の収集と分析

本手順の全体的な目的は、Arabidopsisやその他の植物から篩管滲出液を回収し、その内容物を分析すること、または篩管流中の化合物の存在を確認することです。これは、まず、篩管要素の閉塞を防ぐために、花弁を切り取り、EDTAカリウム中でインキュベートすることによって達成されます。次のステップでは、その後の分析を妨げたり、長時間の曝露によって細胞を損傷させたりする可能性がある残留EDTAを除去するため、花弁を十分に洗浄します。

次に、フローEM滲出液を水中に回収します。最終ステップとして、LC-MS/GC-MS、ゲル電気泳動、および薄層クロマトグラフィーによる後続分析のためのサンプル調製を行います。最終的に、EDTAで促進されたphem滲出を用いることで、代謝物や脂質、タンパク質、RNAなどのphem含有量を分析および確認することが可能です。

植物は不利な環境条件から逃れることができません。そのため、環境信号を植物全体に伝え、成長・発達を変化させることで対応するための、非常に効率的で迅速なシステムを必要としています。こうしたシグナル伝達経路の一つに植物フローがありますが、その組成を理解することは非常に困難です。

流体内容物の採取および分析には、EDTAを用いたフロー鎮静法を使用します。この手法はもともとPerillaにおいてkingらによって開発されましたが、他の種にも容易に適用可能です。本手順のデモンストレーションは、私の研究室の学部生であるElenaとUSが、手順の開始前に行います。

採取当日まで、12時間の光周期に設定した育成室でArabidopsisを4〜6週間栽培します。あらかじめ調製しておいた100 millimolarカリウムEDTA溶液を水で希釈し、最終濃度を20 millimolarにします。次に、直径7〜15 centimeterのガラスシャーレ2枚に、20 millimolarカリウムEDTA溶液を半分まで満たします。

完了後、1.7 mL反応チューブに20 mMカリウムEDTA溶液を1.4 mLずつ満たします。次に、同数の反応チューブにミリポア水を1.4 mLずつ満たします。育成チャンバーから4〜6週齢の植物を取り出し、ロゼットの中心に近い花弁の基部をカミソリで切断して、ロゼット葉を採取します。

切断端を溶液に浸した状態で、葉を直ちに20 millimolar potassium EDTAを含むディッシュに入れます。3〜4個の植物から計15枚の葉を採取したら、切断した花弁同士が揃うように、それらを慎重に重ねます。花弁の基部を再度切断し、葉をそっと丸めます。

次に、浸出液を回収するため、20 millimolar potassium EDTAを含む反応チューブの1つに、丸めた葉をそっと挿入します。暗所で、大きな浅い皿の底に濡れたペーパータオルを敷きます。葉を入れた反応チューブがセットされたラックを皿の中に配置し、通気口のある黒いプラスチック袋に入れます。

次に、装置全体を滲出液回収用のキャビネットに入れます。透明なプレキシガラス容器の底に、濡れたペーパータオルを敷きます。葉を入れた反応チューブがセットされたラックを容器に入れ、蓋を閉じてください。

容器からラックを取り出した1時間後、反応チューブから葉を取り出します。蒸留水で葉を十分に洗浄し、EDTAを完全に除去します。直ちに、ミリポア水が入った反応チューブに葉を移し、ラックを加湿容器から取り出した後、滲出液を回収するために、再び加湿容器に戻します。

5〜8時間後、チューブから葉を取り出し、流出物を液体窒素で凍結させ、-80°Cのフリーザーで保存します。翌日のさらなる解析に向けて、脂質分析の準備としてサンプルを融解させます。次に、2〜3個のサンプルを抽出し、混合溶液に同量のクロロホルムとメタノールを加えます。

混合物を数秒間ボルテックスします。次に、サンプルを400 gsで4分間遠心分離します。終了後、上層を用いて分液操作をさらに3回繰り返し、底層の有機相をガラスチューブに回収します。合わせて回収した有機相を窒素気流下で乾燥させ、薄層クロマトグラフィーおよびLCMS分析に供します。

この方法を用いることで、phem滲出液を十分に回収し、phemに局在するタンパク質の同定や、発生またはストレスに応じたそれらのレベルの変化を解析することが可能になります。場合によっては、タンパク質の分解を防ぐためにプロテアーゼ阻害剤の使用を検討してください。本例に示すように、タンパク質の含有量は非常に少ないものの、そのレベルは後続のプロテオミクス実験を行うのに十分な量です。

LCMSまたはウェスタンブロット解析を用いたキュウリ科植物における知見から、茎の切断は水ポテンシャルのバランスの崩壊を招き、その結果、切り口から水や潜在的な汚染物質が流入することが示唆されています。しかし、1時間から8時間の範囲で採取時間を変えても、flow Mタンパク質のプロファイルおよび組成に影響は見られませんでした。採取されるタンパク質の量および検出されるタンパク質のパターンは、種および処理によって異なります。

その結果、タンパク質のシグナルを可視化、同定し、追跡することが可能になります。また、この手法を用いることで、フロム滲出液中のmRNAおよびmicroRNAを同定することも可能です。ただし、長い滲出時間におけるmRNAの分解を防ぐために、RNA阻害剤による処理が必要となります。

Cエレメントは機能的な葉緑体を含まないため、rubisの小サブユニットまたは大サブユニットmRNAを陰性対照として使用でき、一方でユビキチン結合酵素のような局在が既知のpH flu m局在mRNAを陽性対照として使用できます。同様に、糖や低分子代謝物はGCMSまたはLCMSを用いて分析可能です。なお、phem滲出液には、ほぼ全ての糖新生経路を含む多数の機能的酵素が含まれていることに留意してください。

したがって、複数のタイムポイントを用いることで、滲出液の回収中における代謝プロセスを明らかにできる可能性があります。すべての滲出液において、スクロースが最も豊富な代謝物でした。これは、1時間の回収後に最も顕著に現れます。

しかし、5時間後には、スクロースとフルクトースの比率はわずかに低下します。同じ滲出液を1時間収集し、その後さらに4時間ベンチ上に放置した場合、スクロースとフルクトースの比率は大幅に低下します。これは、根圏滲出液中の活性酵素が室温でのスクロース分解を促進していることを示唆しています。

加えて、5時間の連続回収においてスクロースとフルクトースの比率がわずかに減少したにとどまるという事実は、篩管の充填および伴細胞から篩管要素への分子輸送が、システムが活力を失うまで滲出中に継続している可能性があるという知見と一致しています。篩管滲出液中の脂質、ひいては長距離脂質シグナリングは、植物科学において比較的新しい関心分野です。脂質はその疎水性のため、低濃度でしか存在せず、可溶化のために他の分子に結合している可能性があります。

しかし、EDTAによる滲出の促進により、いくつかの植物種から流体および脂質を可視化し、同定するための十分な試料を回収することが可能になります。ここで示すように、薄層クロマトグラフィーを用いて、いくつかの脂質種を分離することができます。LCMSを用いれば、異なる脂質種を同定し、異なる遺伝子型または処理による脂質プロファイルの変化をモニタリングすることが可能です。

これにより、植物の発達およびストレス応答における脂質の役割の研究が可能になります。この手法に習熟し、適切に実施すれば、最短3時間で完了させることができます。ただし、ほとんどのサンプルについては、5時間から8時間の回収時間を推奨します。

このケースでは、早朝から葉の採取を開始することを推奨します。この手順は他の植物にも応用可能であり、新規のフロー化合物の発見や確認につながる可能性があります。この手順を行う際は、1時間後からPDLを十分に観察してEDTAを除去すること、また、他の細胞の内容物による汚染を防ぐために葉を絞らないことが重要です。

加えて、手袋を着用することで、皮膚から混入する可能性のある汚染物質からサンプルを保護することができます。汚染を防ぐため、タンパク質、RNA、または代謝物サンプルに対して適切なコントロールを使用してください。推奨されるコントロールはテキストプロトコルに記載されています。本手法により、植物フローの組成に関する新たな知見を得ることができました。

我々はフォーム滲出液の中から、床という水圏環境では想定されないいくつかの脂質を同定することができました。これにより、我々や他の研究者は長距離脂質シグナリングという概念を導入することとなり、それは現在、インプラント研究という刺激的な新しい分野へと発展しています。