迅速な合成およびGFPベースの記者との化学的に活性化する転写因子のスクリーニング

この手順の全体的な目標は、遺伝的にコード化された誘導性人工転写因子またはATFを所望の特異性で作成、試験、検証することです。これは、まず、A DNA結合ドメインPCR産物の包含がヒトエストロゲン受容体およびVP 16とのインフレーム融合をもたらす単純な酵母形質転換を介してA TFを作成することによって達成されます。手順の第2ステップは、プラスミドPMN 8の結合部位をA TFターゲティング配列に置き換えることにより、A TF用のGFPレポータープラスミドを作成することです。

手順の3番目のステップは、GFPレポーターを活性化するATFの能力を分析し、成長率を測定することにより酵母生理学への影響を評価することです。手順の最後のステップは、検証済みのTFを使用して、ネイティブゲノムターゲットを条件付きで発現することです。最終的には、目的の任意の標的遺伝子を条件付きで活性化することができます。

この手法がガラクトースを介した遺伝子発現誘導などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、多様な栄養および生理学的条件下で選択的誘導を多面的効果なしに達成できることです。この方法は、目的の遺伝子産物を迅速かつ可逆的に導入することで、酵母生物学における重要な疑問に答えるのに役立ち、機能の獲得と喪失の両方の研究を可能にします。まず、目的のDNA結合ドメインまたはDVDを、ハイフィデリティポリメラーゼを用いてPCR増幅します。

精製したPCR産物の1マイクログラム以上を酢酸リチウム法を用いて酵母に形質転換します。形質転換後、細胞をマイクロ遠心分離機で最高速度で15秒間回転させ、形質転換混合物を除去し、細胞を約200マイクロリットルの滅菌水に再懸濁してから、酵母抽出物にプレーティングします。ペプトデキストロースまたはYPDミディアム翌日のレプリカプレートは、YPDから5つのフルオロエロ酸プレートに。

2〜4日間成長した後、少なくとも5〜10個のコロニーをYPDに再移植します。次に、テキストプロトコルおよび配列中のプライマーを使用してコロニーPCRを行い、包含を確認します。目的の結合領域オリゴを等モル濃度に希釈します。

T 4ポリヌクレオチドキナーゼを使用して結合領域をリン酸化し、次にテキストプロトコルの反応条件に従ってneoサーモサイクラーを使用します。次に、約1〜2マイクログラムのPMN 8をHFとxbを1つも含まずに消化します。摂氏37度のゲルで1時間1回。

バックボーンバンドを精製し、精製したバックボーンをマイクロリットルあたり10ナノグラムに希釈します。次に、二本鎖リン酸化結合部位を、マイクロリットルあたりの骨格のモル濃度の5倍に希釈します。T 4 DNAリガーゼを使用して、室温で30分間、結合部位を消化された骨格にライゲーションします。

ライゲーション反応の半分を標準的な化学的にコンピテントなEIA大腸菌細胞の50マイクロリットルに添加し、テキストプロトコールに記載されている手順に従って形質転換を行います。細胞を回収した後、luria bertiまたはlbとアンピシリンプレートあたり100〜200マイクロリットルの細胞を添加し、一晩インキュベートします。翌日、大腸菌とポンド、およびアンピシリン液を増殖させ、テキストプロトコルに記載されているようにプラスミドDNAを採取します。

次に、ライゲーションコロニーからの新しいレポータープラスミドの配列を確認します。最後に、酢酸リチウム形質転換を使用して、新しいレポータープラスミドをA TF含有E株に変換します。まず、ウラシルを欠く合成完全培地の5ミリリットルに一晩でひずみを含むTFプラスレポーターを育てます。

250ミリリットルを9 250ミリリットル入手し、フラスコを振って、それぞれにSCマイナスURAを25ミリリットル加えます。次に、テキストプロトコルに記載されているように、βエストラジオールの異なる希釈率で7つのフラスコを調製し、125マイクロリットルのオーバーナイト培養で25ミリモルのβエストラジオールストックの10倍の連続希釈から、残りの2つのフラスコにこれらの7つのフラスコを接種し、構成的なGFP産生株とGFPを欠く株を接種します。これらは、フローサイトメーターのキャリブレーションに必要です。

フラスコを200RPMと摂氏30度で12〜18時間振ってください。次に、各培養物の500マイクロリットルを取り出し、別々の1.7ミリリットルのeinorチューブでスピンダウンします。上清を吸引した後、ペレット化した細胞をフローサイトメトリーバッファーで一度すすぎ、次に同じバッファーの1ミリリットルに細胞を再懸濁します。

次に、1ミリリットルのフローサイトメトリーバッファーを9個のfalcon 2に加えます。再懸濁した細胞をファルコンチューブを含むバッファーに加えて、最終容量が2ミリリットルに等しくなります。最後に、フローサイトメトリーを行います。

前方散乱法と側方散乱法を使用して、酵母細胞を同定します。流量を毎秒約3000セルに設定します。50チャネルを通じてGFPを測定し、凍結ストックからテキストプロトコルのように進行し、A TFを含む菌株とA TFを欠くひずみの両方をYPDにストリークアウトします 成長の2日後、YPD液の5ミリリットルを含む別々の培養チューブを接種し、摂氏30度で各菌株を一晩成長させます。

0.25ミリモルベータエストラジオールストック溶液の10倍連続希釈を最大10, 000まで行い、100%エタノールで折ります。各一晩培養物の40マイクロリットルを10ミリリットルのYPD液体に加えます。各株について、希釈した細胞の96マイクロリットルを96ウェルプレートの18ウェルに加えます。

次に、4マイクロリットルのベータエストラジオールを細胞に加えます。重要なポイントは、各ウェルに同じ量の総エタノールがあることを確認することです。各菌株のウェルのうち3つがエタノールのみであるトリプリケートを実行します。

コントロールは、96ウェルプレートをガス透過性膜で覆います。プレートリーダーで600ナノメートルの光学密度で成長を監視します。最大傾斜角を見つけるなど、任意の数の方法を使用して成長率を定量化します。

テキストプロトコルPCRの指示に従ってプラスミドを調製した後、缶MXプロモーターカセットを増幅します。酢酸リチウム法プレートを使用してPCR産物をA TF発現株に変換し、細胞をYPDに、レプリカプレートをYPDに、翌日G418抗生物質にレプリカプレートを変換します。最後に、フォワードプライマーとプロモーターが置換された遺伝子の内部にあるリバースプライマーを使用して、プロモーターの適切な挿入を確認します。

最終PCR産物は約1.2KBで、ここに示されているのは、1マイクロモルベータエストラジオールに応答した3つの異なるTFプロモーターペアZ、4、EVZ、3EV、またはGEVによるGFPの誘導です。非酵母DNA結合ドメインを含むATFに応答してGFP産生が増加することに注意してください。これは、これらの因子が酵母ゲノムにおいて単一遺伝子特異性を達成したことに起因する可能性があります。

GEV誘導だけでは数百の遺伝子の活性化または抑制につながりますが、Z three EVおよびZ four EVは、適切な結合部位を含む合成プロモーターの下流に配置された標的遺伝子の発現のみを活性化します。ここでは、ゼロナノモルβエストラジオールに応答したZ three EVによるGFPの誘導、および18時間の誘導後の1マイクロモルβエストラジオールによるGFPの誘導も示され、GFPを欠く細胞からも蛍光が測定され、Z three EVシステムの厳密な調節が説明された。Z three EVがさまざまなベータエストラジオール濃度にわたってGFPを誘導する能力をここに示しています。

分布の平均蛍光は、誘導剤濃度と発現出力との間の関係が、Zの3つのEVの独立した結合を示す約1のヒル係数で等級付けされることを明らかにしていますこの手順に続いて、遺伝子発現マイクロアレイのような他の方法を実行して、単一の遺伝子の発現を変更することが遺伝子発現のゲノムワインパターンにどのように影響するかなどの追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、人工転写因子の有効性を設計、テスト、検証する方法を十分に理解できるはずです。これらの人工転写因子は、適切なDNA標的配列の下流に配置された遺伝子の発現を条件付きで制御します。