Name: 迅速な合成およびGFPベースの記者との化学的に活性化する転写因子のスクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-26T20:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 学ぶ人工転写因子の酵母を用いたGFPベースのスクリーニング法。リチウム酢酸法による酵母形質転換とフローサイトメトリー解析で、遺伝子発現の選択的誘導と可逆的制御を実現する。

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RSMは、NSF大学院研究員から資金提供を認めている。 MBNはルイス·リンディスカラフェローシップからの資金とピーター·ルイスの恵まれ贈り物を認めている。 DBは、NIH（GM046406）定量生物学のための総合医科学センター（GM071508）の国立研究所からの資金提供を認めている。我々は、フローサイトメトリー実験の支援のためにクリスティーナDeCosteを認める。

図2は、プロトコルのセクション1-3の模式図を提供しています。 1。 ATFSの作成<ol><li> PCRは、目的のDNA結合ドメインを増幅するためのプライマーを作成する。 ACT1プロモーターおよびホルモン受容体に対する相同性は、（ 図3および4に記載されるように）株yMN15に正しい組換えを容易にするために、PCRを介して添加される。 </li><li> PCRは、高忠実度ポリメラーゼを用いて、目的のDBDを増幅する。 </li><li>酢酸リチウム法13を用いて、酵母に精製されたPCR産物の&gt; 1μgのを変換する。 </li><li>形質転換後、微量15秒間最高速度で細胞をスピンし、変換ミックスを削除します。 </li><li> YPDに滅菌水、プレートの〜200μl中に再懸濁します。 </li><li> 5-FOAプレート上に、YPDから翌日、レプリカプレート（コールド·スプリング·ハーバー酵母マニュアルに記載されているよう5-FOAプレートが作られる）13。 </li><li> 2-4日間増殖を可能にAYS、およびYPD上に、少なくとも5〜10個のコロニーをrestreak。含めることを確認するために、 表1およびシーケンスのプライマーを用いてコロニーPCRを行う。 </li></ol> 2。 ATFプラスミドレポーターの作成<ol><li> （文献から来る可能性が最も高い）のATFの結合部位を決定します。 </li><li> （必要に応じて、またはUltramers）順番はオリゴとして結合領域を希望する。 表2に示すようにNotI＆XbaIでの正しいオーバーハングを有する上部と下部の鎖のように注文。 </li><li>等モル濃度（100μM）にオリゴを希釈します。 </li><li> T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化して、サーモサイクラー中でアニール。反応条件を表3に示す 。 </li><li> 37℃（ 表4の反応条件）で1時間のNotI-HF＆XbaIでpMN8のダイジェスト〜1〜2μgの。 </li><li>ゲルは、バックボーンバンドを精製する。 </li><li> 10 NG /μlに精製されたバックボーンを希釈します。 </li><li>二本鎖、ホスホリルを希釈μLあたりの背骨のモル濃度を5倍の結合部位をated。 </li><li> T4 DNAリガーゼを用いて、30分間（ 表5）を、室温で消化し ​​た骨格への結合部位を連結する。 </li><li>形質転換のために、標準の50μL、このようなXL1-ブルーまたはDH5アルファなどの化学的にコンピテントな大腸菌に半分ライゲーション反応を追加します。 </li><li>次いで、熱ショック42℃の水浴中で45秒間細胞および2分間氷上に置く。 </li><li>形質転換反応にSOC培地900μLを加える。 </li><li>ローラードラム上で1時間37℃で成長する。 </li><li> LB + AMP（100μg/ ml）をプレート当たり100〜200μlの細胞を広げ、一晩インキュベートする。 </li><li> E.育つ LB + AMPでの大腸菌の液体や収穫プラスミドDNA。シーケンスは、プライマー5&#39;-GTACCTTATATTGAATTTTC-3 &#39;を使用してライゲーションコロニーから新しいレポータープラスミドを確認します。 </li><li> ATF含有酵母STRに新しいレポータープラスミドを変換酢酸リチウム形質転換を用いて第1のアイン。 </li></ol> 3。 GFPレポーターを用いた遺伝子発現にATF誘導の影響を定量化サンプルを調製する。 <ol><li> 25 mMのβ-エストラジオールの在庫（β-エストラジオールのエタノール+ 0.0681グラムの10ミリリットル）を作る。冷蔵保管してください。 </li><li> 5ミリリットルのSC-URA内のATF +レポーター含有ひずみ一夜を育てる。 </li><li>入手9 250ミリリットルのフラスコを振るし、それぞれに25ミリリットルのSC-URAを追加します。 </li><li> 0 nMで、0.1 nMで、1 nMで、10 nMで、100nmであり、1μM、または10μMのβ-エストラジオールを追加します。これは、最も容易に25mMのβ-エストラジオールストックの10倍連続希釈を作製することによって行われる。 β-エストラジオール、10μMの最終濃度のため、SC-URAの25ミリリットルに25 mMのβ-エストラジオールの株式の10μlを加える。 </li><li>フラスコ（1:200希釈）を一晩培養物の125μLを加える。 </li><li> 2残りのフラスコのために、構成的にGFP産straiで接種Nと、GFPを欠損株。これらは、フローサイトメータを較正するために必要とされる。 </li><li> 12月18日時間30℃、200rpmで振とうする。 注：最適なインキュベーション時間は、GFPの誘導もはや変化がβ-エストラジオールの添加の後に時識別することによって決定される。 </li><li>各培養液500μlを取り、別の1.7ミリリットルの微量遠心チューブにスピンダウン。 </li><li>吸引SC-URA。 </li><li> 1ミリリットルのPBS +0.1％のTween-20および吸引に一度洗う。 </li><li> PBS +0.1％のTween-20および再懸濁の1ミリリットルを追加します。 </li><li>ファルコンチューブにPBS +0.1％のTween-20の1ミリリットルを追加します。 </li><li> 5ミリリットルのチューブ（最終容量= 2ml）中に再懸濁した細胞を追加する（数日間4℃で保存することができる）。 </li><li>オプション：崩壊へ軽く超音波処理細胞任意の凝集細胞。 フローサイトメトリー分析：概要：10,000〜100,000細胞の蛍光は、一般的に、サンプルごとに分析する。データは、FlowJoソフトやMATLABでカスタムスクリプトを使用するかのどちらかに処理することができるR.は、GFP陽性および陰性コントロールを使用して、GFPチャネルの電圧を校正してください。 FCSファイルがエクスポートされると、このような機能fca_readfcsと一緒に、図6の1（としてスクリプト<a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-readerは</a> ）処理するために使用することができますデータ。 </li><li>フローサイトメトリーを実行します。 <ol><li>酵母細胞を同定するために使用する前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）。 </li><li> 〜3000セル/秒に流量を設定。 </li><li> GFP（FITCチャネル）を測定します。 </li><li>データが収集されると、輸出。、FCSファイル</li></ol></li><li> MATLABをロードします。 </li><li> 。FCSファイル、fcs_readfcs.m、 図6と同じフォルダにそのようなスクリプトを移動します。 </li><li>データとスクリプトを含むフォルダに現在の作業ディレクトリを変更します。 </li><li>注意します（ 図6からスクリプトを実行します。伝説は手動で）、図7に見ているものが生成するために入力されています。 </li></ol> 4。細胞増殖に対するATFの誘導の影響を定量化<ol><li>凍結ストックから、独立したYPDプレートの上に（1）ATF-含む株と（例えばyMN15など）（2）ATF-欠損株両方で連勝。 </li><li>成長の2日後に、各菌株をYPD液体の5ミリリットルを含む別培養管に接種し、30℃で一晩増殖</li><li> 100％エタノール中で10,000倍に0.25 mMのβ-エストラジオールの原液アップ（0.025100μMのβ-エストラジオール）の10倍連続希釈を行う。 </li><li> YPD液体（1〜250希釈）10mlに一晩培養液40μlを追加します。 </li><li>それぞれの株については、96ウェルプレートの18ウェルに希釈した細胞の96μlを加える。 </li><li>細胞にβ-エストラジオールの4を添加する。重要な点は、各ウェルは、総エタノールと同じ量を持っていることを確認することです。 （代わりに、MO<html> β-エストラジオールの濃縮ストックを使用し、その後ポイントに希釈することができる再増殖に対するエタノールの影響）は測定できない。 </li><li>三重で行う。各菌株のための井戸の三つは、エタノールのみのコントロールである必要があります。 </li><li>ガス透過性膜96ウェルプレートを覆う。 </li><li>プレートリーダーの成長（OD 600）を監視します。 </li><li>このような最大勾配を求めるなどの標準的な任意の数の方法を用いて成長速度を定量化する。 注：私たちは、Rプログラミング環境で実行されるオープンソースソフトウェアパッケージgrofit 14、との良好な成功を持っていたことが言及する価値があることを96ウェルプレートアッセイから計算された成長率は（25ミリリットル文化） -振盪フラスコと比較しながら。 （原因生理学および計測の両方の違い）、我々は（これは必ずしもそうでないかもしれないが）の相対成長率が類似していることを観察してきた、必ずしも同じではありません。 </li></ol>TLE &quot;&gt; 5。誘導ゲノム対立遺伝子を作成します。 <ol><li> pMN10、（反対方向に）KanMXに融合しpMN8からATF-応答性プロモーターとnoncentromericプラスミドを得。 </li><li>制限は、第2節のように、ベクター骨格およびゲル抽出を消化。 </li><li>アニール、リン酸化、および第2章で説明したように、適切な結合部位を含むライゲーションオリゴ。 </li><li>シーケンスが確認します。このプラスミドは、今や誘導性対立遺伝子を作成するためのDNAテンプレートとして機能する。 </li><li>興味のある対応ATFを発現する酵母株を取得。 </li><li> PCRは、 表6からのプライマーを用いて、KanMX-プロモーターカセット（〜2キロバイト）を増幅。 </li><li>酢酸リチウム法を用いて、ATF-発現株へのPCR産物を変換します。 </li><li> YPD + G418へYPDとレプリカプレート上のプレートの翌日。 </li><li>フォワードプライマー（5&#39;-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3 &#39;）および第内部のリバースプライマーを用いて、プロモーターの適切な挿入を確認その電子プロモーター遺伝子が置換されている。リバースプライマーは、典型的には、第一ATG 15の下流200-300 bpの間になるように設計されている。最終的なPCR産物を〜1.2 KBです。 </li></ol>

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</ol>

McIsaac、ノイス、およびBotstein（他の人とは）特許開示として、このシステムの一部を提出している。

ここで説明するホルモンベースのスイッチは、 生体内で DNA配列を対象とする目的のDNA結合ドメインの能力を試験するネイティブの細胞生物学を研究から、無数の用途がある。システムは、インデューサー、高速動作、および厳しい規制の段階的な応答を含む多くの望ましい特徴、持っていない（ すなわち 。測定可能な漏出を、 図7を参照）。しかし、改善と拡張の余地がある。 合成生物学における最近の研究は、多重合成システムを強調し、十分に特徴づけられた、プログラム可能なDNAの部分16のレパートリーを拡大しました。別個の標的遺伝子とは無関係に、条件式は、複数のインデューサーと重なる特異性を欠くDNA結合ドメインの両方を必要とする。設計および天然に存在する受容体の利用可能性は、新たな人工的な転写因子を開発するためにどの部分での大規模なセットを提供します。拡大する相互に直交するスイッチのレパートリーが大幅17,18に近づく方向進化によって支援されています。我々の人工的な転写因子のリガンド結合特異性を再プログラムする現在の努力は、将来的に提示される。 以前は、遺伝子欠失/過剰発現の表現型の結果は、広範囲に酵母19,20に研究されている。しかしながら、発現レベルの範囲にわたって異なる表現型上の発現の効果を研究するための簡単​​されていない。ここに提示され、システムの主な特徴は、その段階的な性質（ 図8）である。多くの場合を想定しながら、遺伝子発現と目的の表現型の間の関係は必ずしも単調でない場合があります。このような、Z 3、EV、およびZ 4、EVなどの人工的な転写因子は、直接的な遺伝子発現の変化を表現型の応答をアッセイする作業を行います。 最後に、プロトコルが議論本稿では、EDは、エンジニアリングおよびβ-エストラジオールをに応答人工転写因子を特徴づけるためのものであるが、化学的に反応するドメインへの重要な選択肢は、（このようなPhyB/Pif3、LOV、およびBLUFなど）光応答ドメインの使用であり、その活動は、培養増殖培地21-23を摂動することなく、可逆的である。光ベースのシステムは、既に証明されている21-26強力なタンパク質-タンパク質相互作用、イオン輸送、および酵素活性を、遺伝子発現の時空間制御を容易にする。 結論として、我々は、酵母における誘導、人工的な転写因子を迅速に構築するための方法を提示している。このプロトコルは、同族GFPレポーターと一緒に自分の構築のためのテンプレートを提供し、ならびにフローサイトメトリーを用いたレポーターデータを分析し、成長にATF活性化の効果を分析する方法。

酵母における遺伝子スイッチの開発は、学術と産業の両方の研究において非常に興味深いです。理想的なケースでは、遺伝子スイッチは、実験者が所望する場合にのみ、特定の遺伝子（または遺伝子セット）を活性化するために使用することができる。合成プロモーターの下流に配置された遺伝子のコード配列は、誘導分子の非存在下で発現されていません：デューサーを添加すると遺伝子が急速に表現されるべきである。これは、ごく最近、このようなスイッチは、誘導物質の非存在下で、歪みが欠失表現型を示すが、インデューサーの存在下では、発現は全ての細胞において誘導物質のレベルに比例して活性化される酵母で操作することができることが実証されている1,2。歴史的には、酵母中の条件式システムは、MET、PHO、およびGALプロモーター （活動メチオニン、リン酸の細胞外レベルに敏感であり、などの栄養素応答性DNA配列、に大きく依存してきたガラクトース、それぞれ）。条件式を得ることができるが、それは重要な多面的効果が犠牲になっている。 例えば、ヒトエストロゲン受容体などのホルモン受容体は、真核生物において有効3,4のスイッチであることが証明された。ホルモンの非存在下では、ホルモン受容体への融合タンパク質は、Hsp90のシャペロン複合体と相互作用する細胞質中に隔離され得る。適切なリガンドを結合すると、受容体は、Hsp90のシャペロン複合体から放出されるようにする、核局在化シグナルを明らかにし、コンフォメーション変化を受ける。特定のホルモン受容体含有タンパク質の局在化の動態を観察するために、我々はGal4dbd.ER.VP16（GEV、Gal4p DNA結合ドメイン、ヒトエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインを含む合成転写因子のC末端融合を作成したGFPを2とし、VP16）。核局在を添加した後の8分以内に観察されたその野生型酵母は完全に不活性であり、誘導物質、β-エストラジオールの飽和量。この時までに、細胞の大部分は、2,5（蛍光in situハイブリダイゼーションを介してアッセイ）GeVの標的遺伝子のためのはっきりと目に見える活性転写·サイトだけでなく、完全に成熟したmRNAを持っています。 GEV標的遺伝子は、核に転位DNAに結合し、転写を活性化する&lt;キメラアクチベーターのための2.5分を要することを実証し、2.5分の2,6（マイクロアレイを用いて測定）内に発現&gt; 2倍に増加した。 スイッチON-いくつかの他の（ 大腸菌（Escherichia coli）7,8とシロイヌナズナからのインジゴ系スイッチ9からの古典的なドキシサイクリンベースのスイッチを含む）は、様々な小分子や薬物を利用した酵母で適用されてきたが、どれも、スピードを達成しなかった特異性、またはホルモンベースのスイッチが示す規制の圧迫感。それは、T言及する価値がある帽子ラピッド·スイッチもオフ酵母内で開発されており、典型的には、配列2,10,11,12を対象としたプロテアーゼまたはユビキチンリガーゼに遺伝子を融合させることにより動作します。 10を削除した際に速やかに細胞から標的タンパク質を除去する能力は必須の遺伝子だけでなく、遺伝的抑制を起こしやすい遺伝子の研究を促進する。 このプロトコルに記載された方法は、建物やスイッチON-酵母における合成を特徴付けるためのものである。まず、迅速に目的のDNA結合ドメインからなるゲノムに統合された融合タンパク質を生成する方法を示し、リガンドは、ヒトエストロゲン受容体の結合ドメイン及びVP16（DBD-EVの）。我々のプロトコルに従って、融合タンパク質は、ACT1プロモーターから発現される。それから、ATFのための同族レポータープラスミドを作成し、フローサイトメトリーを使用してその機能をテストする方法を示しています。我々は新しいATFS（ 図1）で使用されているこれらのレポータープラスミドを想像するが、それらはできるBEだけでなく、ネイティブの転写活性化因子のためのレポーターとして使用される。最後に、96ウェルプレートで細胞増殖に対するATF活性化の効果を試験するためのゲノムおよび誘導性対立遺伝子を操作するための詳細が提供される。

<table><tbody><tr><td>試薬</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント&nbsp;</td></tr><tr><td>ハイフィデリティPCRシステムを拡大する</td><td>Roche</td><td>11 732 650 001</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>コンピテント E. coli</td><td>Life Technologies</td><td>18258-012</td><td></td></tr><tr><td>Estradiol</td><td>Tocris Biosciences</td><td>2824</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase</td><td>NEB</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-23</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>clonNAT</td><td>イエナ バイオサイエンス</td><td>AB-102L</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart バッファー</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>D15-500</td><td></td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>BDバイオサイエンス211677</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出</td><td>物BDバイオサイエンス210929</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>BDバイオサイエンス214010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100%エタノール</td><td>デコン研究所</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ11811-031</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>酢酸リチウム二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6883</td><td></td></tr><tr><td>サケ精子 DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>PEG 3350</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3640</td><td></td></tr><tr><td>プラスミド pMN8 および pMN10; 酵母株 yMN15</td><td>Noyes または Botstein labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ルリアブロス</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3397</td><td></td></tr><tr><td>装備:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSRIIフローシオメータ&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td>、<td>各種モデル</td><td></td></tr><tr><td>、MATLABまたはFlowJo</td>、<td>MATLAB、またはFlowJo</td><td></td><td>ソフトウェアで解析できます。フローサイトメトリー実験のFCSファイル</td></tr><tr><td>R</td><td>オープンソース</td><td></td><td>プレートリーダーからの成長率データの解析用&nbsp;</td></tr><tr><td>ファルコンチューブBD</td><td>バイオサイエンス</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>1.7mlエッペンドルフ&nbsp;チューブ</td><td>GeneMate</td><td>C3262-1</td><td></td></tr><tr><td>250 ml シェイクフラスコ</td><td>Corning</td><td>4446-250</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル、フラットボトムプレート</td><td>Costar</td><td>3635</td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー (Synergy H1 マルチモードプレートリーダー)</td><td>BioTek</td><td>H1MG</td><td></td></tr><tr><td>Breathe-Easy メンブレン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z380059-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>サーモサイクラー</td><td>さまざまな企業</td><td>さまざまなモデル</td><td></td></tr><tr><td>SC-Uraの粉</td><td>MPの生物医学114410622</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-FOA</td><td>のZymoの研究</td><td>F9001-1</td><td></td></tr></tbody></table>

迅速な合成およびgfpベースの記者との化学的に活性化する転写因子のスクリーニング

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

合成生物学は、合理的に設計し、必要な定量性を有する合成回路を構築するだけでなく、ネイティブな制御回路の構造を問い合わせるためのツールを提供することを目的とする。両方の場合において、迅速かつ調整可能な様式で遺伝子発現をプログラムする能力は、無オフターゲット効果で、有用であり得る。我々は、ヒトエストロゲン受容体およびVP16のリガンド結合ドメインが続くURA3カセットの上流にACT1プロモーターを含む酵母株を構築した。 URA3の存在に対するDNA結合ドメインおよび選択することを含む直鎖状PCR産物でこの株を形質転換することによって、恒常的に発現人工転写因子（ATF）は、相同組換えにより生成することができる。このように設計さATFS、それによって標的外の活性化と一般的に使用されるconditiで見つかった非生理学的な成長条件の両方を排除し、誘導物質の存在下で、独特の標的遺伝子を活性化することができますonal遺伝子発現系。関心対象の天然または人工的な転写因子に特異的に応答するGFPレポータープラスミドを迅速に構築するための簡便な方法も提供される。

<html> 図5に、時間をかけて、Z 3、EV、Z 4、EV、またはGEVによるGFPの誘導を示す。 nonyeastのDNA結合ドメインを含むATFSに応じて、GFPの生産の増加に注意してください。我々は最近、これが酵母ゲノム1に単一遺伝子特異性を達成するため、これらの要因に起因すると推測した。 Z 3 EV及びZ 4 EVのみ適切な結合部位（5&#39;-GCGTGGGCG-3 &#39;を含む合成プロモーターの下流に配置された標的遺伝子の発現を活性化し、5&#39;-に対し、単独GEV誘導は、数百の遺伝子の活性化/抑制につながりGCGGCGGAGGAG-3 &#39;のそれぞれ）1。 図7は 、システム（検出可能なGFP無しデューサーの結果）の厳密な調節を示し、すべてのセルを範囲全体にGFPを誘導するための、Z 3、EVの能力を誘導物質に応答して誘導取得することをβ-エストラジオール濃度は、 図8に示されている。 <html> ENT &quot;FO：キープtogether.withinページを=&quot;常に &quot;&gt; <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1.jpg" /> 図1。人工転写因子は β-エストラジオールは、ATFに結合すると、β-エストラジオールがない状態でのHsp90との対話 、Hsp90は、ATFが核に入り、プラスミドレポーターからの発現を活性化することができるように、解離する。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2.jpg" /> 図2。人工転写因子および建物/同族のGFPレポーターをテストが含まれているエンジニアリング株のためのプロトコルの概略。 load/51153/51153fig3highres.jpg &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/51153/51153fig3.jpg &quot;/&gt; 図3。LEU2遺伝子座のひずみyMN15中ACT1pr-URA3-EVシーケンス。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4.jpg" /> 図4 yMN15正常に形質転換されたときに新しい融合タンパク質を生成するために、付加的な配列相同性により、目的のDNA結合ドメインを増幅するためのPCRプライマーの設計。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5.jpg" /> 図5。1μMのβ-エストラジオールに応じて三つの異なるATF-プロモーターの組み合わせによるGFPの誘導 。&lt;/ pの&gt; <img alt="図6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6.jpg" /> 図6の処理フローサイトメトリーデータのためのMATLABスクリプト 。このスクリプトは、から適応した<a href="http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data">http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data</a> 。 <img alt="図7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7.jpg" /> 図7。0μMの誘導のβ-エストラジオールおよび1μMのβ-エストラジオール、次の18時間に応じて、Z 3、EVによるGFPの誘導。蛍光はまた、MEAたZ 3 EVシステムの厳密な調節を説明するために、GFPを欠く細胞からsured。この図は、 図6のコードを使用して生成された。 <img alt="図8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8.jpg" /> 図8誘導物質濃度と発現量との関係は〜1のHill係数で傾斜している。（A）β-エストラジオール濃度の関数としてのGFP発現の分布。 （B）（A）の分布の平均蛍光。データは、Dは、β-エストラジオールの用量である= G 最小 +（G のmax-G minの ）D のn /（K nの + D n）は 、G min及びG maxは最小であり、関数G（D）に適合させたとGFP最大値、解像度pectively、nはHill係数であり、Kは½（G + G 最大最小 ） が得られるβ-エストラジオールの投与量である。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="176"><tbody><tr><td>オリゴヌクレオチド配列</td><td>名前</td></tr><tr><td> 5&#39;-TTGAAACCA AACTCGCCTCT-3 &#39; </td><td> DBDはフォワードチェック</td></tr><tr><td> 5&#39;-tccagagac ttcagggtgct-3 &#39; </td><td> DBDチェックリバース</td></tr></tbody></table> 表1：エストロゲン受容体への関心のDBDの正確な融合を確認するためのプライマー。フォワードプライマーは、相同ACT1プロモーターであり、リバースプライマーは、エストロゲン受容体に相同である。典型的なのDBD（〜300 bp）のために、PCR産物は&lt;1.5 kbのである。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td>オリゴヌクレオチド配列</td><td>名前</td></tr><tr><td> 5&#39;-ggccgc ... DBDの一気飲みサイト... t-ブチル3 &#39; </td><td>トップオリゴ</td></tr><tr><td> 5&#39;-ctaga ... DNA結合部位の逆... GC-3 &#39; </td><td>下のオリゴ</td></tr><tr><td> 5&#39;-GCC gcGTGGGCG T GCGTGGGCG G G CGTGGGCG T GCGTGGGCG G GCGTG GGCG T GCGTGGGCG T-3 &#39; </td><td>トップオリゴ+ 6X Zif268の結合部位</td></tr><tr><td> 5&#39;-ctagaCGCCCACGCACGCCCACGCC CGCCCACGCACGCCCACGCCCGCC CACGCACGCCCACgc-3 &#39; </td><td>下のオリゴ+ 6X Zif268の結合部位</td></tr></tbody></table> 興味のある結合部位を含む二本鎖DNAを作成するためのプライマーの表2。のS tructure。Z 3 EV-応答性プロモーターを作成するには、オリゴヌクレオチド上のオリゴ+ 6X Zif268の結合部位およびボトムオリゴ+ 6X Zif268の結合が使用された。正しいDNAオーバーハングを作成するための配列は小文字です。 Zif268のコンセンサス結合部位、GCGTGGGCGは、一番上のオリゴに下線が引かれている。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td>試薬</td><td>額</td></tr><tr><td> T4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液</td><td> 5μL </td></tr><tr><td> T4ポリヌクレオチドキナーゼ（10,000単位/ ml @） </td><td> 1μL </td></tr><tr><td>トップオリゴ（100μM） </td><td> 1.5μL </td></tr><tr><td>下のオリゴ（100μM） </td><td> 1.5μL </td></tr><tr><td>水</td><td> 41μL </td></tr></tbody></table> 表3。リン酸化し、上記の反応液50μlを使用したサーモサイクラー中でアニールするプライマー。2サーモサイクラーのステップがあります。ステップ1：37℃、30分（リン酸化）、ステップ2：95℃、30秒（4℃まで1℃ごとに30秒をステップダウン、アニール）。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td>試薬</td><td>額</td></tr><tr><td>をXbaI </td><td> 1μL </td></tr><tr><td> NotIで-HF </td><td> 1μL </td></tr><tr><td>プラスミドDNA </td><td> 5μL（1〜2μgの） </td></tr><tr><td> 10倍のカットスマートバッファ</td><td> 5μL </td></tr><tr><td>水</td><td> 38μL </td></tr></tbody></table> 表4。 XbaIおよびNotIでプラスミドpMN8の制限消化。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr height="22" style="height:16.5pt"><td class="xl65" height="22" style="height:16.5pt;width:66pt" width="88">試薬</td><td class="xl66" style="width:66pt" width="88">額</td></tr><tr height="43" style="height:32.25pt"><td>のT4リガーゼBufのFER </td><td> 2μL </td></tr><tr height="22" style="height:16.5pt"><td> T4リガーゼ</td><td> 0.2μL </td></tr><tr height="43" style="height:32.25pt"><td> 10 NG /μL@バックボーン</td><td> 1μL </td></tr><tr height="106" style="height:79.5pt"><td> 5倍モル濃度/μL@結合配列</td><td> 1μL </td></tr><tr height="22" style="height:16.5pt"><td>水</td><td> 15.8μL </td></tr></tbody></table> 表5プラスミドDNAへの結合部位をライゲーションする 。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td>プライマー</td><td>説明</td></tr><tr><td> 〜40塩基対上流のATG + CGCACTTAACTTCGCATCTG-3 &#39; </td><td> KanMX-プロモーターを増幅するためのフォワードプライマー</td></tr><tr><td> 5&#39;-逆相補（ATG +〜37bp）+ TATAGTTTTTTCTCCTTGACG-3 &#39; </td><td> PRIを逆転KanMX-プロモーターを増幅するためのマー</td></tr><tr><td> 5&#39;-caatttgtctgctcaagaaaataaa ttaaatacaaataaaCGCAC TTAACTTCGCATCTG-3 &#39; </td><td> GCN4プロモータースワップを作るためのフォワードプライマー。 </td></tr><tr><td> 5&#39;-tggatttaaagcaaataaacttgg ctgatattcggacatTATAGTT TTTTCTCCTTGACG-3 &#39; </td><td> GCN4プロモータースワップを作るためのリバースプライマー。 </td></tr></tbody></table> 表6。PCRはtitratible対立遺伝子を作るためのKanMX-プロモーターを増幅する。

このプロトコルは、同族のGFPレポーターおよびフローサイトメトリーを経由してGFPの発現を刺激するATFS能力を定量化した人工転写因子（ATFS）を迅速に構築するための実験的な手順を説明します。

迅速な合成およびGFPベースの記者との化学的に活性化する転写因子のスクリーニング

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

この手順の全体的な目的は、所望の特異性を持つ、遺伝的にコードされた誘導性人工転写因子（ATF）を作成し、試験および検証することである。これはまず、単純な酵母形質転換によってATFを作成することで達成される。この際、DNA結合領域のPCR産物を組み込むことで、ヒトエストロゲン受容体およびVP16とのインフレーム融合体が得られる。本手順の第2ステップは、プラスミドPMN 8の結合部位をTF標的配列に置換することにより、ATF用のGFPレポータープラスミドを作成することである。手順の3番目のステップでは、ATFがGFPレポーターを活性化させる能力をアッセイすると同時に、増殖速度を測定して酵母の生理学的影響を評価します。手順の最終ステップでは、検証済みのTFを用いて、ネイティブなゲノム標的を条件付きで発現させます。最終的に、あらゆる目的の標的遺伝子を条件付きで活性化させることが可能です。ガラクトース介在性の遺伝子発現誘導などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、多面的な影響を及ぼすことなく、多様な栄養条件および生理学的条件下で選択的な誘導が可能である点にあります。この手法により、目的の遺伝子産物を迅速かつ可逆的に導入できるため、機能獲得および機能喪失の両面から検討することができ、酵母生物学における重要な問いへの回答に寄与します。まず、高正確性ポリメラーゼを用いて、目的のDNA結合ドメイン（DBD）をPCR増幅します。リチウムアセテート法を用いて、1 µg以上の精製済みPCR産物を酵母に形質導入します。形質導入後、マイクロ遠心分離機を用いて細胞を最高速度で15秒間遠心分離し、形質導入混合液を除去します。その後、細胞を約200 µLの滅菌水で再懸濁し、酵母エキス・ペプトン・ブドウ糖（YPD）培地に塗布します。翌日、YPD培地から5-フルオロオロチ酸プレートへレプリカプレートを作成します。2～4日間培養後、少なくとも5～10個のコロニーをYPD培地に再塗抹します。次に、テキストプロトコルにあるプライマーを用いてコロニーPCRを行い、配列を確認してインサートが含まれていることを検証します。目的の結合領域のオリゴヌクレオチドを等モル濃度に希釈します。T4ポリヌクレオチドキナーゼを用い、テキストプロトコルの反応条件に従って、neoサーモサイクラーで結合領域をリン酸化します。次に、約1〜2 µgのPMN 8をNot IおよびXho Iで37 °Cで1時間消化します。バックボーンのバンドを精製し、精製したバックボーンを10 nanograms/µLに希釈します。次に、二本鎖のリン酸化結合部位を、バックボーンの5倍のモル濃度（per µL）に希釈します。T4 DNA Ligaseを用いて、室温で30分間、消化したバックボーンに結合部位をライゲーションします。ライゲーション反応液の半分を50 µLの標準的な化学的コンピテントE. coli細胞に加え、テキストプロトコルに記載された手順に従って形質転換を行います。細胞を回復させた後、Luria BertiまたはLB+アンピシリンプレート1枚あたり100〜200 µLの細胞を播種し、一晩インキュベートします。翌日、LB+アンピシリン液体培地でE. coliを増殖させ、テキストプロトコルに記載の方法でプラスミドDNAを回収します。次に、ライゲーション後のコロニーから新しいレポータープラスミドを回収し、配列確認を行います。最後に、酢酸リチウム法を用いて、この新しいレポータープラスミドをTF含有E株に形質転換します。まず、TFとレポーターを含む菌株を、ウラシル欠損合成完全培地 5 mLで一晩培養します。250 mLの三角フラスコを9個用意し、それぞれにSC-URA培地を25 mLずつ加えます。次に、25 mMのβ-estradiolストック溶液を10倍段階希釈し、テキストプロトコルに記載されている異なる希釈濃度のβ-estradiolを7個のフラスコにそれぞれ調製します。ここに、オーバーナイト培養液を125 µLずつ添加します。残りの2個のフラスコには、GFPを恒常的に発現している株と、GFPを欠損している株をそれぞれ接種します。これらはフローサイトメーターの校正に使用します。フラスコを200 RPM、30 °Cで12〜18時間振盪させます。次に、各培養液から500 µLを分取し、個別の1.7 mLエッペンドルフチューブで遠心分離します。上清を吸引した後、ペレット化した細胞をフローサイトメトリー用バッファーで1回洗浄し、その後、同バッファー1 mLで細胞を再懸濁します。次に、9本のファルコンチューブにフローサイトメトリー用バッファーを1 mLずつ加えます。再懸濁した細胞を、バッファーが入ったファルコンチューブに加え、最終容量を2 mLにします。最後に、フローサイトメトリーを実施します。前方散乱光（forward scatter）と側方散乱光（side scatter）を用いて酵母細胞を同定します。流速を毎秒約3000細胞に設定します。チャンネル50でGFPを測定し、凍結保存ストックからのテキストプロトコルに従って、A TF保持株とA TF欠損株の両方をYPDプレートにストリークします。2日間の培養後、5 mLのYPD液体培地を含む個別の培養チューブに接種し、各菌株を30 °Cで一晩培養します。0.25 millimolarのβ-エストラジオールストック溶液を100%エタノールを用いて10,000倍まで10倍段階希釈します。各オーバーナイト培養液40 µLを10 mLのYPD液体培地に加えます。各株について、希釈した細胞96 µLを96ウェルプレートの18ウェルに分注します。次に、細胞に4 µLのβ-エストラジオールを加えます。重要な点は、各ウェルの全エタノール量が同一であることを確認することです。各株につき3つのウェルを用いて、エタノールのみを加えるトリプリケート（3連系）試験を行います。コントロール群では、96ウェルプレートをガス透過性膜で覆います。プレートリーダーを用いて、600 nmの吸光度で増殖をモニタリングしてください。最大傾斜法のなど、任意の数手の手法を用いて増殖速度を定量します。テキストプロトコルPCRに従ってプラスミドを調製した後、can MX プロモーターカセットを増幅させます。リチウムアセテート法を用いてPCR産物をA TF発現株に形質転換し、形質転換細胞をYPD培地にプレートし、翌日にYPDにG418抗生物質を加えた培地へレプリカプレートします。最後に、フォワードプライマーおよびプロモーターを置換した遺伝子の内部にあるリバースプライマーを用いて、プロモーターが適切に挿入されているかを確認します。最終的なPCR産物は約1.2 KBです。ここでは、1 µMのβ-estradiolに対する応答として、3つの異なるa TFプロモーターペア（Z4 EV、Z3 EV、またはGEV）によるGFPの誘導を時間経過とともに示しています。酵母以外のDNA結合ドメインを含むATFに応答して、GFPの産生量が増加していることに注目してください。これは、これらの因子が酵母ゲノムにおいて単一遺伝子特異性を達成した結果であると考えられます。GEVの誘導のみで数百の遺伝子の活性化または抑制が起こるのに対し、Z three EVおよびZ four EVは、適切な結合部位を含む合成プロモーターの下流に配置された標的遺伝子の発現のみを活性化します。ここでは、0 nMのβ-estradiolおよび18時間の誘導後の1 µMのβ-estradiolに対するZ three EVによるGFPの誘導が示されています。また、Z three EVシステムの厳密な制御を実証するために、GFPを欠損した細胞からも蛍光を測定しました。ここでは、さまざまなβ-estradiol濃度においてZ three EVがGFPを誘導できる能力が示されています。分布の平均蛍光強度から、誘導剤濃度と発現出力の関係は段階的であり、ヒル係数が約1であることから、Z three EVの結合が独立していることが示唆されます。本手順の後、単一の遺伝子の発現変化がゲノム全体の遺伝子発現パターンにどのように影響するかといった追加の問いに答えるために、遺伝子発現マイクロアレイなどの他の手法を実施することが可能です。このビデオを視聴することで、人工転写因子の設計、試験、および有効性の検証方法について十分に理解できるはずです。これらの人工転写因子は、適切なDNA標的配列の下流に配置された遺伝子の発現を条件付きで制御します。

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我々は、高スループットのロボットのトランスフェクションと自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを使用して転写調節因子を同定するための迅速で安価なスクリーニング法を提示する。このプロトコルは、急速に数千の遺伝子のための直接のサイド·バイ·サイド機能データを生成し、目的の任意の遺伝子をターゲットに簡単に変更可能です。...

自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを用いて、ハイスループット機能スクリーニング

細胞プロセスのシステム·レベルの理解を達成することは、現代の細胞生物学の目標です。我々はここでゲノム規模のRNAiライブラリーを用いた遺伝子の機能を調べるために、様々な細胞機能のエンドポイントのルシフェラーゼレポーターを多重化するための戦略について説明します。...

培養細胞における癌関連シグナル伝達を問い合わせるための多重ルシフェラーゼベースのスクリーニング·プラットフォーム

ここでは、細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイを、3'...

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

例として、マウスABCトランスポーターBcrp1（ABCG2）を用いて、 イン・シリコプロトコルは、マウス組織において発現される遺伝子に代替プロモーターの使用を検出するために、レポーターアッセイを用いて同定された代替的なプロモーターの機能性を評価するために提示されています。...

代替プロモーターの使用およびマウスBcrp1の転写調節を発見する方法

安易な蛍光アッセイであるアミノ アミノアシル tRNA-合成酵素/tRNA ペア哺乳類細胞で発現したタンパク質に非正規のアミノ酸 (ncAAs) を組み込むことの効率を評価する. します。サイトと bioorthogonal GPCR の生きているセルのラベルを連結する光橋マッピングを含む ncAAs の G タンパク質共役受容体 (Gpcr)...

光橋マッピングおよび生きている哺乳類細胞における Bioorthogonal 化学の Gpcr にプローブを化学物質の遺伝的結合の最適化

強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーニング興味の人間 DNA 領域にバインドできる転写因子 (TFs) を識別するためにプロトコルを紹介します。このメソッドのバインディングを問い合わせたりすることができます高速スクリーニング パイプラインを使用して &gt; 単一の実験で 1,000...

人間の DNA 配列に結合する転写因子を識別するために強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーン

転写因子の新しい調節因子を同定するために、我々は、二重ルシメラーゼベースの転写レポーターアッセイを用いて、配列レンチウイルスまたはレトロウイルスRNAiライブラリをスクリーニングするアプローチを開発した。このアプローチは、1回の実験で数百人の候補者をスクリーニングするための迅速かつ比較的安価な方法を提供します。...

アレイ化されたライブラリの中スループットスクリーニングとデュアルルシファーゼベースレポーターを用いた転写因子レギュレータの同定

この研究では、組換えGタンパク質共役受容体(GPCR)上の低分子ライブラリをスクリーニングするための384ウェルプレートのハイスループット細胞内カルシウム蛍光アッセイについて説明します。標的は、牛熱ダニ由来のキニン受容体である リピケファルス・マイクロプラスが、...

組換えGタンパク質共役型受容体のハイスループットスクリーニングのための「二重付加」カルシウム蛍光アッセイ

本研究では、3DプリントされたLEDアレイを用いたハイスループット実験を行い、HEK293T細胞における光誘導性遺伝子発現を最適化する方法を紹介します。...

哺乳類の遺伝子発現を制御するための光誘導システムの迅速な最適化

ヒトCD40活性化B細胞の生成

学ぶ人工転写因子の酵母を用いたGFPベースのスクリーニング法。リチウム酢酸法による酵母形質転換とフローサイトメトリー解析で、遺伝子発現の選択的誘導と可逆的制御を実現する。

迅速な合成およびGFPベースの記者との化学的に活性化する転写因子のスクリーニング

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