Name: 連続の設計および動作 13 Cと 15 N標識化会議所、工場同位体ラベル化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-16T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 学ぶ連続的な¹³Cおよび¹⁵N同位体標識チャンバーの構築・運用方法。植物組織の均一または差別的標識により、代謝プロセスの研究に有用な高濃度標識試料を作成できます。

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コロラド州立大学の植物の成長ファシリティとEcoCore分析施設へと、このプロジェクトに貢献し、多くの生徒と教師に感謝します。この作品は、NSF DEBグラント＃0918482によって資金を供給され、米国農務省国立はフェローシップを必要とし、土壌の生態研究のためCotrufo-Hoppess基金。

1。チャンバー建設<ol><li>植物の成長のための最大の自然光の可能性を可能にするために、温室内でラベル室を構築します。十分な電力供給がすべてのチャンバコンポーネントに電力を供給するために利用可能であることを確認してください。 </li><li> 3.175ミリメートルの厚さの透明なアクリル壁（ポリカーボネートも適切である）、および6.35ミリメートル日射反射率を最大化するために、白塗りの鋼床アルミフレームに厚い透明なアクリルの天井を搭載することでラベル室を構築します。チャンバの寸法は、個々の研究ニーズに合わせて調整することができる。 </li><li>シンダーブロックで（19ミリメートル）の合板に¾上室をマウントします。 </li><li>アクリルガラスのドリル穴、アルミフレームとスチールフロアと一緒にすべての部品を固定するネジを使用します。 </li><li>気密シールを確実にするために、シリコンコーキングを持つすべての縫い目をシール。 </li><li>サンレモを使用してダウンしてねじ込むことができ、長いネジ​​、アクリルのパネルの1セクションを搭載することで、ドアを構築vable蝶ナット。 </li><li>空気漏れを防止するために、ウェザーストリップとドアをシールする。 </li><li>すべての温度、湿度、CO 2コントロール、および監視装置をマウントするコントロールセンターとしての室に直接隣接領域を選択します。 </li><li>慎重にすべての電気配線とガス配管のコントロールセンターに隣接するチャンバ壁の小さな穴をドリル。空気漏れを防ぐために、すべてのワイヤとチューブの周りに孔を封止するシリコーンコーキングを使用する。 </li><li> CO 2のハイレベル（ 例えば 800 ppm）ので塗りつぶすことで、それを一晩放置させることで、空気漏れのための室をテストします。チャンバ内のCO 2濃度がその元のレベルに維持される場合、それは気密性 ​​である。濃度が一晩に低下した場合に気密シールが達成されるまで、すべての縫い目を検討し、シリコーンコーキングを再密封する必要があります。 </li><li>高い光条件に適応いくつかの植物のために、Cのすぐ外側にタイマーに接続ライトを追加光透過性および植物生産性を向上させるhamber。 </li></ol> 2。温度と湿度を制御し<ol><li>熱を放散するために、温室の外側に配置されたチャンバの内側に配置冷却器（蒸発器）コイルと、圧縮機と凝縮器コイルを有する市販の分割型空調機を設置することにより、チャンバ温度を調節する。所望の温度を維持するためにエアコンを設定する。 </li><li>室内の湿度を制御するために、小さな部屋の除湿機を使用してください。 <ol><li>除湿機に隣接する室内の床を通して排水孔を開けます。 </li><li>除湿器から復水コレクタを外し、室内の床にある排水孔から除湿機からの排水管を接続してください。 </li><li>チャンバーの下に、直接排出する除湿のために水で満たされたオープンjarファイルを配置します。これは気密シールを作成しますが、また、圧力平衡を可能にします。 </li></ol></li><lI&gt;チャンバー内の湿度センサを使用して、コントロールセンターにおいて、このようなオメガのiSeriesコントローラとしてコントローラをインストールします。 <ol><li>ソリッドステートリレーと除湿システムにコントローラを接続し、高アラームに湿度制御装置を設定し、チャンバー内の最適な生育条件を維持するためにスイングします。最適な温度および湿度条件が異なる植物種ごとに異なる​​であろう。 </li></ol></li></ol> 3。 CO 2を制御し<ol><li> 13 C-CO 2富化は2つの純粋なCO 2ガスタンク、10原子％13 C-CO 2以上、1.1原子％13 C-CO 2（天然存在）のいずれか一つを用いて達成される。 </li><li>ダイヤフラムポンプが連続的に赤外線ガス分析計（IRGA）を介してチャンバの空気を吸引した後、このように閉じたシステム（ 図1）を維持し、バックチャンバーに空気をポンプ持つことによってCO 2濃度を監視します。 </li><li> SE所望の範囲内のCO 2濃度を維持するのにIRGAソフトウェアについてのTA下限アラームデッドバンド。ここでは、360から400 ppmの間のCO 2濃度を維持するために40 ppmの不感帯を360 ppmと下限アラームを使用しています。 </li><li>各タンクに計量バルブを接続して、慎重にターゲット13のC濃縮レベルを達成するためにそれらを調整します。 20 PSIにタンクレギュレータを設定します。 </li><li>計量バルブ及び各タンクのレギュレータ間の電磁弁を挿入します。室の中心に一緒に2絞り弁の出口とパイプ話しましょう​​。電磁弁（ 図1）を制御する配線IRGA出力するソリッドステートリレー。 </li></ol> 4。ウェブベースの遠隔監視システム<ol><li> IRGAソフトウェアからのCO 2濃度は、一回30秒、ローカルファイルにログインすることで監視します。 </li><li>迎えにカスタムユーティリティ（ たとえば 、Perlや他のプログラミング言語の）を作成現在のラップトップのタイムスタンプと一緒に、地元のCO 2のログファイルのエントリをバックアップし、バックエンドのWebアプリケーションにアップロードします。 </li><li>温湿度センサデータを照会するためにウェブアプリケーションを設定する。 </li><li>空調システムが失敗した場合、植物を破壊する潜在的な温度スパイクを防止するためにチャンバ内に5分ごとに温度の状態をチェックする監視システムを使用する。 </li><li>予想外の温度の急上昇またはCO 2滴がすぐに出席できるように、標準的なWebブラウザ上でのCO 2、温度と湿度のデータを監視します。 </li></ol> 5。かんがいシステム<ol><li>ポット当たりアクリルガラス室の壁に小さな穴を開けます。 </li><li>ポット当たり1点滴灌漑リングを作成し、外部にチャンバ壁を通して灌注管を供給する灌注管を使用してください。 </li><li>シリコンコーキングで灌注管の周囲に穴をシール空気漏れを防止する。 </li><li>チャンバーの外側に、蠕動ポンプ用のチューブに灌注管を接続してください。 </li><li>散水の間の空気漏れを防止するために、すべての灌注管を閉鎖する小ホースクランプを使用する。 </li></ol> 6。ポッティング植物<ol><li>栽培された植物のための適切なポットサイズを選択します。ここで、40は、15 Lポットを使用する。 </li><li>砂、バーミキュライト、およびプロファイル多孔質セラミックを混合し​​て、土壌のないポッティングミックスを作成します。 </li><li> 、満たされた鍋が乾燥して計量水で鍋を浸し、それを完全に排水することができ、そして濡れたポットを計量することにより、ポッティングミックスの保水能力をテストします。過剰なラベル肥料や水は水やりの際にポットから漏れないようにするには、この最大の保水能力を使用しています。 </li><li>ポットでそれらを植える前に、ポッティング土壌中の種子を発芽。これは、成功して発芽した種子は、ラベル室で開始されることが保証されます。 </li><li> Tに接種<html>彼は有益な微生物を導入する新鮮な土壌スラリーと苗。 </li><li>種子が発芽した後、慎重に必要な数のポットに苗を移植。 </li><li>鉢植えと、チャンバー内に鉢を移動し、個々の灌漑ホースで各ポットを組み立てる。 </li></ol> 7。商工会議所を密封する<ol><li>第一室への扉を密閉すると外気の大きな質量は、チャンバ空間を満たす。 13 C-CO 2のタンク混合物を使用して400 ppmまでバックチャンバーを充填する前に、少なくとも200〜250 ppmのまでのCO 2濃度をスクラブする空気ポンプをソーダ石灰洗浄器を接続することにより、この外部のCO 2をスクラブ。 </li><li>天然存在のCO 2混入を最小限に抑えるために生育期の期間を通してチャンバを閉じた状態に保つようにしてみてください。 </li><li>視覚的に植物の成長を監視し、需要に応じて施肥や灌漑を調整します。 </li></ol>イトルを記入 &quot;&gt; 8。施肥や灌漑<ol><li>灌漑システムを介して植物を受精させる、そのような変更されたホーグランドのソリューション23として、肥料溶液を使用してください。 </li><li>天然存在度15と15 N-KNO 3 98原子％を混合することにより標的原子％15 Nレベル15 N-KNO 3 subsolutionを使用して、15 Nと肥料を標識N-KNO 3（0.37原子％15 N）。 </li><li>ポッティングミックスの保水能力に基づいて、全室、各施肥イベント時に肥料溶液の十分をミックス。ガラスジャーに1ポットのための肥料の適切な量を置き、鉢があるので、多くのjarファイルを準備します。 </li><li>灌漑ホースのクランプを解除し、肥料溶液とのジャーの中で、それぞれを置き、蠕動ポンプに接続します。 </li><li>個々のドリップIRRIを通して蠕動ポンプを介して水をポンプによる水の植物gationホースは定期的に植物がそれを必要とするように。 </li><li>ホーグランド液で受精は、生産性を最大化するために、植物の生産性が増加するにつれて増加し、栄養需要に、植物の需要や実験計画に従うべきである。 </li><li>まず、チューブ内の藻類や細菌の増殖を最小限にするために通って水洗浄ポンプ、その後、灌漑ホースを通してホーグランドのソリューションポンプ。 </li><li>受精チャンバの空気漏れを排除する灌注後にすべてのホースを替刃を再。 </li></ol> 9。均一かつ特異的標識<ol><li>構造的および代謝性成分の差動標識のために、1〜3週間前に収穫するためにラベリング室から植物を取り出します。均一に標識される植物は収穫まで継続的に密封されたラベル室に残り、15 Nホーグランド液で灌漑することができます。 </li><li>彼らは十分な光を受け取るように、この時間の間に、温室で取り外した植物を保つそして天然存在13℃でのCO 2 </li><li>差動15 N標識のために、受精し、通常の植物を灌漑し続けますが、ホーグランドの肥料溶液中で自然存在比を15、N-KNO 3を使用しています。 </li></ol> 10。収穫<ol><li> 1週間その収穫前の植物が老化し始め、ポッティング媒体が乾燥植物の水やりを停止。 </li><li>室を開いて、地上部バイオマスの直接のクリッピングや収穫のためにポットを移動</li><li>粗い画面上のポッティングミックスと根を注ぐ。 </li><li>ポッティングミックスから根を分離し、ポッティングミックスの自由な根を振って画面を使用します。 </li><li> 2mmの篩上に根を置き、残りのポッティング材を除去するために水でそれらをすすぐ。ルーツに固執性のあるバーミキュライトを削除するためにピンセットを使用してください。 </li><li>将来の実験に備えて空気乾燥根を許可する。 </li></ol><ol><li>ラベル室バイオマスを決定するために、空気乾燥植物材料を計量。 </li><li>化学分析のためのサブサンプルを挽く。 </li><li> 125ミリリットル酸オーブン乾燥（60℃）ごみの2.0グラムを置き、フラスコを洗浄し、脱イオン水50mlを加える。 </li><li>予熱した（60℃）攪拌器プレート上のサンプルを置き、フラスコ内の撹拌棒を配置します。 200 rpmで攪拌​​を設定し、サンプルを30分間加熱することができます。 </li><li> 30分後、ナイロン真空濾過システムに20μmのメッシュを介して排泄液を濾過する。 </li><li>予め秤量した酸洗浄チューブに抽出を移し、凍結。 </li><li> 60℃で予め秤量したアルミパンとドライに固形のごみ残基を転移温水残量を決定するために、乾燥した後、パンやゴミの重量を量る。 </li><li>熱水抽出物を乾燥凍結し、熱水抽出物の質量を決定するために秤量する。 </li><li>オーブン乾燥（60°C）同腹、凍結乾燥した温水を分析抽出し、元素分析でのオーブンで乾燥させたお湯残基 - 同位体比質量分析計（EA-IRMS）。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

連続的な同位体標識チャンバのためのこの設計は、均一かつ示差的に13 Cおよび15 N標識A.を製造するために使用されたその後のフィールドと実験室での実験のためにgerardii。 3つの動作生育期の間、チャンバは正常温度、湿度、設定されたパラメータ内のCO 2濃度（ 図2）を維持している。温度制御システムの信頼性が高い太陽放射が気密室の過熱引き起こす可能性が夏のピーク時に重要である。成長している植物からの蒸散によって引き起こされる過剰湿度を排除することにより、植物の気孔は、光合成の取り込み22ためにオープンされたまま、その水の凝縮が光の侵入を阻害するか、チャンバーの構造に損傷を与えないようにします。 IRGAソフトウェアによるCO 2濃度がほぼ連続的な監視を継続的に維持植物の13 C標識それらがチャンバ内に成長している。原因Aの高い光合成活動へgerardiiこのチャンバー内で成長して、CO 2は光合成活動が360 ppmで、およそ毎15〜20分までのCO 2濃度を描いたピーク生育期の昼光時間中に頻繁にシステムに注入した。均一な植物組織標識のための生育期間を通して制御さ4.4原子％13 C雰囲気下で許可さ富化および天然存在度の13 C-CO 2タンクの計量。13 C-CO 2産生もまた13 C-ナトリウムを混合することによって達成することができる重炭酸塩、または13 C-炭酸ナトリウムと塩酸は、しかし、この種のシステムはより複雑で、より多くの監視やメンテナンスが必要なので、私たちは、13 C-CO 2ガスを使用することをお勧めします。 CO 2 conceを監視するための重要な考慮事項IRGAを使用してntrationsは13、C-CO 2を測定する際に赤外線アナライザは、それらの感度の三分の二を失うということです。私たちの4.4％13 C-CO 2混合物は約2.9％のPPMは、この過小評価は私たちにとって大きな関心事ではありませんでしたが、より高い13 C値27でラベル付けする際に、より重要な問題になる可能性があります。 のA. gerardiiは多年生トールグラスにはイネ科植物の種を草原暖かい季節です。このチャンバーの設計はAのために最適化されたgerardii生産（ 図1）。チャンバのサイズおよび高さは、A.の最大高生産性を考慮して選択したフィールド内だけでなく、将来の実験のための所望の植物バイオマス生産のためのgerardii。A. gerardiiは、フィールド24,25に限定された光であることが知られている。外側のレベル26と比較して、温室内のPARは30から47パーセントだけ減少することができる。以来、私たちの工場sがPAR制限が懸念された、温室内部アクリルガラスチャンバー中で増殖させた。オンにすると、蛍光灯は、この感光性の種で生産性を向上させるために貢献している可能性がある、9.5％室内にPARを増加させた。このような大きさ、照明、栄養要求、温度感受性、及び土壌水分等の植物特定の生理学的なニーズの他のタイプを成長させるために、このチャンバ設計を使用するときに慎重に植物のための最適な生育条件を維持するように調整されるべきである。 このような10原子％13 C-CO 2と98原子％15 N-KNO 3のような高価な同位体標識化合物、を使用する場合は、ラベル付けの効率が重要な検討事項である。このチャンバー設計は、チャンバーを密封しに、チャンバーから空気の漏れを最小限に抑えるためにあらゆる努力を行うことで、13 C標識を最適化します。この室は、生育期間中に開かれることはありません場合は、13 C標識のどれもチャンバからのCO 2が大気中に漏洩した編。夜間の呼吸の際のCO 2ビルドアップは成長する植物を損傷しないようで、すぐに日の出（ 図2）の後に巻き取られる。差動標識の中に、チャンバーを簡単に区別して標識ポットを削除するために開かれたが、これは継続的にラベルされた植物（ 表1）の対象となる4.4原子％13 C標識を希釈しないようであった。13 C標識も出スクラビングによって最適化された初期の大気は、シールの際にチャンバー内に閉じ込められた。大気中のCO 2の初期スクラブなくチャンバに予備試験中に、植物は生産後の葉に比べて生産第一葉の希釈13 Cレベルを持つようにして測定した。室閉鎖の際に大気中のCO 2の初期スクラブから連続13 C標識に可能にすることによって、この問題を解消するために表示されます満期まで苗。砂、バーミキュライト、粘土の土壌のないポッティング混合物を維持することは、自然豊かな土壌呼吸からのCO 2の混入を排除します。システムからの土壌の除去は、異なる植物種に固有とすることができる、慎重受精および接種の考慮を必要としません。6.7原子％15 N（ 表での高いラベル植物材料を生産目標と7原子％15 N Hoeglandの液を介して15 N標識の1）。対象となる15 N標識からのわずかな希釈がポッティングミックスにまたはネイティブ土壌接種からいくつかの自然豊かNによって引き起こされることがあります。 化合物の生合成の間に、13℃（または15 N）の自然な差別は運動分別し、合成された化合物中の非統計同位体分布の結果として起こる。このように、C言語の場合には、二次製品（ 例えば脂質一次生成物（炭水化物）と比較して、フェノール化合物）は、一般に13 Cに枯渇している。熱水抽出物と均一に標識された植物（ 表1の温水残基の原子％13 Cのわずかな差に見られるように植物を、濃縮された13 Cの雰囲気中で成長させるとき、この自然の13 C判別も持続するように思われる）。この自然な運動分別富化と比較して非常に小さく、標識の均一性を損なわない。 構造的および代謝性植物組織の微分ラベリングはリター分解、微生物生態学、土壌有機物形成における高度な研究のための可能性を秘めた新しい技術である。 13 C及び熱水抽出物及び熱水残基の15 Nの差が低く、13 Cおよび15 Nでの浸出可能なかなりの希釈を示す構造的な植物材料（温水残基）の分子量化合物（熱水抽出物）は、差動標識（P &lt;0.005）の7,14、および22日後。植物組織のこの特異的標識は、生態系を通って別々の構造的および代謝的構成要素の運命を追跡するために使用することができる。 13 Cの差ラベリングは15、N個の差動ラベルよりも極端だった。 13 C-CO 2ラベル雰囲気から植物を除去する際に15 N標識は、まだしばらくの間ポッティングミックスに残り、15 Nの希釈は、よりゆっくりと行われている間、これは、13 Cの希釈の即時性に起因する可能性がある。 15 Nのより抜本的な差動標識のため、1室の外の成長の最終週の間の前に天然存在受精するために水でポットをフラッシュ検討することもできます。 この連続13の設計及び動作&lt;均一または差動、代謝および構造、植物組織標識用/ SUP&gt; Cおよび15 N標識システムは、高度な研究のための同位体標識された植物材料を製造するための新規な方法を提供する。このチャンバーの設計や動作の詳細は、4.4原子％13 CとAの7原子％15 N標識に選択されていますgerardiiが、他の植物の種類および同位体標識化レベルに調整することができる。ここで説明する成長条件は、関心のある特定の植物種の大きさ、温度、湿度、光、水及び栄養の要求に合わせて調整されるべきである。 18 O又はH 2での標識はまた、灌漑システムに用いられる水を標識することによって達成することができる。ここで説明するシステムは、均一の課題の多くを解決し、植物材料の13 C標識差動。この基本的なチャンバ設計は、副ための高度に標識された植物材料を生産する他の研究グループによって使用され得る生態系の生物地球化学の研究をとれた。

植物土壌大気プロセスのダイナミクスを理解することは、正確に、現在および将来の環境条件の下でどのようにグローバル炭素（C）と窒素（N）サイクル機能を予測するために重要である。安定同位体は、植物、土壌、大気、CとNサイクルの定量的研究における強力なツールです。生態系を通して植物材料から希少な安定同位体をトレースすると、CO 2フラックスと土壌有機物の形成から例えば 4,8,9のプロービング小規模な安定同位体のバイオマーカーに、生物地球化学的循環の研究に重要な情報を提供します。 15 N標識化、あるいは2 Hまたは植物組織内の18 Oのような他の安定同位体と13 C標識を組み合わせることにより、高検出、植物や土壌生化学の結合された研究で使用するための追跡可能な、まだ複雑な基板を提供する。均一または差別的、構造的および代謝性植物材料広告を標識する能力C、Nの生態系を循環に関する複雑な問題に対処するためのDSはさらに能力。 CおよびN会計の定量的研究において、同位体標識された植物材料を使用する利点は、しかしながら、13 Cとのいずれか又は均一に示差的に標識されている15 N標識された物質を産生する能力に依存する。 同位体標識は、植物C ​​及びN同化10、割当rhizodeposition 11と12をアドレス指定する研究において使用されている。均一に13 Cおよび15 N標識した植物材料は、リター分解の1,4の研究のための複雑な標識基質を提供し、土壌有機物の形成2,6、土壌のCO 2土壌食物網が13を研究排出量4、および土壌Cの研究滞留時間2,14。ラベルされた植物材料から13 Cラベルされたバイオ炭を利用した研究も以前は見過ごさに関する新しい情報を明らかにし始めている土壌のcharプール15。 15 N、2 Hおよび18 O標識化は、水と肥料処理を介して達成することが比較的容易であるが、課題は、13 C-CO 2固定を介して均一に13 C標識された植物材料の製造中に存在する。 密閉室での満期までの実生からの連続同位体標識は、プラント全体に均一な同位体標識を生成します。このような繰り返されるパルス標識16および葉面散布または17,18ウィッキングのような他の方法は一様に、同位体ラベル植物材料、また、特定のC-化合物（ 例えば 、代謝対の構造）の明確な微分ラベル19を生成しない。同位体標識における重要な検討事項は、ラベルで使用される希少な同位体濃縮化合物の高コストのために、効率のラベル付けされている。連続13 C標識が過去2-4,20で使用されてきたが、我々の知る限り存在しない高い標識効率および同位体標識の量と均一性の正確な制御の証拠を有する連続ラベル室の公表詳細な技術説明。 リター分解と土壌有機物形成研究の最前線に代謝植物材料（ すなわち浸出性、不安定性、低分子量化合物）と構造植物材料（ すなわち 。リグニン、セルロース、ヘミセルロース）は、微生物の点で異なる方法で処理されていることの概念である効率、土壌有機物の形成、および長期的な土壌のC貯蔵5-7を使用しています。差動でその構造や代謝のコンポーネントにラベル付けされた植物材料は、したがって、リター分解し、土壌有機物の形成の研究を進める上で便利なツールです。デュアル同位体による差動ラベルは、複数のプール同位体techniquを使用してエコシステムを通じて、別々の構造的および代謝性成分の追跡を可能にしE 21。 密閉されたチャンバー内で13℃、他の同位体を有する連続同位体標識は、工場の生産性と同位体標識効率を最大化するために、生理学的条件を植えるには十分注意して下さい。昼間温度スパイクは気密室で成長するとき、植物の損傷を防ぐために制御されなければならない。湿度および温度の最適範囲は、開放気孔植物及びCO 2取込み22を維持するために必要とされる。光可用性を最小限にし、チャンバ構造が破損する恐れがあり、チャンバ壁の湿度原因かぶりの高レベル。高価な重い同位体標識された化合物を処理する場合（ 例えば土壌有機物のポッティングから来る）室から天然存在同位体を排除し、外気への暴露を防止することにより、標識効率を同位体を十分考慮は重要です。 ここでは、構築し、動作させるための方法を提示受精および15 N標識されている間に均一に標識された又は異なるレベルで標識され、その構造的および代謝性成分を有するいずれかの植物材料を製造するための連続的な二重13 Cおよび15 N同位体標識室は13 C標識は、室レベルで制御され個々のポットレベルで制御。代表的な結果は、生育期間を通して、温度、湿度、CO 2濃度を制御するために、この方法の能力を実証するために示されている。成長Andropogonのgerardiiの結果、カウも一様に、または別々に標識植物材料を生産するこの方法の能力を示している。記載された特定のチャンバ設計及び動作方式は、異なる植物種を成長させるために、並びに2 H又は18 O標識を収容するように修飾することができる。

<table><tbody><tr><td>40 in リモートタワーファン</td><td>リビングアクセント</td><td>FS10-S3R-A</td><td></td></tr><tr><td>42 in 電動タワーファン リモコン付き</td><td>LASKO</td><td>2559</td><td></td></tr><tr><td>Mr. スリム スプリット型エアコン</td><td>三菱電機</td><td>R410A</td><td></td></tr><tr><td>電子 24 時間タイムスイッチ</td><td>Intermatic</td><td>ET100C</td><td>Operate Fluorescent Light System</td></tr><tr><td>iSeries 湿度および温度コントローラー</td><td>オメガ</td><td>CHiTH-i8DV33-5-EL</td><td></td></tr><tr><td>ソリッドステートリレー</td><td>オメガ</td><td>SSRL240</td><td></td></tr><tr><td>CKRシリーズソリッドステートリレー</td><td>Crydon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ソレノイドコイル</td><td>デイトン</td><td>6X543</td><td></td></tr><tr><td>ガスハウンド CO2 アナライザー</td><td>LI-COR</td><td>LI-800</td><td></td></tr><tr><td>除湿機</td><td>デイトン</td><td>1DGX4</td><td></td></tr><tr><td>特殊ガスレギュレータ</td>ー <td>エアガス</td><td>CGA 580</td><td></td></tr><tr><td>T5 高出力 商用蛍光灯システム</td><td>ハイドロファーム</td><td>FLT48</td><td></td></tr><tr><td>エアポンプ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>420-1901</td><td></td></tr><tr><td>マスターフレックスカートリッジポンプ ヘッドシステム</td><td>コールパーマー</td><td>7553-70</td><td></td></tr><tr><td>1900 シリーズネットワークスイッチ</td><td>触媒</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プロファイル 多孔質セラミックトップドレッシング</td><td>グリーングレード</td><td></td><td></td></tr><tr><td>工業用クォーツ40メッシュ</td><td>Unimin4095</td><td></td><td></td></tr>菌<tr><td>根プロフェッショナル成長培地</td><td>ProMix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>バーミキュライトとパーライト</td><td>サーモラン</td><td>C633</td><td></td></tr><tr><td>硝酸カリウム-15N 98原子%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>335134</td><td></td></tr><tr><td>カーボン-13C 二酸化物 10 原子 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>600180</td><td></td></tr><tr><td>医療グレード CO2</td><td>Airgas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レギュレータ</td>ー <td>エアガス</td><td>CGA 350</td><td></td></tr><tr><td>4 in box fans</td><td>グレインジャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マスターフレックス PharMed BPT チューブ</td><td>コール パーマー</td><td>HV-06508-24</td><td></td></tr></tbody></table>

連続の設計および動作<sup&gt; 13</sup&gt; cと<sup&gt; 15</sup均一または差動、代謝および構造·&gt; n標識化会議所、工場同位体ラベル化

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

生態系を通して植物材料から希少な安定同位体をトレースする生態系プロセスについての最も機密性の高い情報を提供し、CO 2フラックスと土壌有機物の形成からのプロービング小規模な安定同位体のバイオマーカーに。 15 N、18 Oまたは2 Hは生物地球化学的な変換の際の複雑な化学量論的な関係についてのさらに多くの情報を明らかにする可能性を秘めているとこのような13 Cのような、複数の安定同位体を結合させる。同位体標識された植物材料は、リター分解及び土壌有機物形成1-4の種々の研究において使用されている。これらおよび他の研究からは、しかしながら、植物材料の構成成分が異なる微生物の利用や長期炭素貯蔵5-7の面では、代謝性成分（ すなわち 。浸出性低分子量化合物）よりも振る舞うことが明らかになった。構造的および代謝のコンポーネントを研究する能力別途生態系生物地球化学研究の最前線を進めるための強力な新しいツールを提供しています。ここでは、13 Cおよび植物全体に均一に標識された示差的又は構造的および代謝植物成分で標識されるか、15 N標識された植物材料を製造するための方法を記載している。 ここでは、連続した13 C及び種々の研究ニーズを満たすように修正することができる15 N標識室の構成及び動作を提示する。特異的標識前に収穫室週間から成長する植物を除去することによって達成されている間に均一に標識された植物材料を収穫する苗からの連続標識により生成される。成長Andropogonからの代表的な結果は、カウが目標レベルで効率的にラベル植物材料に対するシステムの能力を実証するgerardii。この方法を通して、私たちは&lt;4.4原子％13 Cおよび6.7原子％15で植物材料を生産しています/ SUP&gt; N（それぞれ熱湯抽出可能と温水残留成分）均一植物ラベル、または差動で、その代謝および構造部品で、最大1.29原子％13 Cおよび0.56原子％15 Nで標識されている材料。課題は、成功した植物生産のための気密13 C-CO 2雰囲気中で適切な温度、湿度、CO 2濃度、および光レベルの維持にある。このチャンバーの説明は事実上の生態系物質循環の実験で使用するための均一または差動でマルチ同位体ラベル植物材料を製造するための有用な研究ツールを表します。

私たちのラベル室は、大きさが1.2 MX 2.4 MX 3.6メートルで、40,15 Lポット（ 図1）を保持している。コンピュータ化されたIRGA制御システムは、一日の光合成有効期間（ 図2a）中に360および400ppmの我々の設定値との間のCO 2濃度を維持した。 IRGAに低CO 2のアラーム機能では、濃度が最小しきい値（ 例えば 360 PPM）を下回った時にチャンバー内に13℃豊かで自然豊かタンクからのCO 2ができるようにソレノイドバルブを引き起こした。濃度は、上の設定ポイント（ 例：400 PPM）に達したときにデッドバンド機能は、フローを停止しました。生育期（ 図2b）を通じて設定されたパラメータ内の気候条件に保持された空気調和機及び除湿器に接続されたiSeriesの温度および湿度モニタリングシステム。私たちは、KEに1トン（3.5キロワット）空調ユニットを使用クールなチャンバーをep。 遠隔監視システムは、ログに記録されたデータは、標準的なWebブラウザでいつでも見ることができました。 CO 2濃度、温度および湿度の値は、ダウン24時間の増分で、過去24から240時間にわたってグラフを表示するためにウェブアプリケーションによってサンプリングした。これは日々の変動が予想される範囲内であったことを確認するために、迅速なビジュアルを作成しました。 Webインタフェースを表示すると、現在の室内の状況を示しただけでなく、このような最近のデータを受信して​​いないような潜在的な問題にアラートを提供した。いつでも完全なデータセットには、Webインターフェイスからダウンロードすることができた。 我々は真夏と量子センサーを使用してその日の途中でのライトとない4箇所で即時内部とチャンバーの外部に光合成有効放​​射（PAR）を測定した。チャンバー内のP​​ARは外部より31.5％低かったとき、チャンバライトWオフEREとランプが点灯していた外装よりも22パーセントも低い。これにより、チャンバ光が有意に9.5％（P &lt;0.05）によってチャンバ内のPAR浸透性を増大させるために役立つ。 当社の継続的なラベリングシステムは、Aの2759グラムを生成することができましたgerardiiバイオマスの37％が地上部バイオマスであり、63％が地下部バイオマスた。我々はそれに応じて2、CO 2のタンク（ 図1、表1）に電磁弁を設定することにより、私たちの一様な植物材料に4.4原子％13 Cプラント全体のラベルを達成しました。我々は、修飾されたホーグランドの溶液23のKNO 3 subsolution（ 表1）、15 N-KNO 3 0.37原子％と15 N-KNO 3 98原子％を混合することによって我々の一様な植物材料で6.7原子％15 Nプラント全体のラベルを達成。我々はAを骨抜き成長している海を通して750ミリリットル全流体（水+ホーグランドの溶液）でgerardii毎週息子。我々は、植物の生産性に応じて週ホーグランドのソリューションをラベル15、N 200〜500ミリリットルで受精。 我々は、均一で示差的に標識された植物材料との間の同位体比の相違があったかどうかを決定するために、熱水抽出法を利用した。区別して標識植物のため、収穫の際に、我々は完全に死んでいたし、彼らはおそらく異なって標識されていないとして、別々にこれらを取り扱う任意の葉を削除しました。 13 C含有量を見ると、4つのすべての組み込み日は植物全体及び熱水抽出のために互いに有意に異なったが、温水残基日の14および22（ 表1）は 、互いに有意差がなかった。各日内の植物組織分率を比較すると、熱水抽出物と残渣を全て4日間互いに有意に異なっていたと22日目により全植物、抽出物、残留物を全てsigniた互いにficantly異なる（ 表1）。植物成分に15 Nの取り込みのために、組み込みおよび植物組織画分の日数の違いがあった。熱水抽出物のための定款の日のすべての4は15のNのために大きく異なるようで、プラント全体とお湯残基を組み込むの短い日が混入した（ 表1）の長い日よりも有意に異なっていた。均一な植物における植物組織画分を15 Nで互いに有意に異ならなかったが、熱水抽出物と残渣を示差的に標識するためのリター15 Nにおいて互いに有意に異なっていた。 すべての同位体の値は、％が重いの高いレベルで使用するよりも、より正確な表記です原子％（原子％）表記（ 式1）を使用して報告される同位体濃縮21。たとえば、次のように<img alt="" height="54" src="/files/ftp_upload/51117/51117eq2.jpg" width="202" /> （1） この研究のために、我々はSASバージョン9.2を使用して統計分析を実行しました。我々は、対応のあるt-検定を用いてチャンバ内部と外部の光レベル間の差を試験した。我々は、13 C及びPROC ANOVAで一元配置分散分析（ANOVA）を用いて熱水抽出物及び熱水残基の15 N標識の間の差を試験した。我々は、複数の比較分析のためにDuncanの多重範囲検定を用いた。重要性は、0.05のPレベルで受け入れられた。我々はデータを解析仮定を満たしていることをテストするウィルコクソン順位和検定を使用していました。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51117/51117fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51117/51117fig1.jpg" /> 図1。Schemat鳥瞰図から40ポット容量連続マルチ同位体標識室のIC図。実線はガスや水の配管を表して点線は、電気配線を表しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51117/51117fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51117/51117fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51117/51117fig2.jpg" /> 。図2のA）の平均CO 2濃度（ppm）（+ / - 。全体の生育期のための24時間の期間にわたって、SE）、B）の平均温度（℃）、白丸、湿度（％）は、黒丸（+ / - SE）は、全生育期のための24時間の期間にわたって。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51117/51117fig2highres.jpg" target="_blank">大きなIMを見るにはここをクリックしてください</a>時代。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="559"><colgroup><col /><col /><col /><col /><col span="2" /></colgroup><tbody><tr height="17"><td height="17" style="height:17px;width:77px;"></td><td style="width:85px;"></td><td style="width:92px;">均一（0） </td><td style="width:97px;">差動（7） </td><td style="width:104px;">差動（14） </td><td style="width:104px;">ディファレンシャル（22） </td></tr><tr height="19"><td height="38" rowspan="2" style="height:38px;width:77px;">全体リター</td><td> 13 C原子％ </td><td> 4.46±0.02アブ</td><td> 3.93±0.05のBa </td><td> 3.64±0.03のCa </td><td> 3.35±0.06 Dbは</td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> 15個のN原子％ </td><td> 6.69±0.07 Aaの</td><td> 6.72±0.01 Aaの</td><td> 6.33±0.06のBa </td><td> 6.41±0.07のBa </td></tr><tr height="19"><td height="38" rowsパン= &quot;2&quot;スタイル= &quot;高さ：38px;幅：77px;&quot;&gt;熱水抽出物</td><td> 13 C原子％ </td><td> 4.59±0.04 Aaの</td><td> 3.35±0.06のBb </td><td> 2.79±0.06のCb </td><td> 2.37±0.03スイッチングdc </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> 15個のN原子％ </td><td> 6.69±0.03 Aaの</td><td> 6.43±0.01のBb </td><td> 5.89±0.07 Dbは</td><td> 6.16±0.05のCb </td></tr><tr height="19"><td height="38" rowspan="2" style="height:38px;width:77px;">お湯の残留</td><td> 13 C原子％ </td><td> 4.37±0.06アブ</td><td> 4.1±0.03のBa </td><td> 3.79±0.10のCa </td><td> 3.66±0.05のCa </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> 15個のN原子％ </td><td> 6.57±0.04のBa </td><td> 6.71±0.02 Aaの</td><td> 6.45±0.02のCa </td><td> 6.44±0.03のCa </td></tr></tbody></table> 表1。 <strong&gt;均一で異なって標識ごみ用の同位体組成やゴミ化学。室の外微分ラベルの日数は、括弧で囲まれています。設立の日の間の比較は（行全体で）大文字であり、リター画分の間、各変数の（列下）小文字である。

この方法は、連続13℃で均一または差動植物組織標識用15 N同位体標識室を構築し、操作する方法について説明します。代謝およびAndropogonのgerardiiの構造的な標識からの代表的な結果が説明されています。

連続の設計および動作<sup&gt; 13</sup&gt; Cと<sup&gt; 15</sup均一または差動、代謝および構造·&gt; N標識化会議所、工場同位体ラベル化

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes ...

この手順の全体的な目的は、植物全体に均一に、あるいは構造組織や代謝組織に特異的に、炭素13および窒素15が高濃縮された植物材料を調製することです。まず、植物育成用の気密チャンバーを構築します。次に、チャンバー内の温度、湿度、および二酸化炭素濃度を制御し、植物に適した生育条件を維持します。次に、13 Cを含む空気、二酸化炭素、および15 Nを含む灌漑水と肥料を用いて、密閉チャンバー内で植物を育成します。最終ステップは、収穫の数週間前に、ラベル付けされた植物をチャンバーから出すことでラベル付けを停止させ、代謝物質中の13 Cおよび15 Nの濃縮度を低下させることです。植物材料の収穫後、構造的植物成分と比較して、熱水抽出法および同位体比質量分析法を用いて、全体的な同位体ラベル付けおよびラベル付け強度の差を測定します。葉面散布や繰り返しパルスラベル法などの他の手法と比較して、連続ラベル法の主な利点は、代謝成分または構造成分を分的にラベル化した、均一にラベルされた植物材料を得られることです。この手順を開始するには、付属のテキストプロトコルに従い、白く塗装された鋼鉄製の床を備えたアルミニウムフレームに、厚さ3.18 mmの透明アクリル壁と厚さ6.35 mmの透明アクリル天井を取り付けてラベル化チャンバーを構築します。チャンバーの寸法は、特定の植物の成長ニーズに合わせて調整可能です。ここに示されているチャンバーのサイズは1.2 × 2.4 × 3.6 mで、15 Lのポットを40個収容できます。すべての継ぎ目を適切なシリコンシーラントで覆い、チャンバーが気密状態であることを確認してください。ドアを取り外し可能なウィングナットで締め付けおよび緩めができる機械ネジに取り付けます。ラベル付けチャンバーに直接隣接する領域での空気漏れを防ぐため、ウェザーストリッピングでドアを密閉します。コントロールセンターをモニターに取り付け、チャンバー内の温度、湿度、および二酸化炭素を調整します。チャンバー内に導入する電気配線およびガス配管は、空気漏れを防ぐため、シリコンで十分に密封してください。必要に応じて、光の透過性を高め日長を制御するためにチャンバー内に照明を追加します。チャンバーの温度を調節するため、商用セパレート型エアコンを設置します。この際、蒸発器コイルをチャンバー内部に、コンプレッサーと凝縮器コイルを排熱のためにチャンバー外部に配置してください。次に、小型の室内用除湿機をチャンバー内に設置します。除湿機の隣の床に穴を開け、除湿機からの排水チューブをその穴に通し、あらかじめ水を入れた瓶の中に差し込みます。これにより、排水口が気密封止され、圧力が平衡状態に保たれます。また、湿度センサーを備えたOmega Eyeシリーズなどのプログラマブルコントローラーを除湿機の電源に接続することで、チャンバー内の湿度を調節します。次に、ダイアフラムポンプを備えた赤外線ガス分析計またはER aを設置し、チャンバーからER Aを通して空気を連続的に吸引し、再びチャンバーに戻るようにします。これにより、チャンバー内の二酸化炭素濃度を連続的にモニタリングしながら、閉鎖系を維持します。続いて、2本の純二酸化炭素ガスボンベを二酸化炭素制御システムに接続します。一方のタンクには10 atom%以上の$^{13}\text{C}$二酸化炭素を、もう一方のタンクには天然存在比の$^{13}\text{C}$二酸化炭素を入れてください。タンクレギュレーターを20 PSIに設定し、レギュレーターの下流のガスラインにソレノイドバルブを設置して、Ergoソフトウェアによる二酸化炭素注入の制御を可能にします。ソリノイドバルブをソリッドステートリレープログラムを介してER rgaに接続し、その開閉を制御します。ergasソフトウェアのローアラームを設定し、チャンバー内の二酸化炭素濃度が一定値まで低下した際にソリノイドバルブを開き、デッドバンドを設定して二酸化炭素濃度が上限設定値に達した際にバルブを閉じるようにします。ソリノイドバルブの後に、2本のガスボンベラインそれぞれに計量バルブを取り付け、雰囲気中のcarbon 13濃縮レベルが所望の値になるよう慎重に調整します。ここでは、4.4原子パーセントの炭素13濃縮度を使用します。出口同士を接続し、最後にラインをチャンバー中心のファンの間に配管します。これにより、ラベル化された二酸化炭素をチャンバー全体に均一に分散させ、灌水システムを構築します。まず、ポットごとに1つの点滴灌水リングを作成し、灌水チューブをチャンバー壁に設けた小さな穴を通して外部へ出します。次に、チャンバー外部からの空気漏れを防ぐため、灌漑チューブ周囲の穴をシリコンコーキングで密封します。灌漑チューブをペリスタルティックポンプのチューブに接続し、灌漑の合間に空気が漏れないよう、小さなホースクランプを取り付けます。生存率を確保するため、ポットに植える前に種子を発芽させ、新鮮な土壌スラリーで苗を接種します。有益な微生物を導入するには、土壌からの未標識の炭素および窒素の混入を排除するため、ポットに土なし培養土を充填してください。ここでは、砂、バーミキュライト、および多孔質セラミックの混合物を使用します。種子が発芽したら、少量の培養土を入れたポットに苗を注意深く移植してください。その後、ポットをチャンバー内に移動させ、各ポットに個別の灌水ホースを取り付けます。最後に、チャンバーのドアを密閉し、二酸化炭素濃度が少なくとも 200 〜 250 parts per million まで低下するまで、ソーダライムスクラブバーをエアポンプに接続して外部の二酸化炭素を除去します。その後、チャンバー内を 400 parts per million まで再び充填します。13 C 二酸化炭素混合ガスタンクを使用し、天然存在比の二酸化炭素による汚染を最小限に抑えるため、栽培期間中は可能な限りチャンバーを閉鎖したままにしてください。まず、98 atom%の$^{15}\text{N}$硝酸カリウムを天然存在比の$^{15}\text{N}$硝酸カリウムと混合し、それをホーキン溶液（Hooker solution）の残りに加えることで、$^{15}\text{N}$で標識したハイランド型肥料溶液を作成します。ここでは、7 atom%の$^{15}\text{N}$溶液を施肥に使用します。ペリスタルティックポンプを用いて、$^{15}\text{N}$標識肥料溶液を灌水チューブ経由で供給してください。UNCクランプで灌漑ホースを固定し、個々の植物に対して、要求量および実験計画に従って異なる量の肥料を分注します。次に、ホースに水をポンプで送り、ホース内から肥料を洗い流します。肥料の浪費を最小限に抑えるため、添加する液体の総量はポットの保水容量を超えないようにしてください。受粉および灌水後、チャンバーの空気漏れをなくすために、すべてのホースをクランプで固定します。構造成分と代謝成分を区別して標識させるには、収穫の1〜3週間前に植物を標識チャンバーから取り出します。均一に標識させたい植物については、収穫までチャンバー内に保持します。老化を誘導します。準備が整ったら、単に灌水を停止してください。まず地上部のバイオマスを刈り取ってから、植物を収穫します。地上部バイオマスを回収した後、ポット用用土と根を6 mmのコアスクリーンに注ぎ、用土から根を分離します。次に、根を2 mmのスクリーンで洗浄し、残っている用土を取り除きます。必要に応じてピンセットを使用し、根に付着した用土を除去した後、今後の実験に備えて根を風乾させます。3回の作付け期間にわたり、本チャンバーはコントロールセンターで設定された通り、温度を26〜29 °C、湿度を36〜56 %、二酸化炭素濃度を360〜400 ppmの間で正常に維持しました。ここでは、2011年の作付け期間におけるAndra Pogon Girard diの代表的な結果を示しています。夜間の呼吸による二酸化炭素の蓄積は、成長中の植物に悪影響を及ぼしていないようであり、日の出後に速やかに吸収されています。標的とする7 atom %の15N含有ホグリン溶液を用いた15N標識により、6.7 atom %の15Nを含む高度に標識された植物試料が得られた。標的とした15N標識からわずかに希釈されたのは、植え込み用培養土に含まれる天然存在比の窒素、あるいは自生土壌による接種が原因であると考えられる。標的とする4.4 atom %の13C二酸化炭素を用いた13C標識では、4.46 atom %の13Cが得られた。均一に標識された植物試料全体において、収穫の7日、14日、または22日前にチャンバーから取り出された差分標識植物は、13Cおよび15Nにおいて有意な差を示した。熱水抽出物として得られた代謝成分と、その抽出残渣として得られた構造成分の内容は、植物の代謝材料と構造材料のラベル化に差があることを示しています。この手法の開発後、連続二重同位体ラベル化により、生物地球化学の研究者が、マクロおよびナノスケールにおける環境中での植物成分の運命と変換を探索することが可能になりました。

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JoVE Journal

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環境

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13名LC-MSに関連するC6-グルコース標識:二次代謝物合成における植物一次器官の同定

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ループ法を用いた臨床研究のための炭素11放射性配位子の効率と放射性標識収率の向上

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連続の設計および動作

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