迅速な合成およびGFPベースの記者との化学的に活性化する転写因子のスクリーニング

この手順の全体的な目的は、所望の特異性を持つ、遺伝的にコードされた誘導性人工転写因子（ATF）を作成し、試験および検証することである。これはまず、単純な酵母形質転換によってATFを作成することで達成される。この際、DNA結合領域のPCR産物を組み込むことで、ヒトエストロゲン受容体およびVP16とのインフレーム融合体が得られる。本手順の第2ステップは、プラスミドPMN 8の結合部位をTF標的配列に置換することにより、ATF用のGFPレポータープラスミドを作成することである。

手順の3番目のステップでは、ATFがGFPレポーターを活性化させる能力をアッセイすると同時に、増殖速度を測定して酵母の生理学的影響を評価します。手順の最終ステップでは、検証済みのTFを用いて、ネイティブなゲノム標的を条件付きで発現させます。最終的に、あらゆる目的の標的遺伝子を条件付きで活性化させることが可能です。

ガラクトース介在性の遺伝子発現誘導などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、多面的な影響を及ぼすことなく、多様な栄養条件および生理学的条件下で選択的な誘導が可能である点にあります。この手法により、目的の遺伝子産物を迅速かつ可逆的に導入できるため、機能獲得および機能喪失の両面から検討することができ、酵母生物学における重要な問いへの回答に寄与します。まず、高正確性ポリメラーゼを用いて、目的のDNA結合ドメイン（DBD）をPCR増幅します。

リチウムアセテート法を用いて、1 µg以上の精製済みPCR産物を酵母に形質導入します。形質導入後、マイクロ遠心分離機を用いて細胞を最高速度で15秒間遠心分離し、形質導入混合液を除去します。その後、細胞を約200 µLの滅菌水で再懸濁し、酵母エキス・ペプトン・ブドウ糖（YPD）培地に塗布します。翌日、YPD培地から5-フルオロオロチ酸プレートへレプリカプレートを作成します。

2～4日間培養後、少なくとも5～10個のコロニーをYPD培地に再塗抹します。次に、テキストプロトコルにあるプライマーを用いてコロニーPCRを行い、配列を確認してインサートが含まれていることを検証します。目的の結合領域のオリゴヌクレオチドを等モル濃度に希釈します。

T4ポリヌクレオチドキナーゼを用い、テキストプロトコルの反応条件に従って、neoサーモサイクラーで結合領域をリン酸化します。次に、約1〜2 µgのPMN 8をNot IおよびXho Iで37 °Cで1時間消化します。

バックボーンのバンドを精製し、精製したバックボーンを10 nanograms/µLに希釈します。次に、二本鎖のリン酸化結合部位を、バックボーンの5倍のモル濃度（per µL）に希釈します。T4 DNA Ligaseを用いて、室温で30分間、消化したバックボーンに結合部位をライゲーションします。

ライゲーション反応液の半分を50 µLの標準的な化学的コンピテントE. coli細胞に加え、テキストプロトコルに記載された手順に従って形質転換を行います。細胞を回復させた後、Luria BertiまたはLB+アンピシリンプレート1枚あたり100〜200 µLの細胞を播種し、一晩インキュベートします。翌日、LB+アンピシリン液体培地でE. coliを増殖させ、テキストプロトコルに記載の方法でプラスミドDNAを回収します。

次に、ライゲーション後のコロニーから新しいレポータープラスミドを回収し、配列確認を行います。最後に、酢酸リチウム法を用いて、この新しいレポータープラスミドをTF含有E株に形質転換します。まず、TFとレポーターを含む菌株を、ウラシル欠損合成完全培地 5 mLで一晩培養します。

250 mLの三角フラスコを9個用意し、それぞれにSC-URA培地を25 mLずつ加えます。次に、25 mMのβ-estradiolストック溶液を10倍段階希釈し、テキストプロトコルに記載されている異なる希釈濃度のβ-estradiolを7個のフラスコにそれぞれ調製します。ここに、オーバーナイト培養液を125 µLずつ添加します。残りの2個のフラスコには、GFPを恒常的に発現している株と、GFPを欠損している株をそれぞれ接種します。これらはフローサイトメーターの校正に使用します。

フラスコを200 RPM、30 °Cで12〜18時間振盪させます。次に、各培養液から500 µLを分取し、個別の1.7 mLエッペンドルフチューブで遠心分離します。上清を吸引した後、ペレット化した細胞をフローサイトメトリー用バッファーで1回洗浄し、その後、同バッファー1 mLで細胞を再懸濁します。

次に、9本のファルコンチューブにフローサイトメトリー用バッファーを1 mLずつ加えます。再懸濁した細胞を、バッファーが入ったファルコンチューブに加え、最終容量を2 mLにします。最後に、フローサイトメトリーを実施します。

前方散乱光（forward scatter）と側方散乱光（side scatter）を用いて酵母細胞を同定します。流速を毎秒約3000細胞に設定します。チャンネル50でGFPを測定し、凍結保存ストックからのテキストプロトコルに従って、A TF保持株とA TF欠損株の両方をYPDプレートにストリークします。2日間の培養後、5 mLのYPD液体培地を含む個別の培養チューブに接種し、各菌株を30 °Cで一晩培養します。

0.25 millimolarのβ-エストラジオールストック溶液を100%エタノールを用いて10,000倍まで10倍段階希釈します。各オーバーナイト培養液40 µLを10 mLのYPD液体培地に加えます。各株について、希釈した細胞96 µLを96ウェルプレートの18ウェルに分注します。

次に、細胞に4 µLのβ-エストラジオールを加えます。重要な点は、各ウェルの全エタノール量が同一であることを確認することです。各株につき3つのウェルを用いて、エタノールのみを加えるトリプリケート（3連系）試験を行います。

コントロール群では、96ウェルプレートをガス透過性膜で覆います。プレートリーダーを用いて、600 nmの吸光度で増殖をモニタリングしてください。最大傾斜法のなど、任意の数手の手法を用いて増殖速度を定量します。

テキストプロトコルPCRに従ってプラスミドを調製した後、can MX プロモーターカセットを増幅させます。リチウムアセテート法を用いてPCR産物をA TF発現株に形質転換し、形質転換細胞をYPD培地にプレートし、翌日にYPDにG418抗生物質を加えた培地へレプリカプレートします。最後に、フォワードプライマーおよびプロモーターを置換した遺伝子の内部にあるリバースプライマーを用いて、プロモーターが適切に挿入されているかを確認します。

最終的なPCR産物は約1.2 KBです。ここでは、1 µMのβ-estradiolに対する応答として、3つの異なるa TFプロモーターペア（Z4 EV、Z3 EV、またはGEV）によるGFPの誘導を時間経過とともに示しています。酵母以外のDNA結合ドメインを含むATFに応答して、GFPの産生量が増加していることに注目してください。これは、これらの因子が酵母ゲノムにおいて単一遺伝子特異性を達成した結果であると考えられます。

GEVの誘導のみで数百の遺伝子の活性化または抑制が起こるのに対し、Z three EVおよびZ four EVは、適切な結合部位を含む合成プロモーターの下流に配置された標的遺伝子の発現のみを活性化します。ここでは、0 nMのβ-estradiolおよび18時間の誘導後の1 µMのβ-estradiolに対するZ three EVによるGFPの誘導が示されています。また、Z three EVシステムの厳密な制御を実証するために、GFPを欠損した細胞からも蛍光を測定しました。ここでは、さまざまなβ-estradiol濃度においてZ three EVがGFPを誘導できる能力が示されています。

分布の平均蛍光強度から、誘導剤濃度と発現出力の関係は段階的であり、ヒル係数が約1であることから、Z three EVの結合が独立していることが示唆されます。本手順の後、単一の遺伝子の発現変化がゲノム全体の遺伝子発現パターンにどのように影響するかといった追加の問いに答えるために、遺伝子発現マイクロアレイなどの他の手法を実施することが可能です。このビデオを視聴することで、人工転写因子の設計、試験、および有効性の検証方法について十分に理解できるはずです。これらの人工転写因子は、適切なDNA標的配列の下流に配置された遺伝子の発現を条件付きで制御します。