視覚化し、定量化するために蛍光タンパク質を使用しましたクラミジア液胞の成長ダイナミクス
2015年10月13日
クラミジアを含む細胞液胞(封入体)を照らすための生細胞蛍光タンパク質ベースの方法が説明されています。この戦略により、サンプル中のクラミジア感染性を迅速かつ自動的に測定でき、インクルージョン増殖ダイナミクスを定量的に調査するために使用できます。
この手順の全体的な目標は、生細胞におけるクラミジアル封入体の成長ダイナミクスを視覚化し、定量化することです。これは、まず、GFPなどの蛍光タンパク質を細胞質内で安定して発現する蛍光宿主細胞を作製することによって達成されます。次に、宿主細胞をクラミジアに感染させ、インキュベートさせます。
次に、感染した細胞を生きた蛍光顕微鏡で可視化します。最後に、クラミジア封入体特性は顕微鏡分析ソフトウェアを通じて定量化され、最終的にはライブ蛍光顕微鏡を使用して宿主細胞内のクラミジア封入体を視覚化し、封入体の生物学的パラメータを測定して定量的な結果を得ることができます。この手法が抗体ベースの計数法などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、このリバースイメージング戦略を生細胞に使用したり、他の蛍光標識と併用してすべてのクラミジアル種の包含ダイナミクスを定量
化したりできることです。さらに、細胞内の細菌を標識する日常的な方法とは異なり、このアプローチは生細胞の封入膜を照らし出すため、この病原体含有コンパートメントの重要な動的特性を明らかにすることができます。蛍光ヘラ細胞を作製した後、テキストプロトコルプレートによれば、GFPヘラ細胞を所望の培養容器、例えば高分解能イメージング用のガラス底皿4 24ウェルプレート、IFU測定およびマルチウェルスクリーニング用の24ウェルプレートで解凍し、クリッチコタス、または氷上の任意の他の所望のクラミジア株を含む凍結チューブを解凍し、HBSSで所望の感染の多様性に希釈する。Crich Cotusによる静電気感染を行うには、LGV zero VL 2をウェルから培地を吸引し、HBSSを使用してGFPヘラ細胞を洗浄します。
希釈した細菌をウェルに加え、摂氏25度で2時間インキュベートし、細胞を吸引してHBSSで洗浄します。次に、増殖培地を添加した後、二酸化炭素インキュベーター内で細胞を摂氏37度でインキュベートし、血清型Dまたは他のクラミジア株へのクリッチによる遠心分離支援感染を行います。HBSSを使用してGFPヘラ細胞を洗浄し、希釈した細菌を細胞に加えます。
次に、感染細胞の皿をベンチトップ遠心分離機のスイングバケットローターのマルチウェルプレートホルダーに入れます。細胞をGの900倍、摂氏25度で1時間遠心分離します。次に、培養容器をバイオセーフティキャビネット内の摂氏37度の二酸化炭素インキュベーターに1時間置き、細胞をHBSSで2回吸引し、増殖培地を添加します。
感染細胞の皿を摂氏37度でインキュベートします。クラミジア封入体を可視化するには、クラミジアに感染したGFPヘラ細胞を二酸化炭素インキュベーターから取り出し、フェノールレッドと5%FBSを含まないRPMIを使用します 培地を交換するには、ディッシュまたはマルチウェルプレートを20倍以上の油対物レンズを備えた倒立蛍光顕微鏡に置きます。イメージングソフトウェアを使用して、大きなブラックホールを含む緑色細胞として現れるクラミジア感染GFPヘラ細胞を同定します。
取得設定ダイアログボックスで、サンプルに追加されたグリーンチャンネルとその他のチャンネルを取得するように設定します。キャプチャスラッシュ録音ボタンを使用して、必要な時間に画像を取得します。感染後。クラミジアに感染したGFPヘラ細胞をインキュベーターから取り出し、ディッシュをインバーター蛍光顕微鏡に置きます。
介在物が最大の直径と収量にある細胞の中平原に焦点を当てます。鮮明なエッジは、ウェルごとに少なくとも10個のフィールドで画像を取得します。ウェルは通常、反復変数または実験変数を表します。
測定タブでGFPヘラ細胞を見つけるには、オブジェクト検索コマンドを使用して緑色のチャネルを選択します。細胞の相対的な強度に基づいて閾値の強度を調整します。インクルージョンの数、またはブラックコンパートメントとGFPヘラ細胞の数を目視で手動でカウントするか、イメージングソフトウェアのアルゴリズムを使用してインクルージョンを自動的に識別してカウントします。
選択したオブジェクトをフィルタリングして、5 平方メートルを超えるオブジェクトのみを保持します。これを母集団 1 と呼びます。この母集団を使用して、fill holes in objectsコマンドを入力として適用し、この手順で母集団2を生成します。
集団 2 から集団 1 を差し引くと、集団 3 として指定された正にマークされたクラミジア含有物が得られます。filter population コマンドを使用して、母集団 3 にサイズ フィルターを適用します。例えば、細胞内の介在物に対して25平方メートルを超える物体を保持し、感染が早い場合は24時間以上保持すると、サイズフィルターは物体を4平方メートル以上保持するように設定されます。
これらの介在物ははるかに小さいため、サイズ フィルターは、介在物として指定されたオブジェクトの母集団になります。イメージングソフトウェアを使用して、介在物番号、介在物、サイズ、介在物などの定量的データを画像から計算します。クラミジア封入体に感染した際の周囲は、黒い斑点や宿主細胞内のクラミジアを発現する宿主細胞または蛍光タンパク質として容易に見え、その明瞭さは、多数の視野や治療にわたる自動同定に利用できます。
このグラフで示されているように、主要な用途の1つは、生きた感染細胞におけるクラミジア封入体形成単位の測定であり、これにより、時間と費用のかかる免疫蛍光法の必要性がなくなります。このイメージングアプローチのもう一つの重要な特徴は、あらゆるクラミジア種や菌株に容易に適用できることです。この例では、4つのクラミジア種または株のいずれかに感染したGFPヘラ細胞の経時変化解析を、これらの種および株のそれぞれについて行った。
インクルージョンをマーキングし、分析して、示された時間にセルあたりの平均面積の周囲長と数を計算しました。これらの特性は、クラミジア封入体が宿主細胞とどのように相互作用するかなど、クラミジア封入体の生物学に関する重要な情報を提供します。ここに示されているのは、GFPC、Tracom L 2に感染したmチェリーヘラ細胞のビデオで、感染後48時間から開始して125分間、5分間隔で撮影されたタイムラプス画像で構成されています。
このビデオを見れば、このリバースイメージング技術を使用してクラミジアル封入物を視覚化するだけでなく、包接物面積、周囲、細胞あたりの封入物数などの封入ダイナミクスを定量化する方法を十分に理解できるはずです。この手法は、従来の視覚化手法と比較して費用対効果が高く、すべてのクラミジア種と株で機能します。
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概要
この記事では、蛍光タンパク質を用いて生きた細胞内でのクラミジアのインクルージョンの成長ダイナミクスを可視化し定量化する方法について説明します。この技術により、クラミジアの感染力の迅速な決定が可能となり、包括的な分析のために他の蛍光ラベルと組み合わせることができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 微生物学
- 細胞生物学
- 蛍光顕微鏡法
背景
- クラミジア感染は様々な疾患において重要です。
- インクルージョンのダイナミクスを理解することは、クラミジアの生物学を研究する上で重要です。
- 従来の方法は多くの場合、固定細胞と抗体に依存しています。
- 生きた細胞のイメージングは、感染プロセスに関するリアルタイムの洞察を提供します。
研究の目的
- 生きた細胞内でのクラミジアのインクルージョンを可視化する。
- これらのインクルージョンの成長ダイナミクスを定量化する。
- クラミジアの感染力を研究するための既存の方法を改善する。
使用された方法
- GFPを発現する蛍光宿主細胞の生成。
- クラミジアによる宿主細胞の感染。
- 可視化のための生きた蛍光顕微鏡法。
- 分析ソフトウェアを使用したインクルージョン特性の定量化。
主要な結果
- 生きた細胞内でのクラミジアのインクルージョンの成功的な可視化。
- インクルージョンの成長ダイナミクスに関する定量データの取得。
- 従来の抗体ベースの方法に対する利点の証明。
- 様々な蛍光ラベルとの使用の可能性。
結論
- この方法はクラミジア感染の理解を深めます。
- インクルージョンのダイナミクスのリアルタイム分析を可能にします。
- 将来の応用にはクラミジア種のより広範な研究が含まれる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative live-cell imaging of Chlamydia inclusion growth using fluorescent proteins addresses a critical need for dynamic, high-content infection models in early discovery. This approach enables real-time measurement of pathogen-host interactions, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. The method's compatibility with multiple chlamydial species and fluorescent labels enhances its portfolio value for translational infectious disease research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization and quantitation of pathogen-induced vacuole dynamics in living host cells.
- Supports mechanistic de-risking by revealing inclusion growth parameters across chlamydial strains.
- Facilitates functional target validation by linking effector protein activity to measurable inclusion phenotypes.
- Provides quantitative outputs for hypothesis-driven interrogation of host-pathogen interactions.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, reproducible live-cell assays for inclusion enumeration and size measurement.
- Reduces reliance on antibody-based methods, lowering cost and increasing throughput for screening campaigns.
- Enables multiplexing with additional fluorescent labels for multi-parametric readouts.
- Supports automated image analysis for scalable compound evaluation and phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant infection models by capturing real-time inclusion dynamics in human cell lines.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation through quantitative, translatable infection metrics.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on dynamic pathogen-host interaction data.
Pipeline & Workflow Integration
This live-cell imaging method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting early target validation, phenotypic screening, and translational infection modeling.
- Discovery Biology: Quantitative imaging supports hypothesis testing and mechanistic clarification of chlamydial effectors.
- Screening: Assay reproducibility and quantitative outputs enable robust screening and comparative analysis.
- Analytics: Automated measurement of inclusion number, size, and perimeter provides actionable data for condition comparison.
- Translational Research: Real-time infection metrics facilitate alignment with disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: The platform is adaptable across chlamydial species and compatible with diverse fluorescent markers.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in host-pathogen studies.
- Operational Value: Standardizes live-cell infection assays for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing quantitative, real-time infection data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of infectious disease targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell fluorescence microscopy and image analysis software.
- Needs access to stably transfected fluorescent host cell lines and appropriate imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization of imaging and quantitation protocols for reproducibility.
- Adaptable to various chlamydial strains and compatible with multiplexed fluorescent labeling.
- Practical limitations include the need for careful thresholding and size filtering during image analysis.
