ライブ培養神経細胞の抗体供給した後細胞表面および内在化タンパク質の異なる標識化

この手順の全体的な目標は、生きているニューロンの表面上のタンパク質を標識し、その後、差動二次抗体標識を使用して表面タンパク質と内在化タンパク質を区別することです。これを行うには、カバーガラス上で培養した初代ニューロンを、表面エピトープに対する抗体とインキュベートし、インキュベートしてインターナリゼーションを可能にします。インキュベーション後、蛍光標識された二次抗体を適用して、表面に露出したタンパク質を同定します。

次に、過剰な非標識二次抗体を適用して、残っている表面タンパク質一次抗体複合体をブロックします。次に、培養されたニューロンを透過し、異なる色の二次抗体を適用して、内在化タンパク質を検出します。最終的には、免疫蛍光顕微鏡法を通じて、内在化タンパク質と表面タンパク質の相対レベルを示す結果を得ることができます。

この手順に従うと、ソース表面のタンパク質内在化の時間経過が得られ、バジルおよび刺激条件下でのタンパク質輸送速度に関する情報が得られます。この手順は、PBSを含む3つの別々のすすぎ皿に浸すことにより、前日に準備した細胞培養洗浄ポリリジンコーティングされた18ミリメートルボリックガラスカバースリップ用のカバースリップを準備することから始めます12ウェルプレートのウェルに500マイクロリットルのラミネート溶液を追加し、次に鉗子を使用して、カバースリップをそれぞれに配置します。それが37°Cで2時間インキュベートする井戸の底に平らに座っていることを確認するために、各カバースリップをよく押し下げ、このプロトコルは、E 15マウス皮質またはE 18ラットカバカンピのいずれかを使用して行うことができます。

このデモでは、マウスの皮質を使用しています。半腹または1腹の胚の皮質を氷の上に置き、カルシウムとマグネシウムを含むPBSを含む1ミリリットルのエイノールに入れ、氷の上に置きます。次に、1ミリリットルのマイクロピペットを使用して、皮質組織からPBSを取り出します。

次に、半リットルの胚から皮質組織に500マイクロリットルのPappa DNAの1つの溶液を追加します。摂氏37度で15〜20分間インキュベートします。インキュベーション期間中に2回、インキュベーション後にチューブを静かにフリックして内容物を混合し、炎で磨いたシリコン処理されたペーストピペットを使用して、細胞分散が得られるまで組織を10〜15回穏やかに再評価します。

離していない組織の塊が残る必要がある場合は、気泡の発生を避けてください。解離した細胞懸濁液を、ハンクのBSSに含まれる4%BS、Aの3ミリリットルのクッションの上に慎重に重ねます。次に、スイングアウトローターを搭載したベンチトップ遠心分離機で、Gの100倍で7分間遠心分離します。

スピン後、細胞ペレットを吸引しないように注意しながら、上清を慎重に取り除きます。次に、1ミリリットルの完全神経基礎培地を加え、ペレット化した細胞を再懸濁するために静かに上下にピペットで動かします。次に、ヘモサイトメーターを使用して生細胞の濃度を決定します。

位相明細胞のみが、プレーティングの直前に生きていると見なすべきです。ウェル内のカバースリップから余分なラミネート血清溶液を吸引し、一次ニューロン培養培地と交換します。次に、75, 000〜100, 000の一次ニューロンを各ウェルに追加します。

ニューロンを摂氏37度、7日目に5%二酸化炭素の神経基礎培地で最大21日間培養し、その後毎週、抗有糸分裂フルオロ、デオキシウリジンウリジンを追加してグリアの異常増殖を防ぎ、半量交換を行います。培養の最初の1週間で、ニューロンは、この2日前の培養の画像に示されているように、樹状突起を発達させました。2週目から3週目までに成熟し、シナプス形成が行われます。

この図には、14日間in vitroで採取した目的の表面露出タンパク質を標識し、一次抗体を適切な濃度で馴化培地に直接添加するための広範な予測ネットワークが示されています。各条件は三重にテストする必要があります 4つのコントロール、免疫前血清、またはエキソサイトーシス中に露出されないタンパク質の細胞内領域を認識する抗体は、テストの一次抗体と同じ希釈で使用できます。インキュベーション後1時間、2時間、または4時間細胞を培養インキュベーターに戻し、抗体含有培地を吸引し、PBSでウェルを1回穏やかに、しかし迅速に洗浄します。

ウェルに溶液を加えて室温に加え、次に吸引します。次に、新たに調製した4%パラホルムアルデヒドを加え、5分間インキュベートします。固定後、細胞を固定するために室温を追加します。

パラホルムアルデヒド溶液をウェルから取り出し、ドラフト内の液体廃棄物容器に捨てます。その後、前と同じようにPBSで細胞を3回すばやくすすぎます。カバースリップを簡単に取り外せるように、3回目の洗浄はそのままにしておきます。

次に、鉗子を使用してプレートからカバースリップを慎重に取り除き、使い捨て培養プレートのベースまたは蓋のパラムシートに細胞側を上にして置きます。染色プロトコルの残りの部分は、この表面でPBS 5%BSAのブロッキング溶液を細胞に優しくピペットで動かし、カバースリップに丸みを帯びた泡状の液滴を作り、乾燥しないようにします。30分間インキュベートします。

ブロッキング溶液に洗剤を加えないことを覚えておくことが重要です。この段階では、細胞表面タンパク質のみを標識する場合は、細胞を透過させるべきではありません。ブロッキング後、ブロッキング溶液を吸引し、表面露出タンパク質を標識し、蛍光標識二次抗体を塗布し、インキュベーション後室温で2時間インキュベートし、二次抗体を吸引し、カバースリップをPBSで2回、毎回5分間洗浄して、標識された二次抗体に結合していない細胞表面上のタンパク質をブロックします。

非透過性ニューロンを高濃度の非標識二次抗体と一晩インキュベートします。室温で。一晩のインキュベーションは非常に重要です。

インキュベーション期間を短くしても、標識された二次抗体に完全に結合していない一次抗体を完全にブロックすることはできません。翌日、カバースリップを前回と同様にPBSで5分間ずつ2回洗います。次に、固定剤を除去した後、細胞をリン酸緩衝液に4%パラホルムアルデヒドで室温で5分間後置します。

PBSで細胞を2回すばやくすすぎます。次に、細胞内標識のために、5%BSAおよび0.1%Triton X 100を含むPBSで細胞を室温で30分間透過し、ブロックします。浸透後、ブロッキング溶液を除去します。

カバースリップが乾かないように注意してください。異なるタグを付けた二次抗体を添加し、室温で2時間インキュベートします。2つ目の二次抗体を取り出した後、カバースリップをPBSで5分間3回洗ってください。

次に、脱イオン水マウントで短時間洗います。カバーは、退色防止剤を含む水性封入剤でスライドガラス上を滑らせ、スライドを摂氏4度の暗闇で乾燥保存して、蛍光シグナルを最適に保存できるようにします。共焦点顕微鏡で、適切な励起フィルターと蛍光フィルターを使用して免疫染色細胞を画像化します。

イメージング後のすべての反復と条件に同じイメージング取得パラメータを使用します。Fiji Image Jやmetamorphなどの標準的な画像解析ソフトウェアを使用して、標準的な関心領域の統合された密度や、数やサイズなどのプンタ属性を決定し、発作に関連する遺伝子6または6がニューロン表面に存在し、ニューロン表面から内在化されているかどうかを判断します。培養ラット海馬ニューロンの二重色標識は、このビデオで説明されているように行われました。

この画像では、標識された細胞表面タンパク質はシアンで示され、内在化タンパク質は緑色で示されています。矢印で示された二重染色は、不健康と思われる細胞においてのみ観察されたものであり、早期のリサイクルエンドソームマーカーであるトランスフェリンmCherryを発現するエンドソームニューロンに局在する抗体摂食インキュベーション中に内在化されたタンパク質が、樹状突起のこの領域に示されているように透過後に免疫染色されたかどうかを判断するために、トランスフェリンによる点状染色の広範な重なりが見られ、内在化されたタンパク質がエンドソームに局在していることが確認された。 この手法が既存の方法と比較した場合の主な利点は、単一の抗体を使用して細胞表面と内在化タンパク質プールを区別できることです。