多層はゼブラフィッシュの長期シート光顕微鏡用に取り付け

この手順の全体的な目的は、ゼブラフィッシュ胚を長期間のin vivoライトシート顕微鏡観察用に固定することです。まず、フッ化エチレンプロピレン（FEP）チューブを洗浄し、メチルセルロースでコーティングします。次に、目的のゼブラフィッシュ胚をコーティングします。

次に、胚をまず融解させたアガロースに転移させ、その後、コーティング済みのFEPチューブに移します。最後に、チューブの底部をアロスプラグで密閉し、固定された胚の向きを慎重に確認します。最終的に、in vivoライトシート顕微鏡を用いることで、ゼブラフィッシュ胚の数日間にわたる妨げのない発生過程を、高い空間的および時間的分解能で観察した結果を得ることができます。

既存の手法に対する主な利点は、ゼブラフィッシュの胚をわずか数時間ではなく、数日間にわたって観察できるようになったことです。この手法を用いることで、ライトシート顕微鏡によりゼブラフィッシュの長期的な胚発生に関する貴重な知見を得ることができます。また、小型の海洋生物などの他の小型生物にも適用可能です。

また、光学投影トモグラフィー、ワイドフィールド顕微鏡法、または共焦点顕微鏡法などの他の顕微鏡技術と併用することも可能です。この手法に不慣れな方は、プロトコルに時間的な制約があるステップが含まれていることや、胚の最終的な位置を判断するのにある程度の専門知識が必要なことから、苦労する可能性があります。FEPチューブを準備するには、まず、1 molar 水酸化ナトリウムで繰り返し洗浄します。次に、0.5 molar 水酸化ナトリウムを満たした 50 milliliter 遠心チューブにチューブを移し、10分間超音波洗浄を行います。

ポリマーチューブを脱イオン蒸留水の入った小さな容器に移し、洗浄します。次に、70%エタノールで洗浄し、新しい遠心チューブに移します。エタノールを用いて超音波処理を行います。

チューブを10分間ソニケーションし、その後、脱イオン蒸留水を入れた小さな水槽に移して洗浄します。再度洗浄します。洗浄したFEBチューブを3 cmの長さに切り、必要に応じて真っ直ぐに伸ばします。洗浄済みのチューブを、脱イオン蒸留水で満たした新しい50 mLチューブに入れて保存します。

Tricaストック溶液を調製します。テキストプロトコルに従い、3%メチルセルロースおよび1.5%と0.1%の両方のArosを調製します。1.5%アガロを融解し、ペトリ皿に注いで厚さ約2 mmの層を形成します。

目的のステージに達し、選択した蛍光遺伝子を陽性に発現しているゼブラフィッシュ胚を回収し、実体顕微鏡下で新しいE3培地が入ったディッシュに移します。2本の鋭いピンセットを使用し、一方のピンセットで卵膜を保持し、もう一方のピンセットで卵膜を切り裂いて剥がすことで、慎重に脱膜を行い、多層マウントを準備します。手袋を着用した状態で、鈍端カニューレをシリンジに取り付けます。

洗浄済みのFEPチューブの一端に、カニューレを約3 mm慎重に挿入します。次に、FEPチューブの自由端を3% Methylcelluloseに浸し、チューブ内をこの溶液で満たします。その後、シリンジをゆっくりと押し、E three mediumを用いてメチルセルロースを排出させます。この浸漬と排出の工程を繰り返します。

その間に、ヒートブロックを用いて0.1%arosの分注液1本を70°Cまで加熱します。反応チューブを短時間ボルテックスした後、38°Cに設定したヒートブロックに移します。加熱後、チューブを短時間冷却させ、最終濃度が133～200 mg/Lとなるようにtricaを加え、ボルテックスします。

再度、ガラスパステールピペットを使用します。コーティング済みの胚を、あらかじめ温めておいたarosが入った反応チューブへ、E3溶液をできるだけ少なく含ませて移します。FEPチューブと接続されたシリンジを用いて、胚を吸い上げる前に少量のarosを静かに吸い取り、チューブ内をarosで完全に満たします。

胚は、頭部が開口部を向くようにしてチューブの両端のいずれかに配置してください。内容物の漏出を防ぐため、チューブを水平に保持して塞ぎます。カニューレから切り離す際は、カミソリの刃を使用してください。

次に、チューブを垂直に持ち、1.5%アガロース層全体に先端をゆっくりと刺し入れ、わずかに回転させます。乾燥を防ぐため、イメージング前に、マウントした標本をE3培地で満たした1.5 mL反応チューブに入れて保持してください。FEPチューブ内の魚が真っ直ぐに配置され、イメージングのために頭部がプラグの真上に位置していることを確認してください。

イメージングチャンバー内の培地にトリカ（trica）を加えます。ここに示しているのは、受精後1日のK-G-R-L-G-F-Pトランスジェニックゼブラフィッシュ胚であり、血管系の発達を観察するために2日間にわたってイメージングを行いました。

ゼブラフィッシュは固定剤による制限を受けず、正常に成長させることができます。例えば、頭部が挙上し、尾部が伸展し、血管新生が妨げられることなく進行します。

この手法は、適切に実施され、すべての材料がすぐに利用可能な状態であれば、10分で完了できます。主要なステップを遅滞なく行うようにしてください。汚れは最終的な画像品質を損なう可能性があるため、すべての溶液を清潔に保ってください。