Name: 微小血管系を対象に細菌感染を研究するためのヒト化マウスモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-01T15:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: 学ぶNeisseria meningitidisによるヒト微小血管感染メカニズムを、ヒト皮膚移植免疫不全マウスモデルで可視化する手法。組織学的・免疫蛍光解析で感染進行を評価し、髄膜炎菌治療戦略の開発に貢献する。

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著者は、原稿の重要な読書のためのDumenilラボのすべてのメンバー、特にジルケ·シルバに感謝したいと思います。マホソットヨーロジョルジュ·ポンピドゥー（HEGP）での手術部門、デビッドMaladry。マイケルHivelin博士パトリックBruneval、HEGPの病理部。エリザベスユック率いるPARCCの動物施設、。この作品は、次のgrant機関によってサポートされていました：マリー·キュリーのIEFの交わりがない。 273223（KM）、INSERMからATIP-アベニールグラントは、CODDIM機器の助成金（イル=ド=フランス地方）、FRM機器の助成金、優秀コンソーシアムのIBEID研究所（財団はLA RECHERCHEmédicaleを注ぐ）、ANR助成金」（通信社国立ラ·ルシェルシュを注ぐ）バグ·イン·フロー」。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備に何の役割がありませんでした。

1。リスクと権限<ol><li> 地元の倫理委員会は、すべての動物のプロトコルを承認する必要があります。このプロトコルは、フランスやヨーロッパの実験動物の管理と使用に関する規制（Décrets87から848、2001から464、2001から486及び2001から131とによって確立されたガイドラインに基づいて実施された欧州指令2010/63/UE）とローカル倫理委員化委員会D&#39;ETHIQUEエンマチエールD&#39;実験ANIMALE、大学パリデカルト 、パリ、フランスで承認した。いいえ：CEEA34.GD.002.11ん。 </li><li>人間の肌のために、書面による通知を患者の同意を得て、すべての手順は、フランス国のガイドラインに従って実施し、地域の倫理委員会、 化委員会D&#39;評価ETHIQUEドゥINSERM IRB 00003888 FWA 00005881、パリ、フランス世論によって承認された：11から048 。 </li><li> 髄膜炎菌は、潜在的に有害な人間の病原体であるとORGAを取り扱う際に必要なすべての予防措置が取られなければならないNISM。これらの注意事項は、ワクチン接種が含まれており、バイオセーフティレベル2の条件の下で働く。 </li></ol> 2。皮膚移植<ol><li>できるだけ時間をグラフトに近い人間の皮膚を収集します。本研究では、皮膚の大部分は、腹部領域に関連する整形手術操作から来ている。乳房、脚、さらには顔の他のソースは、成功を収めて使用されている。 </li><li>好ましい流フードの下で、70％エタノールで皮膚表面を洗浄し、十分に洗浄された表面上に平らに横たわっによりヒト皮膚のサンプルを準備します。 </li><li>プリセット厚さの皮膚分節を用いて皮膚の上から200〜400程度のスライスをスライス。 </li><li>短期保存のための10％血清（3-12時間で、すぐにまたはDMEM中で4℃、グラフト化する場合には整合性のために、皮膚のスライスを確認し、2センチメートル×2センチメートルの正方形に切ると、（二価の陽イオンを含まない）PBS中に置く）。 </li><li>ケタミン（100 mg / kgの）およびキシラジン（10 mg / kg）の麟蹄で6〜8週齢のSCID.bgマウス（約20g）を麻酔しCTED IP </li><li>マウスを麻酔した後、つま先のピンチ、痛みの反射を確立するための標準的な方法を実行することによって、疼痛反応をチェック。角膜の乾燥を防ぎ、移植片が配置される肩の後ろに動物の左側を剃ることを目にゲルを適用します。作業中はヒートパッド上でマウスを暖かく保つ。 </li><li>手術のためにマウスを準備中した後、70％EtOHで剃毛エリアを清掃してください。 </li><li>移植部位（Tronothane）に局所局所麻酔を適用し、慎重に湾曲したハサミでマウスの皮膚の表層を除去することにより、移植部位を準備します。基礎となる血管系を破壊しないように注意してください。 </li><li>人間の皮膚切片の面積より少し小さい面積で皮膚を取り除きます。 </li><li> PBS（またはDMEM）から肌のスライスを削除し、移植床の上に置いて、表皮側が上を向いている保証されます。ステップ2.8から2.10に移植床が乾燥しない確実に、可能な限り迅速に行うべきである。 </li><li> 1角を合わせまたはEDGEおよび組織接着剤で固定します。慎重にエッジの周りに組織接着剤の少量を配置し、移植床に皮膚スライスの残りに合う。いつものサイズに、ヒトの皮膚をトリミングではなく、移植床を大きくしてください。 </li><li>マウスの皮膚は非常に柔軟であるとして移植床の上にきつすぎる肌を引っ張らないでください。 </li><li>移植片は各コーナーにおける組織接着剤で固定されていることを確認します。 </li><li>ヨウ素溶液で領域をきれいにします。 </li><li>移植片の上にクッション面積でバンドエイドを適用します。バンドエイドが企業が、タイトではなく、動物の呼吸に影響を与えないことを確認してください。 </li><li>ドレッシングテープでバンドエイドを修正します。 </li><li>動物は暖かい表面に回復することができます。 </li><li>目を覚ましたら、そのケージに動物を返します。動物はケージ当たり2-3に収容されている。 </li><li>痛みや苦痛の徴候のための回復中に定期的にマウスを確認してください。 10〜14日、移植後、移植片を破壊しないように注意しながら、バンドエイドを削除します。我々の経験では、術後の痛みはミニですMAL。それにもかかわらず、動物は操作の後、数日、特に毎日監視する必要があります。痛みや苦痛の基準は以下の通りである。 <ul><li> 10パーセント以上の重量の損失</li><li>物理的な外観、毛皮、せむしの位置、目</li><li>増加呼吸や心臓の料金</li><li>減少または異常な動き。 </li><li>体温の上昇</li><li>場合、疼痛の兆候が検出されたparacetamoleが（300 mg / kgを、4時間毎）を経口投与する。痛みが続く場合は人道的なエンドポイントは厳密に接着されている。 </li></ul></li><li>移植片が乾燥して見える場合はしなやかな肌を保つために2〜3日ごとにベビーオイルを適用します。 </li><li>移植片は、実験21日後に移植のための準備ができています。 </li></ol> 3。感染<ol><li>感染の前日には、適切な抗生物質を含むGCB寒天プレート上にストリークした細菌株を準備します。 5％CO 2中で37℃で一晩増殖させる。 </li><li> 細菌の準備 <ol&gt; <li> OD 600は0.05〜10％血清を有するヒト内皮SFM培地5mlのにReinoculate細菌。 </li><li>緩い蓋をインキュベーターで2時間（37℃、5％のCO 2）振とうしながら、約OD 600 0.1の細菌密度まで、インキュベートする。 </li><li> 3分15,000 rpmで細菌を遠心分離する。 </li><li> PBS中の上清と再懸濁を削除し、再度遠心する。 </li><li>二回の洗浄ステップ（2.2.4-2.2.5）を繰り返します。 </li><li> PBSに細菌ペレットを再懸濁します。 </li><li> OD 600を測定します。 </li><li> OD 600 0.1（10 8 CFU / ml）のいずれかの培養物、またはOD 600 1.0（10 9 CFU / ml）を作る。この既知の濃度から、10 7 CFU / mlに希釈する。できるだけ噴射時間に近い細菌を準備してみてください。 </li></ol></li><li> マウス <ol><li>マウスを秤量する。 </li><li>ケタミン（100 mg / kg）を、およびキシラジンでマウスを麻酔し（10 mg / kg）を腹腔内注射</li><li>一度眠って、C一体その疼痛反応は、熱パッドで暖かくマウスを保ち、乾燥を防ぐために眼軟膏を入れ、つま先のピンチによっては存在しない。 </li><li>各マウスに食塩水またはPBSに再懸濁ヒトトランスフェリン8mgのを与える、腹腔内注射</li><li>尾からの血液の小滴を取り、血液が感染前に滅菌されているチェックする寒天プレート上に広げた。 </li><li>静脈内に後眼窩または尾静脈から100μlを10 7 CFU / mlの細菌培養（10 6 CFUの合計）を注入。 5分後に注射を取っCFUの測定値に関係なく、注射部位に一致している。 </li><li>数分後、尾の端を切り取ると、すぐに感染後の血中のCFUを確立するための1 10倍希釈して、適切な抗生物質を含む寒天プレート上に血液サンプルを広げた。 </li><li>組織接着剤で尾を封印。 </li><li>注入後、細菌接種を希釈し、CFUを確立するために、適切な抗生物質を含む寒天プレート上に広げた。 </li><li>マウスを許可する彼らが移動になるまでヒートパッド上で回復さ</li><li> 6時間感染後に、尾部から少量の血液を引き出す希釈し、6時間後にCFUを確立するためにプレート。 </li><li> CO 2で一晩5％で37℃で、すべての寒天プレートをインキュベートする。 </li></ol></li></ol> 4。犠牲<ol><li>感染の選択された時に、ケタミン（100 mg / kg）をおよびキシラジンでマウスを麻酔した（10mg / kg）を腹腔内注射</li><li>眠っていると、熱パッドでマウスを暖かく保つ。 </li><li>痛みの反射が（つま先のピンチを）行っているときは、尾の先端を切り取ると血を引く。 </li><li>適切な抗生物質を含む寒天プレート上に血液を広め、5μlの直接およびCFUを確立するために、10μlの1:10希釈。 </li><li>頚椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げる。 </li><li>すべての関連機関および倫理指針に従ってマウスを犠牲にした後に、ハートビートの欠如によって死亡が確認された。正中切開を行い、胸郭を切って、聞くに切開するT。 </li><li>滅菌チューブの心臓/胸腔と場所からできるだけ多くの血液を採取する。 </li><li>無菌プレートに臓器（ 例えば 、肝臓、脾臓、脳）を取り外します。 </li><li>無菌プレートに皮膚移植およびマウスの皮膚のセクションを削除します。 </li><li>マウス本体を処分。 </li><li>採取した血液を15分間凝固させされた後、3,000 rpmで15分間遠心分離して。 </li><li> ELISAまたはFACSベースの方法によるサイトカインの検出については、例えば、後の分析のために-80℃で、血液やストアから血漿を除去。 </li></ol> 5。臓器CFU計数<ol><li>各生検の前のサンプルを取ることに500μlのPBSを含む管を均質化量る。 </li><li>無菌の生検パンチを使用して各組織から4mmの生検サンプルを取る。 </li><li> 500μlのPBSを含む予め秤量均質化チューブに置いて生検。他の臓器には小さいビーズを使用し、2mmのビーズを用いて皮膚試料をホモジナイズする。 </li><li>残りのTを配置顕微鏡検査のために4℃で4％パラホルムアルデヒド（PFA）およびストア内の問題（以下参照）。 </li><li> （CFU / mgの組織のそれ以降の計算のために）生検の重量を確立するための生検を含むチューブを均質化量る。 </li><li>サンプルを均質化する。 <ol><li> 30秒間6,000 rpmで、肝臓、脾臓および脳を均質化する。 </li><li> 30秒間6,000 rpmで皮膚サンプルを均質化し、必要に応じて繰り返します。 </li></ol></li><li>寒天プレート上に各均質化チューブから希釈液を広げ、器官CFUカウントを確立するために、5％CO 2中で37℃で一晩増殖する。 </li></ol> 6。組織学/免疫組織化学<ol><li> 固定 <ol><li> 4℃で一晩4％PFA中の組織を修正しました。固定工程は長くなる場合があり、長期間保存するには、0.25％PFAで組織を配置した場合。 </li><li> PBSに組織を洗い流してから、20％ショ糖溶液中に置き、一晩または組織が溶液中に沈んするまで4℃に戻ります。 </li><li> （組織型の中で、またはベースボードに接着さのいずれか）のサイズと10月溶液中の場所にカットし、PBS中で組織を洗浄します。 </li><li>すぐに液体窒素中に浮遊するペトリ皿上で組織を凍結する。 </li><li>凍結後、保存のために-80℃に移す前に、ドライアイスの上に組織を置く。 </li></ol></li><li> スライシング <ol><li> -80°Cから組織を取り出して、クライオスタットに-20℃に平衡化させる。 </li><li>スライス約10〜15ミクロンの厚さの組織とは、コーティングされた顕微鏡スライド上に配置します。 </li><li>必要になるまでストアは-20℃でスライドさせる。 </li></ol></li><li> 染色 <ol><li>スライドを室温に戻します。 </li><li>疎水性のペンでスライド上のスライスを中心に描く。 5〜10分待ちます。 </li><li> 5分間PBS中/洗浄スライスを再水和、二回繰り返します。 </li><li> 10分間、PBS中0.1％トリトンにおける透過処理スライス。 </li><li> 5分間、PBS 2〜3倍に洗浄します。 </li><li> PBS中のブロック10〜60分の間で使用される抗体又は汚れに応じて0.1％トリトン1％BSA。 </li><li>ブロッキングバッファー外し、ブロックバッファに必要に応じて希釈した一次抗体を加える。決められた時間インキュベートする。 （多くの場合、室温で1時間、または一晩4℃）。 </li><li> 5分間、PBS 2〜3倍に洗浄します。 </li><li>ボックバッファ内の適切に希釈した二次抗体を適用し、DAPIは、一般的に、このステップに含まれています。暗闇の中で、決められた時間、多くの場合、1〜2時間室温でインキュベート。 </li><li> 5分間、PBS 2〜3倍に洗浄します。 </li><li>マニキュアでカバーガラスとシールで封入剤を保護するフェードインマウント。 </li><li> 4℃でのイメージ染色スライド直ちにまたはストア</li><li>使用蛍光団への適切なフィルター/レーザーを使用して設定または共焦点蛍光顕微鏡で撮影を行う。 </li></ol></li><li> 組織学 <ol><li>スライドを室温になるまで組織学のために使用することができます。 </li><li>として使用して染色スライドtandardヘマトキシリン​​/エオシン染色プロトコル。 <ol><li>スライドラックにスライドを置きます。 </li><li>次の順序でソリューション間のスライドラックを移す。 </li><li>水道水に2秒。 </li><li>フィルタリングヘマトキシリン​​溶液中で3分。 </li><li>流水に10秒。 </li><li>蒸留水に10秒。 </li><li>エタノール100パーセントに10秒。 </li><li>フィルタリングエオシンに2秒。 </li><li>流水に10秒。 </li><li>エタノール100パーセントに10秒</li><li>キシレン×3（バスI、II、III）に2分。 </li><li>すぐに転送して、各スライド上にトップの上に置いてカバースリップを固定接着剤を数滴を追加し、気泡を除去、数時間乾燥させます。 </li><li>画像は、標準的な白色光顕微鏡下でスライドする。 </li></ol></li></ol></li></ol>

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著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

動物モデルは、細菌の病原性の研究に非常に重要である。それは完全に細胞培養におけるin vivo環境を模倣することは不可能であり、それは、宿主-病原体相互作用は、多くの動的要因によって影響されることが明らかになってきている。このようなNのようないくつかの臨床的に重要な病原体の人間の特異性髄膜炎は 、HIV、HCV、 熱帯熱マラリア原虫、リステリア·モノサイトゲネス、及びチフス菌は、これらの感染症のためのin vivoモデルの使用が制限されている。我々は、感染ステップが、特異に関与しているかを理解し始めるように、しかし、ヒト化モデルが開発されている。ここで説明するプロトコルは、Nの生体内感染で豊富を考慮して、マウスへのヒト微小血管の導入に伴い、このデモで髄膜炎は 、血管損傷、時には紫斑発疹の開発をもたらし。 このモデルを用いて、我々のTfpの接着性細菌の変異体を使用し、血管損傷、接着18の非存在下で減少することが、インビボでの血管コロニー形成に関与していることを定義することができた。以前は、循環細菌産物は、この損傷に関与しているが、我々の結果は、地元密着性と血管コロニー形成のために決定的な役割を示唆している。これは新たな治療ターゲットの開発のための新しい可能性を開きます。病原性細菌の付着は、薬学的にブロックすることができれば、それはおそらく皮膚病変の発症を予防し、組織の壊死、壊死組織切除および切断の点で髄膜炎菌の生存者のためのより良い成果につながる可能性があります。仕事はまた、感染の複雑さと、免疫応答および凝固カスケードの関与を実証しています。我々は、本ヒト内皮18の比較的少量にもかかわらず、感染したマウスの血清中のヒトサイトカインシグナル伝達を同定した。これは、領域内にマウスの免疫細胞集団の浸透に伴って、有意なサイトカイン応答を示した。 動物モデルは、もちろん完全にヒトの疾患を複製することはできませんし、すべての結果はこのことを考慮して検討する必要があり、そこから集めました。例えば、このモデルでは、血液や循環細胞は、マウス由来のものであり、私たちは、彼らが人間の細胞に異なる挙動を示すことが軽視することはできません。この利点は、しかしながら、我々の最近の刊行物18に示されているように、循環するマウス細胞とは、ヒト内皮から発信シグナリング分化する能力である。このモデルで用いたマウスの免疫無防備状態のバックグラウンドは、さらに「ヒト化」局面を添加し、ヒト免疫細胞集団の同種転写を可能にするであろう。マウスの免疫不全の背景には、しかし、このすべてのモデルに欠けや不良NK、TまたはB細胞の役割をマスクすることができる。比較的ショアこのモデルで使用されるTの時間枠（24時間）は、主に生得的反応に関係しますが、長期的な感染症や免疫、その他のオプションの開発のために検討される必要があるかもしれない。 皮膚はNのための重要な感染部位である髄膜炎菌が、ヒトの血管の比較的少量を有し、また、多数の器官が関与する全身感染にデータを外挿することは困難であることを意味する。このモデルは、皮膚病変の開発の研究を可能にしながら、このような上皮および血液脳交差点などの髄膜炎菌感染症の重要なステップが含まれていません。これらのヒト化モデルのさらなる開発は、感染のこれらの他の側面に対処するために必要とされる。それにもかかわらず、このモデルでは、多数のヒトの特定の病原体、血管をターゲットに、特にそれらのための大きな可能性を提供しています。

髄膜炎菌性敗血症は、細菌性病原体、髄膜炎菌によって引き起こされ、頻繁に致命的な血液由来感染症です。以前に細菌や細菌産物1を循環させることによって引き起こされる血管の破壊に関連していた彼らの皮膚に点状出血や紫斑発疹と共に存在しばしば髄膜炎菌性敗血症患者。臨床患者から皮膚生検は、多くの場合、血管2を充填、微細血管に関連する細菌を示しています。離れて細菌から、広範な血栓症、凝固、渋滞や血管漏出はプルプルの地域3〜5に見られる。この血管の損傷は、髄膜炎菌の生存者でのデブリードマンおよび切断で、その結果、皮膚や周囲の組織の広範な壊死が引き起こされ得る。感染はこの血管損傷の原因とどのように理解することは、予防と治療戦略を最適化することが重要である。髄膜炎菌性敗血症の研究の大半は上のin vitroで行われているNの人間の特異性に起因するヒト細胞株髄膜炎菌 。感染の多くの側面は、細菌の接着、宿主細胞応答ならびにサイトカイン応答6-9を含むin vitroで研究されている。 IV型線毛（TFP）は、Nの主要な接着細胞小器官として関与している髄膜炎菌は、上皮細胞および内皮細胞の両方で10。またN.の付着が示されている宿主細胞への髄膜炎菌は、せん断応力に依存し、従って、微小血管11内の血流速度に関連すると考えられている。これは、細菌が生体内で直面する動的応力が病因に重要であるを示唆している。これは、 インビトロで小血管の微小環境をモデル化するが非常に困難である。 ナイセリア Tfpのための接着受容体はまだ不明であり、したがって、動物モデルにおける細菌の付着を達成するノックイン戦略は、現時点で想定することはできない。 CD46はTfpの受容体であることが示唆されたトランスジェニック動物は、マウスモデルとして作用するように作製した。しかし、これらの動物における感染は、大規模な感染につながるものではないか、開発12,13発疹する。 ナイセリア感染菌血症の態様に関して記載されている他の動物モデルは、鉄源14,15として考慮ヒトトランスフェリンのための細菌嗜好を取る。ヒトトランスフェリンを補充するか、長時間にわたって血流中の増加した細菌負荷における導入遺伝子の結果からそれを発現するが、このモデルは、細菌の接着または発疹現像16,17を示していないのいずれか。 このプロトコルでは、皮膚の微小血管系を含むヒトの皮膚は、免疫不全マウス18,19に移植されたヒト化マウスモデルを記載している。これは、マウスの循環で灌流機能性ヒト血管になる。ヒトトランスフェリン補充と組み合わせることで、このModelはN.ヒトの特定の側面の少なくとも二つを占める生体内環境における髄膜炎菌、すなわち 、ヒト内皮およびヒトトランスフェリン、。N.髄膜炎は 、血管損傷や紫斑発疹の開発18を含む臨床患者で報告されているものに似ている病理を生産する、人間の内皮に特異的に接着し、このモデルに静脈内に導入された。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>31885-023</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン 500</td><td>Virbac France</td><td></td><td>ロット番号</td></tr><tr><td>VAL4243 キシラジン</td><td>バイエル ヘルスケア</td><td>AMM N&deg;FR/8146715 1980年2月</td>号 <td>ロット番号KPO809S</td></tr><tr><td>Optigel&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Europhta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lacrigel&nbsp;</td><td>薬物オートリス&eacute;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tronothane</td><td>Lisa Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC 寒天培</td>地 <td>Conda</td><td>1106</td><td></td></tr><tr><td>ヒト内皮 SFM 培地</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>11111</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>P A A</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td>ヒトトランスフェリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3309</td><td></td></tr><tr><td>UEA レクチン - ローダミン</td><td>Vector Labs</td><td>RL-1062</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9627</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Sober Hand Dermatome</td><td>Humeca BV, Holland</td><td>4.SB01</td><td></td></tr><tr><td>アニマル ハウジング</td><td>イノベーティブ</td><td>M-BTM-C8</td><td></td></tr><tr><td>生検パンチ (4 mm)</td><td>Dominic Dutscher</td><td>30737</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Prep Lysing Matrix M tubes</td><td>MP Bio</td><td>116923050</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Lyzer Green Beads</td><td>Roche 3358941001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagNA Lyzer</td><td>Roche</td><td>3358976001</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD 封入剤</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>Tissue Glue</td></tr><tr><td>OCT tissue tek</td><td>さくら</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

微小血管系を対象に細菌感染を研究するためのヒト化マウスモデル

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

髄膜炎菌は、ヒトの血流に入る重度の、しばしば致命的な敗血症を引き起こす。感染症は、血管漏出、紫斑発疹および最終的な組織壊死の発症をもたらす血管の甚大な被害をもたらす。この感染症の病因を研究する以前にin vivoモデルを困難にして細菌の人間の特異性によって制限されていました。このプロトコルでは、人間の皮膚、皮膚微小血管を含むが、免疫不全のマウスに移植されているこの感染ヒト化モデルについて説明します。それらのヒトの特徴を維持しながら、これらの血管は、マウスの循環に吻合。このモデルでは、Nに導入されると髄膜炎菌は、広範な血管損傷、炎症や紫斑発疹のいくつかのケースでは、開発中で、その結果、人間の血管に独占的に準拠しています。このプロトコルは、コンテでのこのモデルの移植、感染および評価の手順を説明しますNのXT 髄膜炎菌感染症。技術は、血流に感染する多数のヒト特異的病原体に適用することができる。

CFU計数 N.これらの代表的な結果で使用される髄膜炎菌株は、Nである。にOPC - - 、PilC1 + / PilC2 +20 膜炎 8013クローン12、血清群Cの臨床分離株では、私はSBピリン、オーパクラスを表現する。株は染色体挿入部18から緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するように操作されていた。細菌のコロニー形成単位数を寒天プレート上のコロニーの数を計数し、血液のCFU / mlまたはメッキ既知の容量からの組織のCFU / mgのいずれかを計算することによって確立される。血球数は、5分、10 6 CFUの細菌の静脈注射後に血液中を循環する1.5×10 5 CFU / mLの平均値（ 図1A）があったことを示した。 6時間後にカウントが4.8×10 4 CFU / mlの平均。 24時間別の平均数は、4 CFU / mlのX 10 2.4であったが、10匹のマウスのグループで、5は持っていた検出可能な他の5が比較的高いカウント（ 図1A）を持っていたが、細菌を循環させる。皮膚サンプルから取られたCFU計数は、6時間および24時間（ 図1B）での組織の4.4×10 2 CFU / mgである組織の2.1×10 4 CFU / mgの平均化、人間の皮膚にかなりの数を持つマウスの大部分を示している。反対マウス皮膚試料は、N.のための強い優先性を示す、24時間および6時間で非常に低い数でなく細菌数を示さなかった移植皮膚（ 図1B）における人間の血管への髄膜炎 。一般細菌数では2匹の動物は、彼らが高い循環細菌数（ 図1C）と相関したように、血液からの汚染に起因する可能性を示してカウントをしたが、サンプリングされた他の臓器で検出不能と非常に低かった。モデルはまた、IV型πを、例えば、 インビボでの病原性因子の役割を決定するために使用することができる李。提案Tfpの「付着因子」を欠いている細菌Tfpのを欠損株をもたらしpilD遺伝子 21において定義された変異を有する株だけでなく、pilC1遺伝子 8は 、モデルに導入した。これらの変異は、TFPは、生体内（ 図1D） での接着で再生されている重要な役割を確認し、ヒト皮膚移植片無し細菌の付着が生じた。 免疫組織化学/組織学これらの実験において、我々は、N.使用二次染色を必要とせずに蛍光検出を可能にするために緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する髄膜炎菌株 。ヒト血管は、ヒト内皮細胞のマーカーのいずれかを用いてCD31（PECAM-1）またはレクチンハリエニシダのハリエニシダ凝集素 （UEA）18,22を染色した。 UEAは、一工程染色（ 図2A-C）を可能ローダミンとコンジュゲートした。細胞核を染色することができますDAPIでEDは組織構造（ 図2A-B）を識別するのに役立つ。 組織学は、標準的なヘマトキシリン​​/エオシン染色を用いて行った。皮膚の表皮/真皮境界線は明確に識別した。炎症、血栓症および血管漏出は24時間感染（ 図2D）の後に、この国境に近い血管に濃縮した。血栓症は、多くの場合、渋滞や炎症を伴ういくつかの小さな皮膚血管に見えた。組織への赤血球の漏出うち血管損傷の広範なレベルを示す、見ることができた。非感染マウスでの移植皮膚の組織病 ​​理なしに区別炎症18で正常に見えた。感染の約30％において皮膚の細菌の付着は、肉眼で検出可能な紫斑病（ 図2Eおよび2F）の開発につながる。 <img alt="図1" fo:content-width=<html> SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1highres.jpg&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1.jpg&quot; /&gt;：FO &quot;5インチ&quot; 図1。 CFUカウントされます。（A）5分、6時間、および24時間後の感染における血液のミリリットル当たりの細菌CFU計数。 （B）細菌CFU 6時間および24時間感染後の両方で、ヒト皮膚（HS）とマウス皮膚（MS）とを比較する皮膚試料からカウントする。 （C）細菌CFUを24時間後に感染を講じ、他の器官からカウントします。野生型N.に感染したマウスから24時間感染後に採取ヒトおよびマウスの皮膚サンプルからの細菌CFUカウントを比較すると（D） 髄膜炎菌 2C43染色（WT）、pilD遺伝子 （pilD）またはpilC1遺伝子 （pilC1）に変異を有する株に変異した株。すべてのグラフは、中央値で生データとして表示されます。図はMelican らから変更されている。18&quot;_blank&quot;&gt;拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2.jpg" /> 図2。真皮（D）表皮（E）の国境に近い、UEAレクチン（赤）で染色したヒト微小血管を示す共焦点スタックの顕微鏡。（A）は、投影。容器は、Nに感染している髄膜炎菌 （緑）2時間後に感染。 （B）の光のスライスとNを示すスライス投影（C） 髄膜炎菌の微小コロニー（緑）感染のヒト血管（UEA -赤）皮膚移植2時間後感染中。 N.で24時間感染させたヒト皮膚移植片の（D）ヘマ ​​トキシリン/エオシン染色髄膜炎菌 。表皮（e）は、真皮（D）の境界線がはっきりと見えると豊富な血栓症およびmicrovessの混雑ですELS（矢印）は、真皮に見られる。炎症およびいくつかの血管漏出（矢頭）も同定することができる。 （E）の感染前に人間の皮膚移植。 （F）Nの（E）の 24時間後に感染と同じ皮膚移植プルプル領域（矢印）を示す膜炎は、 図2（b）は、2D、2E、および2Fは Melican ら 18から変更されている図 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックし</a> 。

髄膜炎菌は、血管に感染するヒト特異的病原体である。このプロトコルでは、ヒト微小血管は、免疫不全マウスにヒト皮膚を移植することによってマウスに導入される。細菌は、典型的には、ヒトの場合に観察紫斑発疹の血管損傷と発展につながる、人間の血管に広く付着する。

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

この手順の全体的な目的は、細菌であるNeisseria meningitidisがin vivoでヒトの血管に感染するメカニズムを研究することです。まず、免疫不全マウスにヒトの皮膚を移植してヒトの真皮血管を導入し、次に、このヒト化マウスに細菌を感染させることでこれを達成します。その後、あらかじめ設定した時間まで感染を進行させます。最終ステップとして、感染結果を評価するために血液および組織サンプルを採取します。最終的に、組織学、免疫蛍光染色、ならびに血液および組織分析を組み合わせて、ヒト血管における感染の進行を解析します。細胞培養モデルや動物モデルなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、これらの感染中に起こる典型的な臨床病理を初めて観察できることです。採取後できるだけ早く、ヒト皮膚の表面を70% ethanolで清拭し、十分に洗浄した平面（できればフローフード内）に平らに置きます。次に、厚さをあらかじめ設定した皮膚切除機（ダーマトーム）を用いて、皮膚の表面から200 to 400 µmの厚さのスライスを切り出します。スライスの完全性を確認し、さらに2 cm四方の正方形に切り揃えます。正方形の組織をPBSに入れ、外科的処置を済ませて麻酔をかけた6〜8週齢の重症複合免疫不全ベージュマウスの除毛部位を70%エタノールで清浄します。移植部位に局所麻酔を施した後、湾曲鋏を用いて、移植片よりもわずかに小さい範囲のマウス皮膚の表層を、下層の血管を傷つけないよう注意しながら慎重に除去します。移植片の乾燥を防ぐため迅速に操作し、ヒト皮膚スライスの一片を、表皮側を上にして移植床の上に配置します。組織の端を合わせ、組織用接着剤で固定します。その後、残りのヒト皮膚を移植床に慎重に適合させ、それぞれの端の周囲に少量の組織用接着剤を塗布します。グラフトベッドを広げるのではなく、常にヒト皮膚を適切なサイズに切り揃えてください。各角が固定されていることを確認した後、ヨード溶液で患部を洗浄し、クッション面をグラフトの上に重ねて、動物の呼吸に影響が出ないよう注意しながら、しっかりと、ただし締め付けすぎないように絆創膏を貼付します。その後、ドレッシングテープで絆創膏を固定し、暖かい場所で動物を回復させます。覚醒後、細菌注入まで動物をケージに戻し、その間に一晩プレート培養した菌を液体培養に継代します。感染当日の朝、細菌が目的の濃度に達した時点で、細胞を1×10⁷ CFU/mLに希釈します。その後、麻酔をかけ、移植マウスの鎮静状態を足先でのつまみ反応（toe pinch）によって確認し、動物をヒートパッドの上に置きます。動物の眼に眼軟膏を塗布し、次いで腹腔内（ip）に、生理食塩水に溶解した8 mgのヒトトランスフェリンを各マウスに注射します。その後、各個体の尾端を切断し、尾から得られた少量の血液をアガールプレートに塗布して、感染前の血液が無菌状態であることを確認します。次に、細菌培養液100 µLを後眼窩静脈注射によって静脈内に投与します。数分後、再び尾端を切り取り、この血液サンプルを新しいアガープレートに塗布します。感染直後の血液中のコロニー形成単位を確定させるため、組織接着剤で尾端を封鎖し、細菌接種液を希釈して適切な抗生物質を含むアガープレートに塗布します。感染後6時間における接種菌のコロニー形成単位を確定させるため、各マウスの尾から少量の血液を再度採取し、先ほど示した方法で血液滴を希釈および塗抹して、6時間後のコロニー形成単位を測定します。その後、すべてのプレートを37°C、5% CO2条件下で一晩インキュベートし、感染動物のコロニー形成単位をカウントします。安楽死させた各マウスの正中線に切開を入れて開始します。次に、各個体の肋骨を切断し、心臓を切開します。滅菌シリンジを用いて、心臓および胸腔から可能な限り多くの血液を採取し、サンプルごとに個別の滅菌チューブに分注します。次に、目的の臓器を取り出し、その後、皮膚移植片とそれに付随するマウス皮膚の切片を、動物1匹につき1枚の滅菌プレートに転送します。採取した血液を15分間静置して凝固させ、その後、遠心分離します。次に、血液から血漿を分離し、後の解析のために-80°Cで保存します。次に、PBSを500 µLずつ含むホモジナイズチューブを計量します。続いて、滅菌済みの生検パンチを使用して、解剖した各組織から4 mmの生検サンプルを採取します。生検サンプルを個別にホモジナイズチューブに入れ、皮膚サンプルを含むチューブには2 mmのビーズを1個ずつ加えます。顕微鏡観察用に、残りの組織を4%para formaldehydeに浸し4°Cで保存し、生検重量を確定させるためにホモジナイズチューブの重量を測定します。次に、サンプルを6,000 RPMで30秒間ホモジナイズし、ホモジネートが濁るまで皮膚のホモジナイズを繰り返します。最後に、各チューブから細胞懸濁液を新しいアガープレートに塗布し、37°C、5%carbon dioxide条件下で一晩培養します。これらの代表的な結果における臓器コロニー形成単位数を確定するため、GFP陽性の髄膜炎菌（N. meningitis）セログループC株を使用した。血球数測定の結果、1 × 10⁶ CFUの細菌を静脈注射した5分後、血液中に平均1.5 × 10⁵ CFU/mLが循環していることが示されました。6時間後には平均4.8 × 10⁴ CFU/mLとなり、24時間後までには平均菌数は2.4 × 10⁴ CFU/mLでした。しかし、この10匹のマウスのグループでは、5匹は血中細菌が検出されなかった一方、残りの5匹は比較的高い菌数を示しました。これらのグラフのバーは、皮膚から採取した各グループのCFU数の中央値を示しています。サンプルからは、大半のマウスのヒト皮膚においてかなりの菌数が確認され、組織1 mgあたり6時間後で平均2.1 × 10⁴ CFU、24時間後で4.4 × 10² CFUでした。対側マウス皮膚サンプルでは、24時間後に細菌数は検出されず、6時間後でも極めて少ない数にとどまり、移植組織内のヒト血管に対するエンドメニンギティスの強い親和性が示されました。一般的に、サンプリングした他の臓器における細菌数は非常に少ないか検出限界以下でしたが、2匹の個体で細菌数が認められ、これは血中の細菌数が多いことに関連している可能性があります。また、本モデルは、in vivoにおける病原性因子の役割を決定するためにも利用可能です。例えば、本実験では、機能的なIV型ピルスを欠損した細菌株を使用しました。これらの変異株に感染させたマウスでは、ヒト皮膚移植片への細菌の付着が見られず、in vivoでの付着においてIV型ピルスが極めて重要な役割を果たすことが確認されました。感染から2時間後の皮膚移植片の共焦点画像では、ロダミン標識UEAレクチンで染色されたヒト血管が観察できます。皮膚の表皮・真皮境界が明確に識別でき、感染したGFP陽性の髄膜炎菌が血管全体にわたってはっきりと観察されます。このH&amp;E染色されたヒト皮膚移植片は、炎症と血管漏出、および表皮真皮境界に近い血管に集中した血栓症を示しています。感染から24時間後、約30%の感染において、皮膚への細菌付着が肉眼的に検出可能な紫斑の形成につながりました。したがって、本手法の開発は、宿主と病原体の相互作用に従事する研究者が、ヒト血管という文脈において疾患のメカニズムを研究するための道を切り開くものです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ここで、我々は、ヒト臍帯血由来内皮コロニー形成細胞（ECFCs）と皮下免疫不全マウスへのコラーゲン/フィブロネクチンゲルに埋め込まれている骨髄由来間葉系幹細胞（MSCs）を、、実現する方法論を説明します。このセル/ゲルの組み合わせは、マウスの血管系に接続する人間の血管ネットワークを生成します。...

免疫不全マウスにおける生体工学ヒト微小血管ネットワーク

出典: Valentine, M. E.ら、『 緑膿菌 におけるインフレーム遺伝子欠失変異体の生成および感染の単純なマウスモデルにおける病原性減損の検証』。 J. Vis.

生物発光を用いたマウスモデルにおける細菌感染のリアルタイムイメージング

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

このビデオは、GFP発現好中球を持つ免疫不全のトランスジェニックマウスの感染部位での好中球動員ダイナミクスを研究するためのin...

マウスモデルにおける感染部位における好中球動員動態と細菌負荷のモニタリング

このビデオでは、皮膚創傷感染症のマウスモデルを生成する手法を示しています。好中球に蛍光タンパク質を発現するように操作されたマウスに、遺伝子組み換え生物発光黄色ブドウ球菌(病原菌)を感染させると。感染部位の細菌負荷と好中球動員動態は、全動物イメージングを用いて研究することができます。...

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生きたマウスにおける血管炎症及び血栓形成の間に活性化内皮上に異型血小板、好中球の相互作用のリアルタイムイメージング

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局所および全身所における病原体により誘導される慢性炎症のためのマウスモデル

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微小血管系を対象に細菌感染を研究するためのヒト化マウスモデル

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