Name: の解剖アフリカツメガエル神経堤のため in vitroで外植片培養又は in vivoで移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学ぶアフリカツメガエル神経堤の解剖法。神経胚期の胚から神経堤を摘出し、in vitro培養またはin vivo移植により細胞移動と分化を観察する。発生生物学と神経科学の研究に有用です。

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作者は有用な議論とキュリー研究所の動物施設のためのフィブロネクチン、エリックTheveneau上の外植片の映像のためアデリーヌドリーに感謝します。 CMは、地方イル=ド=フランス（ドメーヌD&#39;Interet Majeurポール幹細胞）、大学パリシュッド（アタッシェTemporaire D&#39;Enseignementら·デ·ルシェルシュ）、および通信社国立·デ·ラ·ルシェルシュのポスドクである。この作品は、大学のパリシュッド（Attractivite 2011）、センター国立·デ·ラ·ルシェルシュ科学研究（アクションThematiqueらIncitativeシュールプログラム）によって資金を供給された、協会はラ·ルシェルシュコントルルがんグラントSFI20101201882、リーグコントルルがん、およびアジャン国立デラを注ぐRECHERCHE（アジャン国立·デ·ラ·ルシェルシュ·プログラム·ブラン）。

実験は、科学的目的のために使用される動物の保護に関する国家および欧州の規制で、交換、削減、洗練された、国際的に確立された原則に準拠しています。 1。フィブロネクチンコートディッシュ14の調製<ol><li>ピペット標準的なプラスチックシャーレ（φ40×11 mm）の中に1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈した10 mg / mlの培養グレードのフィブロネクチンを500ml。 1時間37℃でインキュベートする。注意：以降のイメージング用ガラス食器やガラス製カバースリップを使用している場合は、100 mg / mlのフィブロネクチン溶液を使用してください。 </li><li> 1X PBSで3回洗浄します。 </li><li> 1XのPBS/0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）の500ミリリットルを含むPBSを交換してください。 30分間37℃でインキュベートする。 </li><li> 1X PBSで3回洗浄します。 </li><li> 1X PBSでいっぱいにして（通常は24〜48時間の場合）使用するまで4℃で保管してください。 </li></ol> 2。 NC植片の解剖 &lt;OL&gt; <li>調製3/4ノーマル両生類培地（NAM）（110ミリモルのNaCl、2mMのKClを、1のCa（NO 3）2、1のMgSO 4、0.1mMのEDTA、1mMのNaHCO 3を、0.2×PBS、50 mg / mlのゲンタマイシン10,15）。 4℃で保存、解剖のために1週間以上保管しないでください年配NAM（下記）は、アガロースでコーティングされた解剖皿を調製するために使用することができる。 </li><li> 3月4日、NAMで2％アガロース10mlでコーティングされた解剖用の60ミリメートルペトリ皿を準備します。 </li><li>解剖ツールを収集します。プラスチック製パスツールピペットを、最高級の虫ピンがピンホルダー（参考資料の表を参照）、（ガラスパスツールピペット16の先端にパラフィンに埋め込 ​​まれた眉の毛で作られた）「眉ナイフ」、2罰金に搭載された解剖鉗子、P1000ピペットやヒント、50倍率8-40Xと両眼立体鏡、光ファイバガイドに明るい光源。すべて解剖のツールはきれいに保つ必要があり、各実験の後、蒸留水で二回一回のWiそれらをすすぐ100％エタノールをTH及び乾燥させてください。ほこりから保管してください。 </li><li>ほぼトップに新鮮NAMと解剖皿に記入してください。 </li><li> Xを得る標準的な手順10と、彼らは（Nieuwkoopとフェーバー発達表17による）神経胚ステージ16に到達するまで、それらを年齢に応じて胚ツメガエル 。 </li><li> 16胚プラスチックパスツールピペットを用いて解剖皿にステージを配置します。 </li><li>双眼スコープの下にあるすべての後続のステップを実行します。鉗子の2ペアが卵黄膜を除去します。胚の背側の部分に損傷を与えないように注意してください。 </li><li>胚は解剖を開始するために、ステージ17に到達するまで待ちます。神経堤が明確に早い段階とは対照的に、神経管から離れて設定されているので、ステージ17が適当である。ステージ17の後、NCは移行して、周囲の間充織と混ざり始まる。 </li><li>維持するために、胚のためのニッチを作るためにピンセットでアガロースに小さな穴を掘る解剖の間にそれら。 1胚背側を上にして置きます。注：粘土の代わりにアガロース中に穴を掘った胚を維持するために使用することができる。 </li><li>眉ナイフや虫ピンと前方神経倍の側部に切開する。胚にあまりにも深く行かないように注意してください：2〜3細胞層を切断することを目指し（原腸と同じくらい深く到達することはありません！）。全体の解剖プロセスの間に、 解剖した組織は、X のため、 気液界面に接触して入力できるようにすることはありません ツメガエル胚組織は、表面張力によって溶解される。 </li><li>神経のより背部分の第2の平行の切開が同じ機器を使用して倍にする。 </li><li>必要に応じて、90°付近の皿を回す。最初の2切開の後側で、眉ナイフや虫ピンと第三の垂直切開する。 NCは横方向、外胚葉の着色された外側の層の下の細胞の厚い塊である神経管へ。 </li><li>第三の切開端から始めて、根底にあるノースカロライナ州からの着色された外胚葉層を分離するために眉ナイフの先端を使用してください。 </li><li>第三の切開から始まるのNC組織を分離するために眉ナイフの側面を使用してください。基礎となる頭部の中胚葉が白色ながらNC組織は、むしろ灰色である。慎重に中胚葉からNCを分離する。 </li><li>眼胞から前方のNC組織を切り離し、外植片を解放するために、このレベルで切断。最初の実験のための対照として、in situハイブリダイゼーションによって、いくつかの外植片にsnail2式 （正規のNCマーカー）をチェックすることをお勧めします。 </li></ol> 3。フィブロネクチン上にプレート外植片<ol><li>フィルインフィブロネクチンコートディッシュ修正Danilchickミディアム（MDM、NaClの53 mMの、のNa 2 CO 3 5mmのKグルコン酸4.5 mMの、ナトリウムグルコン酸32 mMの硫酸マグネシウム1 mMの、 塩化カルシウム1 mMの、BSA 0.1％、pHを調整1男ビシンと8.3に<sup&gt; 18）。 </li><li> P1000ピペットを用いてフィブロネクチン被覆皿に外植片を移す。外植片を気液界​​面を接触させないでください。まず、一部の液体もう一度、外植して、先端にいくつかの液体をピペット。フィブロネクチン被覆皿に外植片を転送しながら、先端に空気を許可しないでください。先端がフィブロネクチンコートディッシュの液体の中にあると、外植片をゆっくりと重力で下に行かせ、または非常にゆっくりと押します。 速すぎて外植片を排出することは避けてください 。 </li><li>眉毛のナイフを使用して皿に10から30の外植片を配置します。皿の側面を避けるため、その後の画像化のために十分なされていない。 </li><li> （それは約15〜30分かかります）外植片はフィブロネクチンに付着するまで、お皿を移動しないようにしてください。必要であれば、 非常に慎重に料理を移動します。 </li><li>冷蔵インキュベータ（温度グラフ15〜20℃の間で、17を参照）の皿を置きます。 15℃で置かれたとき、細胞は、arはE通常は効率的に移行し、インキュベーションの6時間後に散乱（このタイミングは実験間で異なる場合があります）。 </li></ol> 4。ホスト胚に外植片を移植<ol><li>粗鉗子を使用して非常に小さい部分に微細ガラスカバースリップをカット。作品の大きさは約1.5ミリメートル2でなければなりません。ピンセットを用いて3月4日、NAMまたはPBSを含むペトリ皿にピースを浸します。 </li><li>宿主胚の調製：卵黄膜を除去して、NCを解剖しながら、宿主胚を傷つけないよう、特に注意して）3で説明したように3月4日、NAMでホストのNCを解剖する。ドナー胚を解剖しながら、宿主胚が部分的に治癒させて：組織の緊張は、焼灼の大きさを増大させる傾向がある。 </li><li>プロトコル3で説明したように、他のアガロースでコーティングされた皿の中で、同じ皿の別の部分では、ドナー胚からのNC植片を解剖する。で説明したように、注意してホストを含​​む皿にNC移植を転送プロトコル3。 </li><li>すぐに鉗子を使用してホストアブレーション領域に、NCの外植片を置く。外植片を部分的に固定してください。所定の位置に移植片を維持するために移植された胚にカバーガラス片を入れてください。それの損傷を防ぐために、胚よりも大きなガラス片を選択します。胚は平らに少しになります。 </li><li>少なくとも15〜20分間待ってから、静かにカバーガラスを取り外します。胚はさらに10分間回復してみようと注意深くプラスチック製パスツールピペットを用いて、3/4 NAMが充填された清浄な皿にそれをピペット。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルは、 アフリカツメガエル胚においてpremigratory頭蓋NCを植するための簡単な技術が記載されている。このような実験に使用した胚は、堅牢で、よく治癒する必要があります。不健康な胚のいずれかのバッチを廃棄します。また、後段ではなく、17で神経堤を切除するために、（12〜18〜20℃に）様々な温度で胚を成長する。ステージ17の後に、神経堤は頭部中胚葉と混合してもよいし、完全に除去することはできません。 アフリカツメガエルの組織が ​​迅速に治癒した後、他の組織への接着性を失う。これは、急速に働く時点ですぐにドナーから切除されるように宿主中に神経堤の外植片を配置することが重要です。 試験管内の実験で関わる、フィブロネクチン培養皿は、数日後に細菌または真菌で汚染され得ることができます。多くの場合、可能な限りの抗生物質とクリーンまたは無菌材料とソリューションを使用してください。 この手順は、Fに最適化されていまたは頭蓋神経堤。実際、この細胞集団...

神経冠（NC）は、脊椎動物胚における神経胚形成の終了時に神経管から出てくる一過性胚細胞集団である。 NCの仕様を制御するシグナル伝達および遺伝的事象は、早ければ原腸形成として開始します。ノースカロライナ州は、周囲の背側の組織からの信号によって、神経および非神経外胚葉の境界に指定されています。神経胚形成の終了時に、NC細胞が上皮から間葉転換（EMT）を受けると案内手がかりを囲むに応答することによってステレオタイプのルート以下の胚で広く移動する。彼らは彼らの最終的な宛先に到達した後、彼らは誘導体、 例えばニューロン 、グリア、骨、軟骨、および色素性細胞1-5の広大な配列に分化する。多くの細胞種および胚組織への貢献のために、NC細胞開発のどの段階での欠陥は、誘導から最終分化、neurocristopathies 6という先天性の症候群を引き起こす可能性があります。 E様々な段階での開発のNCの新実験操作 - 仕様、EMT、移行、および分化は - neurocristopathiesの我々の理解を向上させ、潜在的な治療戦略の設計ができるようになります。 アフリカツメガエル胚は、NC開発を研究するための最適なモデルです。胚の多数を得るのは容易であり、体外受精は、開発の非常に最初のステップへのアクセスを提供します。多くのツールは、実験的にXを操作するために利用可能である胚発生ツメガエル 。機能獲得型と遺伝子ノックダウンは、初期の胞胚の個々のセルをマイクロインジェクションにより実行するのは簡単です。胚組織は、in vitro再アソシエーション7-11またはバックグラフト12,13のアッセイのために切断することができる。 このプロトコルでは、Xにpremigratory頭蓋NCを分析する方法を説明します移行前に、後半neurulas ツメガエル 。これらの外植片はフィブロネクチンジンジャーブレッドで培養することができるに移行し、分化を研究するDプレートは、in vitroの実験条件で制御。 NC外植片もまた、インビボでそれらの移動および分化を研究するために、通常の操作または宿主胚に移植することができる。

<table><tbody><tr><td>ウシ血漿</td><td>シグマ</td><td>F4759-1MG</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン、フラクションV</td>ユーロ<td>メデックス</td><td>04-100-811-C</td>からのフィブロネクチン低<td>品質グレードは、このアプリケーションに適しているかもしれません</td></tr><tr><td>ステンレス鋼昆虫ピン、サイズ000</td><td>FST</td><td>26001</td><td></td></tr>デュ<tr><td>モン#5鉗子0.05ミリメートル×0.02ミリメートル</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td></td></tr></tbody></table>

の解剖<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;神経堤のため<em&gt; in vitroで</em&gt;外植片培養又は<em&gt; in vivoで</em&gt;移植

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

神経堤（NC）は、神経胚形成の最後に上皮への間充織転換（EMT）を受けて、過渡背側神経管の細胞集団である様々な臓器に向けて広範囲に移動し、誘導体（ニューロン、グリア、多くのタイプに分化する軟骨や骨、色素性および内分泌細胞）。このプロトコルでは、in vivoおよびin vitroでのNC開発を研究するために、 アフリカツメガエル胚からpremigratory頭蓋NCを分析する方法について説明します。カエルモデルは、初期の開発を研究する多くの利点を提供しています。豊富なバッチは、胚がin vivoでのゲインと機能戦略の損失は前供与体および/ ​​またはホスト胚におけるNC郭清に遺伝子発現の操作を可能にする、迅速な開発、提供しています。 NC植片は、フィブロネクチン上に播種し、インビトロ研究のために使用することができる。これらは、無血清培地中で定義された数日間培養することができる。また、背面のNC植片を移植する方法を説明します生体内でのNCの移行および分化を研究するためのホスト胚へ。

フィブロネクチン上にプレーすると、神経堤の外植片が急速に（15〜30分）を取り付けて、外植片は2時間（ 図1A）内でフラットに広がる。 3-6時間の細胞が飛散し始めた後。 15℃で24時間で、多くの細胞が離れて外植片（ 図1Bおよび1C）からの移行を開始しました。卵黄は、位相コントラスト（ 図1B）の下で、細胞が非常に明るくなる。細胞の突起（filopodesとlamellipodes）は、アクチン細胞骨格（ 図1C）のファロイジン染色した後にはっきりと見える。 同所移植実験のために、ドナー胚を非標識宿主胚における移植された細胞を追跡するために、GFP mRNAを注入した。頭蓋のNCは、ホストの片側に切除された。30〜60分、手術後に移植片を切除されたホスト頭蓋NC（ 図1D、移植後2時間）に置き換え、治癒した。数時間後、GFP陽性細胞が移動した外植片から腹頭蓋顔面の位置（ <st...

このプロトコルは、 アフリカツメガエルの neurulasからpremigratory頭蓋神経堤（NC）を分析する方法について説明します。これらの外植片をin vitroで培養フィブロネクチン上に播種、または宿主胚に戻って移植することができる。この技術は、NC上皮から間葉移行、遊走、および分化の機序を研究することができる。

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

本手順の目的は、opus Lavisの神経堤細胞の遊走を追跡することです。まず、神経管形成期の胚から神経堤を摘出します。次に、摘出物をフィブロネクチンコートしたディッシュに播種し、in vitroでの細胞遊走を解析します。あるいは、ホスト胚から神経堤を除去した後、その外植片を移植してin vivoでの移動を追跡することも可能です。最終的に、これによりopus lavisの発生における胚性神経堤細胞の移動の寄与を調べることができます。一般的に、初期胚は脆弱であるため、この手法に慣れていない方には困難である可能性があります。神経堤はかなり小規模な細胞集団であるため、独自の解剖ツールを作成する必要があります。このプロトコルの視覚的な実演は極めて重要です。神経堤をきれいに摘出できるよう、解剖プロセスの各要素が最適化されています。実験当日、約10 mLの2%アガロースでコーティングした60 mmの解剖皿を用意し、その4分の3まで、またはほぼ上端まで、通常の両生類培地（NAM）を満たします。次に、プラスチック製パストールピペットを用いて、ステージ16のXenopus laevis胚を皿に移し、2セットのピンセットを使用して、双眼鏡顕微鏡下に皿を配置します。胚の背面を傷つけないように注意しながら、卵膜を除去します。その後、胚が適切な発生段階であるステージ17に達するまで、室温でインキュベートします。解剖中の胚を固定するためのニッチを作るため、ディッシュ底部のアガロースに小さな穴を開け、胚の背側を上にしてその穴の中に配置します。次に、アイブロウナイフと昆虫ピンを使用して、神経襞の側方の2〜3細胞層に切開を加えます。次に、神経堤（neural fold）のより背側の部分に、2回目の正中平行切開を加えます。必要に応じてディッシュを90度回転させ、最初の2つの切開部の後方に、3回目となる垂直な切開を加えます。神経堤は、神経管の外側かつ白色の頭部中胚葉の上方に位置し、外胚葉の色素沈着した外層の下にある厚い灰色の細胞塊として観察されます。神経堤を特定した後、眉用ナイフの先端を使用して、3番目の切開端から、色素を持つ外胚葉層をその下の神経堤から剥離します。次に、再び3番目の切開部から、組織を中胚葉から慎重に分離します。その後、神経堤組織を視胞から前方に剥離し、外植片を回収します。最初に、C2ハイブリダイゼーションを用いて、正しい細胞集団が解剖されていることを確認するために、正準的な神経堤マーカーであるsnail2を少なくとも一部の外植片（explan）が発現しているかを確認する手順を習得します。in vitroでの移動イメージングのためにX外植片を播種します。まず、フィブロネクチンでコーティングしたディッシュに、改変したdanal chicks mediumを満たします。次に、X外植片

dissection-xenopus-laevis-neural-crest-for-vitro-explant-culture-or

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

からの神経外植文化<em&gt;アフリカツメガエル</em

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幹細胞様<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚外植片を早期神経発達の特徴を研究するために<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

上皮から間葉への移行(EMT)は、癌が浸潤性になることを可能にします。EMTを調査するために、血清と酵素を欠いた神経幹細胞(NSC)ベースのinvitroモデルが記載されています。この標準化されたシステムにより、細胞遊走、遺伝子およびタンパク質発現の定量的および定性的な評価が可能になります。創薬に適したモデルです。...

創薬に適していEMT調査のための酵素および無血清神経幹細胞培養モデル

このプロトコルは、主に細胞移動の研究のために、マウスモデルからの頭蓋神経堤細胞の解剖および培養について説明する。使用されるライブイメージング技術と速度と細胞形状の変化の解析について述べた。...

神経クレスト細胞の形成と移動の研究のためのマウスからの原発性頭蓋神経クレスト細胞の解剖、培養および分析

蛍光カルシウムイメージングとin...

ゼノプス・ラエビスにおける神経前駆体特性評価のための蛍光カルシウムイメージングとその後のその後の位置ハイブリダイゼーション

学ぶアフリカツメガエル神経堤の解剖法。神経胚期の胚から神経堤を摘出し、in vitro培養またはin vivo移植により細胞移動と分化を観察する。発生生物学と神経科学の研究に有用です。

の解剖

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