視覚化し、定量化するために蛍光タンパク質を使用しました

この手順の全体的な目的は、生細胞内におけるクラミジア封入体の成長ダイナミクスを可視化し、定量化することです。これは、まず細胞質にGFPなどの蛍光タンパク質を安定的に発現する蛍光ホスト細胞を作製することによって達成されます。次に、これらのホスト細胞にクラミジアを感染させ、インキュベートします。

次に、感染細胞を生細胞蛍光顕微鏡で可視化します。最後に、顕微鏡解析ソフトウェアを用いてクラミジア封入体の特性を定量化します。最終的に生細胞蛍光顕微鏡を使用して、宿主細胞内のクラミジア封入体を可視化し、定量的な結果を得るために封入体の生物学的パラメータを測定します。抗体ベースの計数法などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、このリバースイメージング戦略を生細胞に使用できる点、および他の蛍光ラベルと組み合わせてすべてのクラミジア種の封入体ダイナミクスを定量化できる点にあります。

さらに、細胞内の細菌を標識する一般的な手法とは異なり、本アプローチでは生存細胞内の封入体膜を可視化できるため、この病原体含有コンパートメントの重要な動態特性を明らかにすることができます。テキストプロトコルに従って蛍光HeLa細胞を作製した後、高解像度イメージング用のガラスボトムディッシュや、IFU決定およびマルチウェルスクリーニング用の24ウェルプレートなど、目的の培養容器にGFP HeLa細胞を播種します。凍結保存されたCrich Cotusまたはその他の目的のクラミジア株を含むチューブを氷上で融解し、HBSSで目的の感染多重度（MOI）まで希釈します。Crich Cotus LGV zero VL2を用いて静的な感染を行うには、ウェルから培地を吸引除去し、HBSSを用いてGFP HeLa細胞を洗浄します。

希釈した細菌をウェルに添加し、25 °Cで2時間インキュベートした後、細胞を吸引し、HBSSで洗浄します。次に、増殖培地を添加し、二酸化炭素インキュベーターを用いて細胞を37 °Cでインキュベートし、crich serovar Dまたはその他のクラミジア株を用いて遠心分離補助感染を行います。HBSSを用いてGFP HeLa細胞を洗浄し、希釈した細菌を細胞に添加します。

次に、感染細胞の入ったディッシュを、ベンチトップ遠心分離機のスイングバケットローター用マルチウェルプレートホルダーに設置します。細胞を900 ×g、25 °Cで1時間遠心分離します。その後、バイオセーフティキャビネット内で培養容器を37 °CのCO2インキュベーターに1時間置き、細胞を吸引し、HBSSで2回洗浄してから増殖培地を加えます。

感染細胞の入ったディッシュを37 °Cでインキュベートします。クラミジア封入体を可視化するため、クラミジア感染GFP HeLa細胞を二酸化炭素インキュベーターから取り出し、フェノールレッド不含のRPMIおよび5% FBSを用いて培地を交換します。ディッシュまたはマルチウェルプレートを、20倍以上の油浸対物レンズを備えた倒立蛍光顕微鏡に設置します。イメージングソフトを用いて、大きな黒い孔を含む緑色の細胞として観察されるクラミジア感染GFP HeLa細胞を特定します。

撮影設定ダイアログボックスで、グリーンチャネルおよびサンプルに追加されたその他のチャネルを撮影するようにソフトウェアを構成します。[Capture/Record]ボタンを使用して、任意のタイミングで画像を撮影します。感染後、クラミジア感染させたGFP HeLa細胞をインキュベーターから取り出し、ディッシュを倒立蛍光顕微鏡に設置します。

封入体の直径と収量が最大となる細胞の中央平面に焦点を合わせます。エッジが鮮明な画像を、1ウェルあたり少なくとも10視野で取得してください。通常、ウェルは反復試行または実験変数を表します。

MeasurementsタブでGFP HeLa細胞を探すには、「find objects」コマンドを使用し、グリーンチャンネルを選択します。細胞の相対的な強度に基づいて閾値強度を調整してください。封入体または黒いコンパートメントおよびGFP HeLa細胞の数を、目視で手動でカウントするか、イメージングソフトウェアのアルゴリズムを使用して封入体を自動的に識別し、カウントします。

選択したオブジェクトをフィルタリングし、5平方マイクロメートルより大きいもののみを保持します。これをポピュレーション1とします。このポピュレーションを使用して、「fill holes in objects（オブジェクト内の穴を埋める）」コマンドを適用し、このステップによってポピュレーション2を生成します。

ポピュレーション2からポピュレーション1を差し引き、陽性に標識されたクラミジア封入体をポピュレーション3として抽出します。「filter population」コマンドを使用して、ポピュレーション3にサイズフィルターを適用します。例えば、24時間以上感染させた細胞内の封入体の場合は25 square micrometersより大きいオブジェクトを保持し、初期感染時間の場合は4 square micrometersより大きいオブジェクトを保持するようにサイズフィルターを設定してください。

これらの封入体は非常に小さいため、サイズフィルターによって封入体として指定されたオブジェクト集団が得られます。イメージングソフトウェアを使用して、封入体数、封入体サイズ、および封入体周囲長などの定量的データを画像から算出してください。クラミジア感染後の封入体は、黒い点として、あるいは宿主細胞内での蛍光タンパク質を発現するクラミジアとして容易に視認でき、その明瞭さを利用して、多数の視野や処理条件にわたる自動識別を行うことが可能です。

このグラフで示されているように、主な用途の一つは、生存している感染細胞におけるクラミジア封入体形成単位（IFU）の測定です。これにより、時間とコストの両方を要する免疫蛍光染色法の必要性がなくなります。このイメージング手法のもう一つの重要な特徴は、あらゆるクラミジアの種や株に容易に適用できる点です。本例では、4種類のクラミジア種または株のいずれかに感染させたGFP発現HeLa細胞を用い、それぞれの種および株についてタイムコース解析を行いました。

封入体をマークして解析し、示された時点における平均面積、周囲の長さ、および細胞あたりの個数を算出した。これらの属性は、宿主細胞との相互作用を含む、クラミジア封入体の生物学に関する重要な情報を提供する。ここでは、感染後48時間から125分間にわたり5分間隔で撮影したタイムラプス画像で構成された、GFPC Tracom L 2に感染したm cherry HeLa細胞のビデオを示す。

このビデオを視聴することで、このリバースイメージング技術を用いてクラミジア封入体を可視化するだけでなく、封入体面積や周囲長、細胞あたりの封入体数などの封入体ダイナミクスを定量化する方法について十分に理解することができます。この手法は、より伝統的な可視化技術に比べてコスト効率が高く、すべてのクラミジア種および株に適用可能です。