マウス同所性膀胱異種移植片の最小侵襲性の確立

主な侵襲的同所性膀胱癌異種移植片を接種するために確立された技術は、開腹手術と膀胱の動員を必要とします。この手順では、マウスに有意な病的状態を負わせる技術的に困難であり、時間がかかる。したがって、我々は、経皮的アプローチは、超音波誘導を利用して、高精度を開発した。

この手順の全体的な目標は、同所性膀胱がん異種移植片を迅速、正確、かつ低侵襲な方法で作成することです。これは、最初に特定の腫瘍細胞株とMatrigelの腫瘍細胞の懸濁液を増殖させることによって達成されます。次に、動物をイメージングプラットフォームに取り付け、膀胱を超音波で視覚化します。

次に、膀胱内の粘膜層と筋肉層を生理食塩水注射で分離します。最後に、腫瘍細胞マトリゲル懸濁液をこの人工的に作成された空間に注入します。最終的には、超音波画像診断と生物発光を通じて腫瘍の成長を示す結果を得ることができます。

この技術が他の既存の方法、例えば一次異種移植片の接種のための開腹術の使用に対する主な利点は、このアプローチが迅速で、正確で、低侵襲であることです。これらの技術の意味は、自家異種移植片が新しい治療法の前臨床研究のゴールドスタンダードであるため、膀胱がんの診断と治療にまで及びます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、注入ステップを学ぶのが非常に難しく、水が非常に薄いため、この手順をデモンストレーションすることは非常に重要です。

Igor Moscaには研究助手がおり、Wolfgang Yeagerにはポスドク研究員がいます。どちらも泌尿器科医であり、それぞれのヒト膀胱がん細胞株の同一性を確認した後です。DNAフィンガープリントによるこの研究では、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を運ぶレンチウイルスコンストラクトを使用して、異種移植片腫瘍の生物発光増殖分析を行い、細胞株をトランスフェクションします。

手順を開始する準備ができたら、10%FBSを含むDMEMを解凍して使用し、既存の細胞株を拡大し、加湿した5%CO2雰囲気で摂氏37度でインキュベートします。解凍、マトリゲル、および氷のトリプシンの目、70%の合流点細胞に保持した後、注射用の細胞懸濁液を調製し、正常な成長培地を使用して懸濁し、その後、細胞をカウントし、懸濁液を200倍Gで5分間回転させます。上清を取り除いた後、動物あたり40マイクロリットルの容量を注入するための所望の細胞濃度に達するために、等量のD-M-E-M-F-B-SおよびMATRIGELを適量加えます。

よく混ぜて、平らで硬いプラスチック材料から気泡を作らないようにしてください。膀胱スタビライザーをカットし、ストラップを注意深く検査し、マウスに塗布する前に鋭いエッジを取り除きます。雌マウスに酸素中の3%イソフルランを麻酔し、つま先つまみを行った後。

適切な鎮静を確保するために、動物を小動物イメージングプラットフォームの加熱イメージングテーブルに取り付け、輪ゴムでバイタルサインを継続的に監視します。下肢を固定し、0.5%グルコン酸クロルヘキシジンを使用して腹部を消毒してから、滅菌綿の先端を使用して皮膚を拭きます。次に、膀胱安定化ストラップを使用して、壁内注射中に膀胱が回避されないように膀胱を固定します。

次に、滅菌超音波ジェルを下腹部に塗布します。超音波スキャンをゆっくりと進め、皮膚に向かい、超音波画面で膀胱を視覚化します。膀胱が空の場合は、経尿道的24ゲージ血管カテーテルで50マイクロリットルの温かいPBSを使用して膀胱壁層を分離します。

PBSで満たされ、シリンジクランプに30ゲージの4分の3インチ針に接続された1.0ミリリットルのシリンジを取り付けることから始めます。針を恥骨のすぐ上の皮膚に向けて配置します。30〜45度の角度で、超音波スクリーンで針を検出してから、皮膚と腹壁の筋肉にゆっくりと穴を開けます。

次に、針の斜角を後ろを向くように180度回転させ、針の先端を粘膜を貫通せずに膀胱壁に挿入します。次に、人工的な空間を作るために、針を抜く前に、筋肉層と粘膜の間に50マイクロリットルのPBSをゆっくりと注入します。膀胱がん細胞を注入するには、がん細胞マトリゲル懸濁液で満たされた2番目の1.0ミリリットルシリンジと30ゲージの4分の3インチ針をシリンジクランプに取り付けます。

針の先端をPBSで満たされたスペースに導きます。ちょうどスペースにサスペンションの40マイクロリットルを作成し、注入します。次に、マウスをイメージングプラットフォームから取り外した後、針を引き抜きます。

継続的な監視の下で暖かく快適な環境に保管してください。意識を取り戻し、通常の歩行をした後、動物を自宅のケージに戻します。3つの異なる腫瘍細胞株の学内注射を、超音波ガイド下で50匹の動物に3日間連続して実施しました。

接種は効率的に行われ、インターベンション中またはインターベンション後の合併症とは関連していませんでした。腫瘍増殖のモニタリングは、超音波画像診断および生物発光によって行った。3日目には、50匹すべての動物の前膀胱に超音波で腫瘍を検出することができ、マウスの98%がucの接種後の追跡期間中に一定の腫瘍増殖を示しました。3。

ルーク1匹のマウスは腹腔内腫瘍播種を発症し、2匹目のマウスでは7日目以降に腫瘍が退縮した。これは、ucの接種後にこの新しい技術を接種したマウスの最初のグループでした。3。Luke uc、1 Luke、uc.

13ルカ。マウスは、それぞれ24日目、28日目、37日目に犠牲にしました。異種移植片腫瘍を採取し、h切片およびd切片で検査した。

すべての腫瘍は筋肉浸潤性であり、一部は内臓脂肪に浸潤していましたが、隣接する臓器への浸潤は観察されませんでした。3匹のLuke腫瘍担体マウスに後腹膜リンパ節転移が認められ、h染色とe染色で確認した。

一度習得すれば、このテクニックは3分で完了します。超音波画像診断に精通していることは、この手順を実行するための前提条件です この方法で腫瘍を接種した後、超音波により、腫瘍の成長を経時的に監視するだけでなく、マイクロバブルによる腫瘍灌流も見ることができます。これにより、新しい実験薬による腫瘍内注射も行うことができます。