連続の設計および動作

この手順の全体的な目的は、植物全体に均一に、あるいは構造組織や代謝組織に特異的に、炭素13および窒素15が高濃縮された植物材料を調製することです。まず、植物育成用の気密チャンバーを構築します。次に、チャンバー内の温度、湿度、および二酸化炭素濃度を制御し、植物に適した生育条件を維持します。

次に、13 Cを含む空気、二酸化炭素、および15 Nを含む灌漑水と肥料を用いて、密閉チャンバー内で植物を育成します。最終ステップは、収穫の数週間前に、ラベル付けされた植物をチャンバーから出すことでラベル付けを停止させ、代謝物質中の13 Cおよび15 Nの濃縮度を低下させることです。植物材料の収穫後、構造的植物成分と比較して、熱水抽出法および同位体比質量分析法を用いて、全体的な同位体ラベル付けおよびラベル付け強度の差を測定します。

葉面散布や繰り返しパルスラベル法などの他の手法と比較して、連続ラベル法の主な利点は、代謝成分または構造成分を分的にラベル化した、均一にラベルされた植物材料を得られることです。この手順を開始するには、付属のテキストプロトコルに従い、白く塗装された鋼鉄製の床を備えたアルミニウムフレームに、厚さ3.18 mmの透明アクリル壁と厚さ6.35 mmの透明アクリル天井を取り付けてラベル化チャンバーを構築します。チャンバーの寸法は、特定の植物の成長ニーズに合わせて調整可能です。ここに示されているチャンバーのサイズは1.2 × 2.4 × 3.6 mで、15 Lのポットを40個収容できます。すべての継ぎ目を適切なシリコンシーラントで覆い、チャンバーが気密状態であることを確認してください。

ドアを取り外し可能なウィングナットで締め付けおよび緩めができる機械ネジに取り付けます。ラベル付けチャンバーに直接隣接する領域での空気漏れを防ぐため、ウェザーストリッピングでドアを密閉します。コントロールセンターをモニターに取り付け、チャンバー内の温度、湿度、および二酸化炭素を調整します。

チャンバー内に導入する電気配線およびガス配管は、空気漏れを防ぐため、シリコンで十分に密封してください。必要に応じて、光の透過性を高め日長を制御するためにチャンバー内に照明を追加します。チャンバーの温度を調節するため、商用セパレート型エアコンを設置します。この際、蒸発器コイルをチャンバー内部に、コンプレッサーと凝縮器コイルを排熱のためにチャンバー外部に配置してください。

次に、小型の室内用除湿機をチャンバー内に設置します。除湿機の隣の床に穴を開け、除湿機からの排水チューブをその穴に通し、あらかじめ水を入れた瓶の中に差し込みます。これにより、排水口が気密封止され、圧力が平衡状態に保たれます。また、湿度センサーを備えたOmega Eyeシリーズなどのプログラマブルコントローラーを除湿機の電源に接続することで、チャンバー内の湿度を調節します。

次に、ダイアフラムポンプを備えた赤外線ガス分析計またはER aを設置し、チャンバーからER Aを通して空気を連続的に吸引し、再びチャンバーに戻るようにします。これにより、チャンバー内の二酸化炭素濃度を連続的にモニタリングしながら、閉鎖系を維持します。続いて、2本の純二酸化炭素ガスボンベを二酸化炭素制御システムに接続します。

一方のタンクには10 atom%以上の$^{13}\text{C}$二酸化炭素を、もう一方のタンクには天然存在比の$^{13}\text{C}$二酸化炭素を入れてください。タンクレギュレーターを20 PSIに設定し、レギュレーターの下流のガスラインにソレノイドバルブを設置して、Ergoソフトウェアによる二酸化炭素注入の制御を可能にします。

ソリノイドバルブをソリッドステートリレープログラムを介してER rgaに接続し、その開閉を制御します。ergasソフトウェアのローアラームを設定し、チャンバー内の二酸化炭素濃度が一定値まで低下した際にソリノイドバルブを開き、デッドバンドを設定して二酸化炭素濃度が上限設定値に達した際にバルブを閉じるようにします。ソリノイドバルブの後に、2本のガスボンベラインそれぞれに計量バルブを取り付け、雰囲気中のcarbon 13濃縮レベルが所望の値になるよう慎重に調整します。

ここでは、4.4原子パーセントの炭素13濃縮度を使用します。出口同士を接続し、最後にラインをチャンバー中心のファンの間に配管します。これにより、ラベル化された二酸化炭素をチャンバー全体に均一に分散させ、灌水システムを構築します。まず、ポットごとに1つの点滴灌水リングを作成し、灌水チューブをチャンバー壁に設けた小さな穴を通して外部へ出します。

次に、チャンバー外部からの空気漏れを防ぐため、灌漑チューブ周囲の穴をシリコンコーキングで密封します。灌漑チューブをペリスタルティックポンプのチューブに接続し、灌漑の合間に空気が漏れないよう、小さなホースクランプを取り付けます。生存率を確保するため、ポットに植える前に種子を発芽させ、新鮮な土壌スラリーで苗を接種します。有益な微生物を導入するには、土壌からの未標識の炭素および窒素の混入を排除するため、ポットに土なし培養土を充填してください。

ここでは、砂、バーミキュライト、および多孔質セラミックの混合物を使用します。種子が発芽したら、少量の培養土を入れたポットに苗を注意深く移植してください。その後、ポットをチャンバー内に移動させ、各ポットに個別の灌水ホースを取り付けます。

最後に、チャンバーのドアを密閉し、二酸化炭素濃度が少なくとも 200 〜 250 parts per million まで低下するまで、ソーダライムスクラブバーをエアポンプに接続して外部の二酸化炭素を除去します。その後、チャンバー内を 400 parts per million まで再び充填します。13 C 二酸化炭素混合ガスタンクを使用し、天然存在比の二酸化炭素による汚染を最小限に抑えるため、栽培期間中は可能な限りチャンバーを閉鎖したままにしてください。

まず、98 atom%の$^{15}\text{N}$硝酸カリウムを天然存在比の$^{15}\text{N}$硝酸カリウムと混合し、それをホーキン溶液（Hooker solution）の残りに加えることで、$^{15}\text{N}$で標識したハイランド型肥料溶液を作成します。ここでは、7 atom%の$^{15}\text{N}$溶液を施肥に使用します。ペリスタルティックポンプを用いて、$^{15}\text{N}$標識肥料溶液を灌水チューブ経由で供給してください。

UNCクランプで灌漑ホースを固定し、個々の植物に対して、要求量および実験計画に従って異なる量の肥料を分注します。次に、ホースに水をポンプで送り、ホース内から肥料を洗い流します。肥料の浪費を最小限に抑えるため、添加する液体の総量はポットの保水容量を超えないようにしてください。

受粉および灌水後、チャンバーの空気漏れをなくすために、すべてのホースをクランプで固定します。構造成分と代謝成分を区別して標識させるには、収穫の1〜3週間前に植物を標識チャンバーから取り出します。均一に標識させたい植物については、収穫までチャンバー内に保持します。

老化を誘導します。準備が整ったら、単に灌水を停止してください。まず地上部のバイオマスを刈り取ってから、植物を収穫します。

地上部バイオマスを回収した後、ポット用用土と根を6 mmのコアスクリーンに注ぎ、用土から根を分離します。次に、根を2 mmのスクリーンで洗浄し、残っている用土を取り除きます。必要に応じてピンセットを使用し、根に付着した用土を除去した後、今後の実験に備えて根を風乾させます。

3回の作付け期間にわたり、本チャンバーはコントロールセンターで設定された通り、温度を26〜29 °C、湿度を36〜56 %、二酸化炭素濃度を360〜400 ppmの間で正常に維持しました。ここでは、2011年の作付け期間におけるAndra Pogon Girard diの代表的な結果を示しています。夜間の呼吸による二酸化炭素の蓄積は、成長中の植物に悪影響を及ぼしていないようであり、日の出後に速やかに吸収されています。

標的とする7 atom %の15N含有ホグリン溶液を用いた15N標識により、6.7 atom %の15Nを含む高度に標識された植物試料が得られた。標的とした15N標識からわずかに希釈されたのは、植え込み用培養土に含まれる天然存在比の窒素、あるいは自生土壌による接種が原因であると考えられる。標的とする4.4 atom %の13C二酸化炭素を用いた13C標識では、4.46 atom %の13Cが得られた。均一に標識された植物試料全体において、収穫の7日、14日、または22日前にチャンバーから取り出された差分標識植物は、13Cおよび15Nにおいて有意な差を示した。

熱水抽出物として得られた代謝成分と、その抽出残渣として得られた構造成分の内容は、植物の代謝材料と構造材料のラベル化に差があることを示しています。この手法の開発後、連続二重同位体ラベル化により、生物地球化学の研究者が、マクロおよびナノスケールにおける環境中での植物成分の運命と変換を探索することが可能になりました。