Name: 視覚化し、定量化するために蛍光タンパク質を使用しましたクラミジア液胞の成長ダイナミクス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 学ぶ蛍光タンパク質を用いたクラミジア液胞の成長ダイナミクスの可視化と定量化法。生細胞でのリアルタイム解析により、感染動態を正確に評価し、従来の抗体法に代わる効率的な手法を提供します。

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著者は、それぞれpGFP-SW2とpASK-GFP-mKate2-L2プラスミドについて、Ian ClarkeとP. Scott Heftyに感謝します。技術支援を提供してくださった Paul Miller 氏と、その他のリソースを提供してくださった Richard Stephens 氏に感謝します。この研究は、NIH助成金AI095603(KH)によって資金提供されました。

蛍光ホスト細胞株の1世代<ol><li> 2×10 の 6細胞/ウェル6ウェルプレートに1日目プレート293T細胞（または他のレトロウイルスパッケージングライン）、〜75％コンフルエント翌日にします。必要に応じて、各レトロウイルス用プレートの重複ウェルを使用します。 </li><li> 2日目を吸引細胞と2 mlを加え、新鮮な増殖培地（DMEM + 10％FBS + 2mM L-グルタミン）。リポフェクタミン2000または同様の試薬 ​​を用いて、製造業者の指示に従って5-8μgのレトロウイルスベクター（GFPを含む）、パッケージングベクターのそれぞれ（ 例えば 、pVSVg）で細胞をトランスフェクトします。 </li><li> 37℃のCO 2インキュベーターで4〜6時間のためのDNAで細胞をインキュベートし、続いて1ミリリットルの成長培地で培地を交換してください。 </li><li> 37℃のCO 2インキュベーター中で 48時間、細胞をインキュベートします。 </li><li>ウェル10 5細胞 /のおおよその密度で6ウェルプレート上で3日目プレートの標的細胞（ 例えば 、HeLa細胞）、〜50％コンフルエントであるために次の日。倒立顕微鏡でGFP蛍光をモニターすることにより、293T細胞で陽性トランスフェクションを確認してください。 </li><li> 4日目は、ピペットを用いて293T細胞からレトロウイルス含有上清を収集し、0.45μmの酢酸セルロースシリンジフィルターを通して上清をフィルタリングします。 </li><li> HeLa細胞から培地を除去し、16 / mlのポリブレンを含む0.5 mlの増殖培地を追加します。賢明ドロップ、24時間、37℃のCO 2インキュベーターで細胞を培養する細胞にレトロウイルスのフィルタリング〜0.5ミリリットルを追加します。 4℃で（重複ウェルからすなわち 、）残りのレトロウイルスを保管してください。 </li><li>二連のウェルは、余分なレトロウイルスを生成するために行われた場合は5日目には、シリアル残りのレトロウイルス粒子を感染させるためにステップ1.7を繰り返します。 </li><li>選択抗生物質（例えば、500 / mlのネオマイシン）を含む10cmの皿に1：6日目通過は、HeLa細胞1をトランスフェクトしました。 </li><li>形質導入した細胞は、選択antibioの存在に戻って成長するのに十分な時間を待って細胞は、選択抗生物質（ 例えば 、200 / mlのネオマイシン）の低い濃度で、標準的な技術によって増殖させることができ、その後、チック。 注：必要に応じて、細胞はまた、クローン、この時点で理想的な明るさのために選択することができます。 </li></ol> GFP発現クラミジアトラコマティスの2世代<ol><li> 2倍のCaCl 2バッファー（20 mMトリスpHは7.4、100 mMのCaCl 2を）と4SPバッファー（0.4 Mショ糖、16mMのの Na 2 HPO 4）を準備します。 </li><li> 1日目解凍冷凍C.トラコーマ株式氷上で、すぐに50μlの2倍のCaCl 2バッファーに10μlの細菌を希釈。よく混ぜ、3μgのプラスミドDNA（ 例えば 、PASK-GFP-mKate2-L2）を追加し、25℃で30分間インキュベートします。 </li><li>このステップの間に、遠心管にMcCoy細胞のT-75フラスコをトリプシン処理することにより、宿主細胞を準備します。 5分間50×gで細胞懸濁液を遠心し、上清を捨てます。 Resuspen1XのCaCl 2緩衝液の適切な容積中のd細胞ペレットを4×10 7細胞/ mlの最終濃度を得ました。 </li><li> （ステップ2.2）から30分間インキュベートした後、形質転換混合物管（総体積200μlの）にMcCoy細胞を用意100μlを添加し、25℃でさらに20分間インキュベートします。 2ミリリットルの成長培地で6ウェルプレートとオーバーレイから単一のウェルに、この形質転換細胞の混合物の100μlのを追加します。 2日間、CO 2インキュベーター中、37℃でインキュベートします。 </li><li> 3日目を溶解McCoy細胞は 、Cに感染しました1ミリリットルのdH 2 Oで培地を交換し、曲がっ千μlのピペットチップを用いて細胞を掻き取ってトラコーマ 。 Cの効率的な細胞溶解および放出のための5回1ミリリットル4SPバッファを追加して、〜27.5 G針を通してサスペンションを渡しますトラコーマ 。 </li><li> C.を含む細胞溶解物を2mlの転送たてメッキMCCのコンフルエントな単層を含むT-75フラスコにトラコマチスオイ細胞; （FBSなし）8 mlのDMEMを添加し、Cを可能にするために25℃で2時間インキュベート細胞に付着するトラコーマ 。 </li><li>吸引し細胞および10 U / mlのペニシリンGと1 / mlのシクロヘキシミドを補充した新鮮な増殖培地を追加します。 37℃のCO 2インキュベーター中で 48時間、フラスコをインキュベートします。 </li><li> 4日目は、細胞が感染していると介在物が異常クラミジアが含まれている光学顕微鏡で確認してください。標準の光学顕微鏡に明るい空胞、および直径2μm以上である介在物内にリング状の物体などの異常クラミジア体として介在物を特定します。 </li><li> 2ミリリットルのdH 2 Oで培地を交換し、懸濁液中に細胞をこすり取ることにより、5日目を溶解文化。 2ミリリットル4SPバッファを追加し、約5倍の27.5 G針を通してサスペンションを渡します。 </li><li> 6ウェルプレート中で単一ウェルでMcCoy細胞の新鮮​​な単層を感染させるために、細胞溶解物の2ミリリットルを使用してください。 25℃で2時間溶解液で細胞をインキュベートし、吸引し、新鮮な成長を追加ペニシリンGおよびシクロヘキシミドを含む培地。 </li><li>細胞の一般的な健康状態に応じて、3〜5日間、37℃のCO 2インキュベーター中で細胞をインキュベートします。 </li><li>繰り返し（異常な体を欠いている）通常の探している介在物が出現するまで、6ウェルプレート中の新鮮なウェルに2.9から2.10 1回以上、必要に応じて、継代培養を繰り返します。この時点でことを確認するために倒立蛍光顕微鏡を使用するC.トラコーマは mKate2（赤）を発現します。 </li><li> T-150フラスコ中で増殖させ、感染したMcCoy細胞またはHeLa細胞からのクラミジアの形質転換体を採取することにより、たとえば、高力価のクラミジア株を生成するため、感染した培養物をスケールアップ。 </li></ol> 3. クラミジアで細胞を感染させます<ol><li> IFUの決意とマルチウェルスクリーニングのための、例えばガラスボトムディッシュまたはチャンバースライドの高解像度画像化のために、または24ウェルプレートのための所望の培養容器にプレートGFP-HeLa細胞、。 </li><li>あちこち解凍Cを含む禅チューブトラコマティス、C。 muridarum、またはC.氷上ニューモニエ例えばMOI = 1、感染の所望の多重度（MOI）にHBSS中に希釈します。 </li><li>使用される特定のクラミジア株に基づいて静的または遠心支援の感染症のいずれかを実行します。 <ol><li> C.での感染についてトラコマチス LGV血清型L2またはC. muridarumは 、HBSSでGFP-HeLa細胞を洗浄し、25℃で2時間希釈した細菌とインキュベートします。吸引し、HBSSで細胞を洗浄し、37℃のCO 2インキュベーター中で増殖培地中で細胞をインキュベートします。 </li><li> C.トラコマチス血清型DまたはCと感染症肺炎連鎖球菌は 、HBSSでGFP-HeLa細胞を洗浄し、細胞に希釈した細菌を追加します。卓上遠心機で、スイングバケットロータ取付のマルチウェルプレートホルダーにマルチウェルプレートまたは（マルチウェルプレートの蓋にテープで固定）ガラスボトムディッシュを置きます。 </li><li> 1時間25℃で900×gで遠心分離した細胞。 </lI&gt; <li> 1時間、37℃のCO 2インキュベーター中で遠心分離し、場所から培養容器を外します。 </li><li>安全キャビネット内を吸引細胞は、HBSSで細胞を2回洗浄し、新鮮な増殖培地を追加します。 37℃のCO 2インキュベーター内で場所細胞。 </li></ol></li></ol> クラミジア介在物の4生細胞の可視化<ol><li> CO 2インキュベーターからクラミジア感染GFP-HeLa細胞を削除し、フェノール5 +赤％のFBSを含まないRPMIで培地を交換してください。 </li><li> 20倍以上のオイル対物レンズを用いて倒立蛍光顕微鏡（ニコンエクリプスのTi-Eまたは類似の）上のマウント細胞。 </li><li>大きなブラックホール（ クラミジア介在物）を含む緑色の細胞：イメージングソフトウェア（Volocity 6または類似）を使用して、に焦点を当て、特定クラミジアは、GFP-HeLa細胞を感染させました。 </li><li>マークイメージングソフトウェアを使用して、関心のクラミジアに感染した細胞を含む領域のXYZ場所（巻ocity 6または類似）。手動XYステージ表示モードでしばらく「ポイントの追加」をすることによって、これを実行します。このように、XYZ座標は、各マークされた場所のために保存されています。 </li><li>取得設定]ダイアログボックスで、緑（GFP、ヒーラ細胞質ゾル）と赤（mKate2、 トラコーマクラミジア ）チャネル、およびチャネルごとに新しいフレームごとに5分の割合でを取得するソフトウェアを設定します。 </li><li>取得プロトコルを使用して画像シーケンスを取得」キャプチャ/録音」ボタンをクリックすることで、上記で入力しました。 </li></ol>生細胞内封入成長パラメータの5定量<ol><li>所望の時間感染後（ 例えば 、24、48 HPI）でインキュベーターからクラミジア感染GFP-HeLa細胞を除去し、倒立蛍光顕微鏡に取り付けます。注：高NAの20Xや40X空気目的は、24ウェルプレートのために最も適しており、40X油目的は、チャンバースライドをお勧めします。このお尻のためのいずれかの基板上に細胞を増殖させますAY。 </li><li>介在物は、その最大径であり、鮮明なエッジをもたらす細胞のミッドプレーン、に焦点を当てています。 </li><li>各ウェル（ウェル当たり少なくとも10）に多くの分野のための画像を取得します。ウェルは、通常、複製または実験変数を表します。 </li><li>目で（介在物は、GFP-HeLa細胞における黒区画されている）、手動で介在物の個数を列挙したり、自動的に介在物を特定し、カウントするイメージングソフトウェア・アルゴリズムを使用しています。 <ol><li>蛍光強度によって、GFP-HeLa細胞を探す（コマンド「オブジェクトの検索」）を、細胞の相対強度に基づいて、蛍光閾値強度を調整します。 </li><li> 52μm以下だけ大きいものを維持するサイズのガイドラインを使用して、選択したオブジェクトをフィルタリングします。これは、「人口1」です。 </li><li>入力として「人口1 &#39;を使用して、コマンド「オブジェクトの穴フィル」を適用します。このステップは、「人口2 &#39;を生成します。 </li><li> P &#39;から「人口1」を減算し「人口3 &#39;と指定積極マークさクラミジア介在物を、生成する「opulation 2。 </li><li>例えば、24時間以上のために感染した細胞内封入体のためには25μm2よりも大きなオブジェクトを保持するために、「人口3 &#39;（コマンド「人口フィルター」を）にサイズのフィルタを適用します。これらの介在物がはるかに小さいなどの前に18時間早ければ感染の時間については、設定サイズのフィルタは、4μm2でより大きなオブジェクトを保持します。 「介在物」として指定されたオブジェクトの集団でのサイズフィルタリング結果。 </li><li>イメージングソフトウェアを使用して、例えば、画像から封入番号、封入サイズ、及び包含外周の定量的データを計算します。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を有していないことを宣言します。

ここでは、リアルタイムの可視化とクラミジア介在物の分析のための蛍光宿主細胞を生成するための実験的な戦略について説明します。この液胞の可視化手法は、点灯トラックと定量的に細胞の集団間または経時単一細胞におけるクラミジア介在物の動的特性を測定するための強力な能力を付与する。蛍光タンパク質標識細胞におけるクラミジア介在物が著しく十分に定義され、それらは容易に識別されるように追加免疫処理を必要としません。さらに、このアプローチは、細胞と包括曲率あたりの液胞の数など、さまざまなクラミジア種および株が保有することを署名形態学的相違を解決するのに十分な感度です。加えて、我々は、イメージングソフトウェアは自動的にGFPを発現する宿主細胞内で封入体を同定するために適合させることができる方法を示します。 ILのための免疫蛍光ラベリングステップの疎遠化クラミジア封入体の部分の光量は、このような包含形成単位（IFU）の決意として、エンドポイントアッセイのためにユーザに多大な時間とコストの節約につながります。また、生細胞の画像介在物の能力は、それによって、時間経過の研究のために必要な井戸またはプレートの数を減...

クラミジアは性感染症、骨盤内炎症性疾患、失明、肺炎、おそらくアテローム性動脈硬化症1-4を含む、世界の健康に大きな負担を惹起細胞内細菌の種によって引き起こされる感染症。液胞の中から、宿主細胞と相互作用するクラミジアの能力は、（封入と呼ばれる）、それらの成功した細胞の感染および宿主のための重要な決定要因です。包含は、クラミジアの成長を可能にし、動的にクラミジア 5の全体の2〜3日の発達サイクルを通じて変更された新たな病原性の区画です。クラミジアの偏性細胞内性質は直接含めることのユニークな生物学を研究するため、特に研究コミュニティに多くの課題を提示。主要なハンディキャップを効率的に蛍光アプローチによって、細胞内のクラミジアやその含有物のいずれかを可視化することができないことでした生きた細胞内のES。最近の発見は、Cを GFP発現を生成するための手段を最終的に明らかにしましたトラコーマ 6;しかし、この発見は、まだ包含の特異的な標識には至っていません。いくつかの技術は、細菌や介在物7,8の標識に記載されているが、彼 ​​らは、このような光退色に対して非特異性、仮初や感受性などの欠点があります。私たちのグループによる重要な発見は、宿主細胞9 GFP発現を使用して含めることを照明するための新たな戦略を確立しました。この戦略は、合理的にダ10 520よりも大きい分子に包接膜の固有の不透過性を利用します。細胞を安定的に特定の細胞質の蛍光タンパク質（例えば、GFPまたはmCherryを）を発現するように操作された場合、 クラミジア介在物は、蛍光の彼らの完全な排除による著しい明快で見ることができます。この逆イメージング戦略は、すべてのクロロフィルのための介在物の即時の可視化を可能にしますamydia種と容易に関心のほとんど宿主細胞に適合させることができます。その有用性の実証として、この方法は、 クラミジア属 9のための細胞の出口経路を明らかにし、定義するために以前に使用されました。 ここでは、さらにこの方法が行われ、包接成長のダイナミクスについての重要な定量的データを得るために活用することができる方法を示しています。また、効果的にコストのかかる抗体ベースの列挙法の代わりにすることができ、そのようなクラミジア 11 mKate2発現などの他の蛍光標識と並行して使用することができます。ツールのこの強力な組み合わせは、宿主細胞を生きた内部クラミジア封入体膜の物性の探査を可能にします。

<table><tbody><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Mem</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>ポリブレン</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &micro;m フィルター</td><td>Fisher</td><td>09-719D</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Invitrogen</td><td>10131</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 w/o フェノールレッド</td><td>Cellgro</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン G</td><td>Sigma</td><td>13752</td><td></td></tr><tr><td>シクロヘキシミド</td><td>シグマ</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>チャンバースライド、Lab-Tek II</td><td>Nunc</td><td>154526、154534</td><td></td></tr></tbody></table>

視覚化し、定量化するために蛍光タンパク質を使用しました<em&gt;クラミジア</em生細胞内&gt;液胞の成長ダイナミクス

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

義務的な細胞内細菌クラミジアは、世界の公衆衛生に大きな負担をかけています。C.トラコマチスは、性感染症の主要な細菌の原因であり、世界の予防可能な失明の主な原因でもあります。クラミジアによる宿主細胞の感染を成功させるための重要な決定要因は、インクルージョンと呼ばれる新しい空胞コンパートメント内から宿主細胞のシグナル伝達を操作する細菌の能力です。インクルージョン内から、クラミジアは2〜3日間の発達成長に必要な栄養素を獲得し、さらにエフェクタータンパク質のパネルを液胞膜の細胞質表面と宿主のサイトゾルに分泌します。しかし、クラミジアの生物学に関する理解にはギャップがあり、この細胞内コンパートメントを視覚化し分析するための大きな課題があります。最近、GFP発現宿主細胞を用いてインクルージョンを可視化するためのリバースイメージング戦略が説明されました。このアプローチは、GFPなどの高分子に対する封入膜の固有の不透過性を合理的に利用します。この研究では、GFPまたはmCherryを発現する宿主細胞がどのように生成され、その後のクラミジアル封入体の可視化が行われるかについて説明します。さらに、この方法は、高価な抗体ベースの計数法に効果的に置き換えることが示されており、GFP発現クラミジアなどの他の蛍光標識と併用でき、さまざまなクラミジア種や菌株からの封入膜の成長に関する重要な定量データを導き出すために利用できます。

サイトゾル蛍光タンパク質 （例えば、GFP）を発現する哺乳動物細胞を生、感染細胞培養物においてクラミジア介在物の照明を可能にするように設計することができます。 クラミジアの感染の際に、介在物は、宿主細胞（ 図1）における黒点として容易に見ることができます。蛍光欠けている介在物の透明度は、ビューおよび/ ​​または治療（ 図1）の多くの分野を横断介在物の自動識別のために利用することができます。蛍光ホスト細胞が生成されると、強力な新しいワークフローは、実験試料におけるクラミジア感染レベルの迅速な定量分析のために有効になっています。一つの主要なアプリケーションは、ライブ、感染した細胞におけるクラミジア封入形成単位（IFU）（ 図2）の決意です。この実験的な戦略は、日常的分野において使用される免疫蛍光手順、を不要に、時間がかかり、高価な。 記載の撮像方法の別の重要な特徴は、それが容易に任意のクラミジア種</em...

クラミジアを含む細胞液胞(封入体)を照らすための生細胞蛍光タンパク質ベースの方法が説明されています。この戦略により、サンプル中のクラミジア感染性を迅速かつ自動的に測定でき、インクルージョン増殖ダイナミクスを定量的に調査するために使用できます。

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

この手順の全体的な目的は、生細胞内におけるクラミジア封入体の成長ダイナミクスを可視化し、定量化することです。これは、まず細胞質にGFPなどの蛍光タンパク質を安定的に発現する蛍光ホスト細胞を作製することによって達成されます。次に、これらのホスト細胞にクラミジアを感染させ、インキュベートします。次に、感染細胞を生細胞蛍光顕微鏡で可視化します。最後に、顕微鏡解析ソフトウェアを用いてクラミジア封入体の特性を定量化します。最終的に生細胞蛍光顕微鏡を使用して、宿主細胞内のクラミジア封入体を可視化し、定量的な結果を得るために封入体の生物学的パラメータを測定します。抗体ベースの計数法などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、このリバースイメージング戦略を生細胞に使用できる点、および他の蛍光ラベルと組み合わせてすべてのクラミジア種の封入体ダイナミクスを定量化できる点にあります。さらに、細胞内の細菌を標識する一般的な手法とは異なり、本アプローチでは生存細胞内の封入体膜を可視化できるため、この病原体含有コンパートメントの重要な動態特性を明らかにすることができます。テキストプロトコルに従って蛍光HeLa細胞を作製した後、高解像度イメージング用のガラスボトムディッシュや、IFU決定およびマルチウェルスクリーニング用の24ウェルプレートなど、目的の培養容器にGFP HeLa細胞を播種します。凍結保存されたCrich Cotusまたはその他の目的のクラミジア株を含むチューブを氷上で融解し、HBSSで目的の感染多重度（MOI）まで希釈します。Crich Cotus LGV zero VL2を用いて静的な感染を行うには、ウェルから培地を吸引除去し、HBSSを用いてGFP HeLa細胞を洗浄します。希釈した細菌をウェルに添加し、25 °Cで2時間インキュベートした後、細胞を吸引し、HBSSで洗浄します。次に、増殖培地を添加し、二酸化炭素インキュベーターを用いて細胞を37 °Cでインキュベートし、crich serovar Dまたはその他のクラミジア株を用いて遠心分離補助感染を行います。HBSSを用いてGFP HeLa細胞を洗浄し、希釈した細菌を細胞に添加します。次に、感染細胞の入ったディッシュを、ベンチトップ遠心分離機のスイングバケットローター用マルチウェルプレートホルダーに設置します。細胞を900 ×g、25 °Cで1時間遠心分離します。その後、バイオセーフティキャビネット内で培養容器を37 °CのCO2インキュベーターに1時間置き、細胞を吸引し、HBSSで2回洗浄してから増殖培地を加えます。感染細胞の入ったディッシュを37 °Cでインキュベートします。クラミジア封入体を可視化するため、クラミジア感染GFP HeLa細胞を二酸化炭素インキュベーターから取り出し、フェノールレッド不含のRPMIおよび5% FBSを用いて培地を交換します。ディッシュまたはマルチウェルプレートを、20倍以上の油浸対物レンズを備えた倒立蛍光顕微鏡に設置します。イメージングソフトを用いて、大きな黒い孔を含む緑色の細胞として観察されるクラミジア感染GFP HeLa細胞を特定します。撮影設定ダイアログボックスで、グリーンチャネルおよびサンプルに追加されたその他のチャネルを撮影するようにソフトウェアを構成します。[Capture/Record]ボタンを使用して、任意のタイミングで画像を撮影します。感染後、クラミジア感染させたGFP HeLa細胞をインキュベーターから取り出し、ディッシュを倒立蛍光顕微鏡に設置します。封入体の直径と収量が最大となる細胞の中央平面に焦点を合わせます。エッジが鮮明な画像を、1ウェルあたり少なくとも10視野で取得してください。通常、ウェルは反復試行または実験変数を表します。MeasurementsタブでGFP HeLa細胞を探すには、「find objects」コマンドを使用し、グリーンチャンネルを選択します。細胞の相対的な強度に基づいて閾値強度を調整してください。封入体または黒いコンパートメントおよびGFP HeLa細胞の数を、目視で手動でカウントするか、イメージングソフトウェアのアルゴリズムを使用して封入体を自動的に識別し、カウントします。選択したオブジェクトをフィルタリングし、5平方マイクロメートルより大きいもののみを保持します。これをポピュレーション1とします。このポピュレーションを使用して、「fill holes in objects（オブジェクト内の穴を埋める）」コマンドを適用し、このステップによってポピュレーション2を生成します。ポピュレーション2からポピュレーション1を差し引き、陽性に標識されたクラミジア封入体をポピュレーション3として抽出します。「filter population」コマンドを使用して、ポピュレーション3にサイズフィルターを適用します。例えば、24時間以上感染させた細胞内の封入体の場合は25 square micrometersより大きいオブジェクトを保持し、初期感染時間の場合は4 square micrometersより大きいオブジェクトを保持するようにサイズフィルターを設定してください。これらの封入体は非常に小さいため、サイズフィルターによって封入体として指定されたオブジェクト集団が得られます。イメージングソフトウェアを使用して、封入体数、封入体サイズ、および封入体周囲長などの定量的データを画像から算出してください。クラミジア感染後の封入体は、黒い点として、あるいは宿主細胞内での蛍光タンパク質を発現するクラミジアとして容易に視認でき、その明瞭さを利用して、多数の視野や処理条件にわたる自動識別を行うことが可能です。このグラフで示されているように、主な用途の一つは、生存している感染細胞におけるクラミジア封入体形成単位（IFU）の測定です。これにより、時間とコストの両方を要する免疫蛍光染色法の必要性がなくなります。このイメージング手法のもう一つの重要な特徴は、あらゆるクラミジアの種や株に容易に適用できる点です。本例では、4種類のクラミジア種または株のいずれかに感染させたGFP発現HeLa細胞を用い、それぞれの種および株についてタイムコース解析を行いました。封入体をマークして解析し、示された時点における平均面積、周囲の長さ、および細胞あたりの個数を算出した。これらの属性は、宿主細胞との相互作用を含む、クラミジア封入体の生物学に関する重要な情報を提供する。ここでは、感染後48時間から125分間にわたり5分間隔で撮影したタイムラプス画像で構成された、GFPC Tracom L 2に感染したm cherry HeLa細胞のビデオを示す。このビデオを視聴することで、このリバースイメージング技術を用いてクラミジア封入体を可視化するだけでなく、封入体面積や周囲長、細胞あたりの封入体数などの封入体ダイナミクスを定量化する方法について十分に理解することができます。この手法は、より伝統的な可視化技術に比べてコスト効率が高く、すべてのクラミジア種および株に適用可能です。

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Research

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視覚化し、定量化するために蛍光タンパク質を使用しました

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