により、mRNAおよびマイクロRNAもflom滲出液中に同定することができます。しかし、MRの分解を防ぐためには、RNA阻害剤による治療が必要です。延長滲出時間中のNA。

Cエレメントは機能的な葉緑体を含んでいないため、ルビス、低分子または大のサブユニットmRNAをネガティブコントロールとして使用でき、既知のpH flu m局在mRNAのようなユビキチン結合酵素をポジティブコントロールとして使用できます。同様に、糖または低代謝物は、GCMSまたはLCMSのいずれかを使用して分析できます。フェム滲出液には、解糖系経路のほぼ全体を含む多数の機能性酵素が含まれていることに言及すべきです。

したがって、いくつかの時点を使用すると、滲出液の収集中に代謝プロセスが明らかになる場合があります。すべての滲出液において、スクロースは最も豊富な代謝産物である。これは、1時間の収集後に最も明白になります。

ただし、5時間後、ショ糖とフルクトースの比率はわずかに減少します。同じ滲出液を1時間採取し、さらに4時間ベンチに置いておくと、ショ糖とフルクトースの比率ははるかに大幅に減少します。このことから、phem滲出液中の活性酵素が室温でショ糖を分解することが示されました。

さらに、5時間の連続収集でショ糖とフルクトースの比率がわずかに減少しただけであるという事実は、フェムのローディングとコンパニオン細胞から海への分子の輸送が、システムがその活力を失うまで滲出中に続く可能性があるという発見と一致しています。フェム滲出液中の脂質、ひいては長距離の脂質シグナル伝達は、植物科学においてかなり最近の関心分野です。その疎水性のため、脂質は低濃度でしか存在せず、可溶化のために他の分子に結合する可能性があります。

しかし、EDTAが促進する滲出により、いくつかの植物種からの流れと脂質を視覚化し、同定するのに十分な材料を収集することができます。ここに示すように、薄層クロマトグラフィーを用いて複数の脂質種を分離することが可能です。LCMSは、異なる脂質種を同定し、異なる遺伝子型または治療の脂質プロファイル内の変化をモニターすることを可能にします。

これにより、植物の発生とストレス応答における脂質の役割を研究することができます。一度習得すると、このテクニックは、適切に実行されれば、わずか3時間で行うことができます。ただし、ほとんどのサンプルでは、収集時間は5〜8時間をお勧めします。

この場合、葉の収穫は早朝に開始することをお勧めします。この手順は、他のプラントにも変更でき、新規のフロー化合物の発見または確認につながる可能性があります。この手順を試みるときは、最初の1時間後にPDLを徹底的に観察してEDTAを除去し、他の細胞の内容物による汚染を防ぐために葉を絞らないように注意することが重要です。

さらに、手袋を着用すると、皮膚から持ち込まれる可能性のある汚染物質からサンプルを保護します 汚染を防ぐために、タンパク質RNAまたは代謝物サンプルには適切なコントロールを使用してください。推奨される制御は、テキスト プロトコルに一覧表示されます。この方法により、プラントの流れの構成について新たな洞察を得ることができました。

フォーム滲出液中のいくつかの脂質を同定することができましたが、これらは床の水性環境では予想されませんでした。これをきっかけに、私たちや他の研究者は、長距離脂質シグナル伝達の概念を導入し、現在ではエキサイティングな新分野のインプラント研究に発展しています。