微小血管系を対象に細菌感染を研究するためのヒト化マウスモデル

この手順の全体的な目標は、細菌性髄膜炎が生体内で人間の血管に感染するメカニズムを研究することです。これは、まず免疫不全マウスにヒトの皮膚を移植し、それによってヒトの真皮血管を導入することによって達成されます。第2ステップでは、ヒト化マウスに細菌を感染させます。

その後、感染は所定の時間進行します。最終ステップでは、感染の結果を評価するために血液と組織のサンプルが取得されます。最終的には、組織学、免疫蛍光法、血液および組織分析の組み合わせを使用して、ヒトの血管における感染の進行を研究します。

この技術が細胞培養モデルや動物モデルなどの既存の技術よりも優れている点は、これらの感染中に起こる典型的な臨床病理を初めて観察できることです。収集後できるだけ早く、70%エタノールで人間の皮膚表面をきれいにし、その後、できればフローフードの下に、よくきれいな表面に平らに置きます。次に、あらかじめ太さを設定したダーマイトームを使用して、皮膚の上部から200〜400マイクロメートルのスライスを切り取ります。

スライスの完全性を確認し、さらに 2 x 2 センチメートルの正方形にトリミングします。正方形をPBSに配置し、次に外科的に準備された麻酔薬6〜8週齢の重度の免疫不全ベージュマウスと70%エタノールの剃った領域を洗浄します。移植部位に局所麻酔薬を塗布した後、湾曲したハサミを使用して、移植片よりわずかに小さい領域のマウス皮膚の表層を慎重に除去し、下にある血管系を乱さないように注意してください。

移植片が乾燥しないように素早く移動し、人間の皮膚スライスの1つを移植片ベッドの上に置き、表皮側が上を向くようにします。ティッシュの端を揃え、ティッシュ接着剤で固定します。次に、残りの人間の皮膚を移植床に注意深くフィットさせ、各エッジの周りに少量の組織接着剤を置きます。

移植片の床を大きくするのではなく、常に人間の皮膚をサイズに合わせてトリミングしてください。各角が固定されていることを確認したら、ヨウ素溶液でその部分をきれいにし、動物の呼吸に影響を与えないように注意しながら、クッション面を移植片の上にしっかりと、しかししっかりとバンドエイドを貼った後、バンドエイドをドレッシングテープで固定し、動物が暖かい表面で回復するのを待ちます。目が覚めたら、細菌注射が一晩のプレート培養物を液体培養に再接種するまで、動物をケージに戻します。

感染の朝、細菌が所望の濃度に達したら、細胞を1ミリリットルあたり10の7コロニー形成単位の1倍に希釈します。次に麻酔後、つま先で移植したマウスの鎮静を確認します。動物をつまんでヒートパッドの上に置きます。

動物の目に目の軟膏を塗り、次にipを置きます。各マウスに8ミリグラムのヒトトランスファーを生理食塩水に注入します。次に、各動物について、尾の先端を切り取り、尾から少量の血液を寒天プレートに広げて、感染前に血液が無菌であることを確認します。

次に、眼窩後注射により、100マイクロリットルの細菌培養物を静脈内注射します。数分後、尾の端を再度切り取り、この血液サンプルを新鮮な寒天プレートにも広げます。感染直後に血液コロニー形成単位を確立するには、尾部を組織接着剤で密封し、次に細菌の接種物を希釈し、適切な抗生物質とともに寒天プレートに広げます。

感染後6時間で接種コロニー形成単位を確立するには、マウスの各尾部から別の少量の血液を採取し、次に、6時間でコロニー形成単位を確立するために、今示したように血液滴を希釈してプレートします。次に、すべてのプレートを摂氏37度で5%二酸化炭素に一晩インキュベートして、臓器コロニー形成を行います。感染した動物のユニット数。

安楽死させた各マウスに正中線を切開することから始めます。次に、動物ごとに肋骨を切り取り、心臓を切開します。滅菌シリンジを使用して、心臓と胸腔からできるだけ多くの血液を採取し、サンプルごとに個別の滅菌チューブに分注します。

次に、目的の臓器を切除し、皮膚移植片とそれに付随するマウスの皮膚切片を、動物1匹につき1枚の滅菌プレートに移します。採取した血液を15分間凝固させてから、スピンダウンします。次に、血液から血漿を取り出し、後で分析するために摂氏マイナス80度で保存します。

次に、それぞれ500マイクロリットルのPBSを含む均質化チューブを計量します。次に、滅菌生検パンチを使用して、解剖された各組織から4mmの生検サンプルを採取します。生検をホモジナイジングチューブに個別に配置し、各チューブに皮膚サンプルを含む2mmビーズを1つずつ入れます。

顕微鏡検査のために、残りの組織を摂氏 4 度の 4% パラ ホルムアルデヒドに保管し、均質化チューブの重量を量って生検重量を確立します。次に、サンプルを 6 、 000 RPM で 30 秒間均質化し、均質化物が泥沼になるまで皮膚の均質化を繰り返します。最後に、各チューブからの細胞スラリーを新鮮な寒天プレートに広げ、5%二酸化炭素中で摂氏37度で一晩培養します。

これらの代表的な結果に数える臓器コロニー形成単位を確立するために。N型髄膜炎のGFP陽性株。血清群Cを用いた。

血球計算は、細菌の6コロニー形成単位に1×10のIV注射の5分後、血液中を循環するミリリットル当たり平均1.5×10〜5コロニー形成単位が存在していたことを示した。6時間後、カウントは24時間までに1ミリリットルあたり4.8倍から第4コロニー形成単位まで平均する。平均カウントは、ミリリットルあたり10〜4コロニー形成単位の2.4倍でした。

しかし、この10匹のマウスのグループでは、5匹のマウスは検出可能な循環細菌を持たず、他の5匹は比較的高い数でした。これらのグラフのこれらのバーは、スキンから取得された各グループのCFUカウントの中央値を示しています。サンプルは、マウスの大部分がヒトの皮膚にかなりの数を持っており、6時間で組織の1ミリグラムあたり平均10倍から4番目のCFUの2.1倍、24時間で組織のミリグラムあたり10の10倍4.4

対側のマウス皮膚サンプルは、24時間後に細菌数を示さず、6時間後には非常に少ない数しか示さず、移植組織のヒト血管に対する末端髄膜炎の強い好みを示しています。一般に、サンプリングされた他の臓器では細菌数が非常に少ないか検出不可能であったが、2匹の動物が数を示しており、これは循環細菌数が多いことと相関している可能性がある。このモデルは、in vivoでの病原性因子の役割を決定するためにも使用できます。

例えば、この実験では、機能的なタイプ4ピルIを欠損した細菌株をマウスに用いて、これらの変異株に感染したマウスはヒトの皮膚移植片に細菌の接着を示さず、タイプ4ピルIが生体内での接着に重要な役割を果たしていることが確認された。これらの皮膚移植片の共焦点画像では、感染の2時間後に、レクチンUEA結合ロミンで染色されたヒト血管を観察できます。皮膚の表皮真皮境界は明確に識別でき、感染しているGFP陽性および髄膜炎は血管全体ではっきりと観察できます。

この h および e で染色されたヒト皮膚移植片は、炎症と血管漏れ、および表皮真皮境界に近い血管に集中する血栓症を示しています。感染の約 30% で、感染の 24 時間後に、皮膚内の細菌の付着により、肉眼的に検出可能な紫斑病が発症しました。したがって、この技術の開発は、研究と宿主病原体の相互作用に関与する研究者が、人間の血管の文脈で病気のメカニズムを研究する道を開くものです。