Name: 慢性EAEを有するマウスにおける神経幹/前駆細胞の全身注射 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-15T18:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学ぶ神経幹/前駆細胞の全身静脈注射法。EAEマウスモデルを用いて、低侵襲的な幹細胞移植によるCNSへの細胞送達と生存・統合の評価方法を解説。再生医療研究に有用です。

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著者は、批判的に原稿を編集して再検討し、証明にジェイデン·スミスに感謝します。この作品は、国立多発性硬化症協会（NMSS、部分的な補助金RG-4001-A1）から支持を受けて、イタリアの多発性硬化症協会（AISMは、2010/R/31を付与）、イタリア保健省（GR08-7）、ライフ、バンカアグリコラPOPOLAREディラグーザ（BAPR）、欧州研​​究会議（ERC）ERC-2010-STGグラント契約の下では260511-SEM_SEMと欧州共同体（EC）第7次フレームワークプログラム（FP7/2007-2013）のための翼グラント契約書N *度の下で; 280772 - ジオン。

<ol><li>Ben-Hur, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+multipotential+neural+precursor+cells+migrate+into+the+inflamed+white+matter+in+response+to+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Transplanted multipotential neural precursor cells migrate into the inflamed white matter in response to experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Glia. 41, 73-80 (2003).</li>
<li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+adult+neurospheres+induces+recovery+in+a+chronic+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis.</a> Nature. 422, 688-694 (2003).</li>
<li>Chu, K., Kim, M., Jeong, S. W., Kim, S. U., Yoon, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+stem+cells+can+migrate%2C+differentiate%2C+and+integrate+after+intravenous+transplantation+in+adult+rats+with+transient+forebrain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Human neural stem cells can migrate, differentiate, and integrate after intravenous transplantation in adult rats with transient forebrain ischemia.</a> Neurosci. Lett. 343, 129-133 (2003).</li>
<li>Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability-dependent+promoting+action+of+adult+neural+precursors+in+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury.</a> Mol. Med. 14, 634-644 (2008).</li>
<li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosphere-derived+multipotent+precursors+promote+neuroprotection+by+an+immunomodulatory+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurosphere-derived multipotent precursors promote neuroprotection by an immunomodulatory mechanism.</a> Nature. 436, 266-271 (2005).</li>
<li>Einstein, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraventricular+transplantation+of+neural+precursor+cell+spheres+attenuates+acute+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intraventricular transplantation of neural precursor cell spheres attenuates acute experimental allergic encephalomyelitis.</a> Mol. Cell Neurosci. 24, 1074-1082 (2003).</li>
<li>Chu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+stem+cell+transplantation+reduces+spontaneous+recurrent+seizures+following+pilocarpine-induced+status+epilepticus+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Human neural stem cell transplantation reduces spontaneous recurrent seizures following pilocarpine-induced status epilepticus in adult rats.</a> Brain Res. 1023, 213-221 (2004).</li>
<li>Jeong, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+stem+cell+transplantation+promotes+functional+recovery+in+rats+with+experimental+intracerebral+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Human neural stem cell transplantation promotes functional recovery in rats with experimental intracerebral hemorrhage.</a> Stroke. 34, 2258-2263 (2003).</li>
<li>Aboody, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+display+extensive+tropism+for+pathology+in+adult+brain%3A+evidence+from+intracranial+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain: evidence from intracranial gliomas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12846-12851 (2000).</li>
<li>Muller, F. J., Snyder, E. Y., Loring, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy%3A+can+neural+stem+cells+deliver%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gene therapy: can neural stem cells deliver.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 75-84 (2006).</li>
<li>Martino, G., Pluchino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of neural stem cells.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 395-406 (2006).</li>
<li>Deckert-Schluter, M., Schluter, D., Hof, H., Wiestler, O. D., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+ICAM-1%2C+VCAM-1+and+their+ligands+LFA-1%2C+Mac-1%2C+CD43%2C+VLA-4%2C+and+MHC+class+II+antigens+in+murine+Toxoplasma+encephalitis%3A+a+light+microscopic+and+ultrastructural+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of ICAM-1, VCAM-1 and their ligands LFA-1, Mac-1, CD43, VLA-4, and MHC class II antigens in murine Toxoplasma encephalitis: a light microscopic and ultrastructural immunohistochemical study.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 457-468 (1994).</li>
<li>Hemmer, B., Archelos, J. J., Hartung, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+in+the+immunopathogenesis+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">New concepts in the immunopathogenesis of multiple sclerosis.</a> Nat. Rev. Neurosci. 3, 291-301 (2002).</li>
<li>Butcher, E. C., Picker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+homing+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte homing and homeostasis.</a> Science. 272, 60-66 (1996).</li>
<li>Rampon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+systemic+delivery+of+neural+precursor+cells+to+the+brain%3A+assembly+of+brain+endothelial+apical+cups+and+control+of+transmigration+by+CD44%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of systemic delivery of neural precursor cells to the brain: assembly of brain endothelial apical cups and control of transmigration by CD44.</a> Stem Cells. 26, 1673-1682 (2008).</li>
<li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+stem+cells+ameliorate+autoimmune+encephalomyelitis+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Human neural stem cells ameliorate autoimmune encephalomyelitis in non-human primates.</a> Ann. Neurol. 66, 343-354 (2009).</li>
<li>Martino, G., Pluchino, S., Bonfanti, L., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+regeneration+in+physiology+and+pathology%3A+the+immune+signature+driving+therapeutic+plasticity+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Brain regeneration in physiology and pathology: the immune signature driving therapeutic plasticity of neural stem cells.</a> Physiol. Rev. 91, 1281-1304 (2011).</li>
<li>Aharonowiz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effect+of+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursors+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursors in an animal model of multiple sclerosis.</a> PLoS ONE. 3, e3145(2008).</li>
<li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+regulatory+neural+stem%2Fprecursor+cells+protect+from+central+nervous+system+autoimmunity+by+restraining+dendritic+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Immune regulatory neural stem/precursor cells protect from central nervous system autoimmunity by restraining dendritic cell function.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Einstein, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+precursors+attenuate+autoimmune+encephalomyelitis+by+peripheral+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neural precursors attenuate autoimmune encephalomyelitis by peripheral immunosuppression.</a> Ann. Neurol. 61, 209-218 (2007).</li>
<li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotential+stem+cells+from+the+adult+mouse+brain+proliferate+and+self-renew+in+response+to+basic+fibroblast+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor.</a> J. Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).</li>
<li>Furlan, R., Pluchino, S., Marconi, P. C., Martino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+gene+delivery+into+the+central+nervous+system+using+intrathecally+injected+nonreplicative+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine gene delivery into the central nervous system using intrathecally injected nonreplicative viral vectors.</a> Methods Mol. Biol. 215, 279-289 (2003).</li>
<li>Constantin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+analysis+of+adhesive+events+in+brain+microvessels+by+using+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization and analysis of adhesive events in brain microvessels by using intravital microscopy.</a> Methods Mol. Biol. 239, 189-198 (2004).</li>
<li>Politi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic-resonance-based+tracking+and+quantification+of+intravenously+injected+neural+stem+cell+accumulation+in+the+brains+of+mice+with+experimental+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Magnetic-resonance-based tracking and quantification of intravenously injected neural stem cell accumulation in the brains of mice with experimental multiple sclerosis.</a> Stem Cells. 25, 2583-2592 (2007).</li>
<li>Melzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-graft+of+allogeneic+immune+regulatory+neural+stem+cells+%28NPC%29+and+pancreatic+islets+mediates+tolerance%2C+while+inducing+NPC-derived+tumors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Co-graft of allogeneic immune regulatory neural stem cells (NPC) and pancreatic islets mediates tolerance, while inducing NPC-derived tumors in mice.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Amariglio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-derived+brain+tumor+following+neural+stem+cell+transplantation+in+an+ataxia+telangiectasia+patient%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient.</a> PLoS Med. 6, (2009).</li>
<li>Ben-Hur, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+proinflammatory+cytokines+on+the+growth%2C+fate%2C+and+motility+of+multipotential+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Effects of proinflammatory cytokines on the growth, fate, and motility of multipotential neural precursor cells.</a> Mol. Cell Neurosci. 24, 623-631 (2003).</li>
<li>Giusto, E., Donega, M., Cossetti, C., Pluchino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuro-immune+interactions+of+neural+stem+cell+transplants%3A+From+animal+disease+models+to+human+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuro-immune interactions of neural stem cell transplants: From animal disease models to human trials.</a> Exp. Neurol. , (2013).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

体性幹細胞に基づく治療は、例えば、MS2 11などの慢性炎症性CNS障害を治療するための最も有望な戦略の一つとして浮上している。その治療効果を維持するメカニズムはまだ完全に解明される必要があるが、神経変性疾患の様々な実験モデルにおいて、NPC移植の重大な影響は、細胞がすぐにヒトでの研究にも適用することができる幹やや挑発的な信念に上昇を与えている。しかし、我々はいくつかの重要な問題に直面し、そのような（多能VS同種、多能VS自家）移植のための理想的な幹細胞源の特定と最適なルートなど、いくつかの未回答の質問を、対処する必要があるような、革新的な治療法の潜在的なヒトへの適用を想定し前投与方法。 神経変性疾患は、いくつかの空間的にEG（閉じ込められた状態で、その病態生理が異なります。脊髄を陪審、脳卒中）、他方は空間的、時間的普及（ 例えば 、MS）を特徴とされながら。それは、脳損傷の複数の部位の存在を克服するために追加のチャレンジを表し、後者は不十分なまたは単に不可能かもしれないが（幹）細胞の焦点...

強力な証拠は、CNS障害1-8の動物モデルにおける体性神経幹/前駆細胞（NPCの）移植の治療効果を証明するインビボ研究から生じた。これらの実験結果は臨床応用に変換することができる前に、それにもかかわらず、宿主への幹細胞の送達に関連する問題の数は、慎重な検討が必要です。多病巣性、慢性炎症性脳疾患のための（非造血系）回復幹細胞治療の開発に向け、特に、実質的なハードルは、NPCの注射の理想的なルートの同定である。対象となる疾患の病態生理をしっかり理解（限局性または多病巣性、原発性または原発性変性）、および配信技術に関連する実現可能性とリスクの問題の慎重な分析は、幹細胞送達に最適なプロトコルを識別している。 （焦点間<em&gt;例えば。神経系の実質に）幹細胞移植損傷の空間的に閉じ込められた領域によって特徴付けられるCNS疾患の治療への論理的アプローチである（ 例えば、パーキンソン病およびハンチントン病、脳および脊髄外傷、および脳卒中）、非常に同じアプローチを証明することができるこのような多病巣性、慢性、および空間的に播種性CNS損傷が時間をかけて蓄積し、MS、などの条件に実質的に実行不可能であると。この後者の場合、個々の病変に焦点細胞注入を標的はまた、このように低侵襲NPCの移植に標的CNSの他の、より適切な方法の識別を促す、CNS実質内長距離にわたって移行する移植されたNPCの限られた能力によって妨げられる。 大きな期待はCNS9外に血管内に注入された場合のNPCは、マウスにおける頭蓋内腫瘍（ 例えば神経膠腫）を標的観測から明らかになった。この独創的な次の幹細胞pathotrophism 10のin vivoでの証拠に 、広範なデータは、静脈内のいずれかを介して 、炎症性CNS損傷のモデルとして、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）と実験動物における実現可能性とのNPCの全身移植の治療効果に関する蓄積されてきた（IV）または脳室内（ICV）のNPC注入1,2,5,6,8···私たちは、まず、これはターゲットと入力し、炎症を起こしたCNSに、その後、複数の細胞間に係合するように移植したNPCの能力に依存していることが示されている生体 11 内の特定の微小環境内で通信プログラム。特に中枢神経系を標的とするために、NPCは脳脊髄液（CSF）ICV注射による循環、または静脈内注射を介して血流への直接配信されます。一度血流またはCSFのいずれかを入力し、移植されたNPCは積極的に相互作用血液脳（BBB）または血液脳脊髄液（BCSFB）障壁とCNS実質を入力してください。 NPCグラフト及びBBB（又はBCSFB）との間のこの相互作用は、NPC表面の細胞接着分子（CAM）の特定のセットにより調節および活性化内皮/上衣細胞12-14上のCAMカウンターリガンドの高レベルの発現によって促進される。これらのCAMの例としては、ヒアルロン酸の受容体であるCD44、および細胞間接着分子（ICAM）-1のリガンドは非常に遅い抗原（VLA）-4 5,15,16（つまり、白血球では、活性化上衣との相互作用の責任があるが含まれおよび内皮細胞）、およびはるかに低い程度のリンパ球機能関連抗原（LFA）-1およびP-セレクチン糖タンパク質リガンド（PSGL）-1。 NPCはまた、CCR1、CCR2、CCR5、CXCR3、およびCXCR4を含む、ケモカイン受容体の広範囲を発現する（しかし、CCR3およびCCR7を発現しない）、 インビトロおよびインビボの両方で 5,16、機能的に活性である。このように、systemicaLLYのNPCは、炎症を起こしたCNSのレベルで蓄積する、Gタンパク質共役受容体（GPCRは）とともに、これらのCAMを使用して注入した。逆に、NPCは、血管や脳脊髄液の空間ルート2 を介して中枢神経系を入力しない健康なマウスに全身的に注射。 CNS炎症、または化学的に誘発された脳炎のモデルとして、全身性サイトカインまたはlypopolisaccharide（LPS）の注射後に内皮/上衣細胞の活性化は、脳や脊髄の2に全身に注入されたNPCの蓄積が必要である。このようにして、全身のNPC療法とCNSの成功ターゲティングは、脳と脊髄環境が蓄積とのNPCの経内皮移動に資するである、機会（ウー）の病気特定のウィンドウの識別に依存している。このような条件は、一般的に、急性および亜急性炎症17のコンテキストで発生する。一度、未分化のNPCを移植し、中枢神経系に入ったマウスの臨床病理学的な特徴だけでなく、EAEを持つ大規模、ヒト以外の霊長類を改善することが示されている。これはに応じて最小限の細胞置換2および非CNS炎症を起こした領域19,20（ 例えばリンパ節）VS血管周囲のCNS ​​2,5,6,18内の免疫調節および神経保護パラクリン因子の分泌が顕著で依存していることが記載されている炎症細胞シグナル伝達は、免疫細胞の浸潤を5により誘発される。 ここに我々は、慢性EAEのマウスモデルに、体のNPCの全身注射の主要な方法論の側面を説明します。具体的には、我々は我々が（i）に設置していたプロトコルを展開し、派生して、大人のC57BL / 6マウスの脳室下帯（SVZ）からの移植体細胞のNPCの準備を定義します。 （ii）は、マウスの慢性EAEを誘導し、（iii）の（ 静脈内または脳室内投与 ）治療的に有効な全身を行うNPC移植iをNTO EAEマウス。

<table><tbody><tr><td>細胞培養</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Sigma</td><td>E2888</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>30H11965</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>D/0700/50</td><td></td></tr><tr><td>Mouse NeuroCult basal medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05700</td><td></td></tr><tr><td>NeuroCult 増殖サプリメント</td><td>幹細胞技術</td><td>05701</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>シグマ</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>基本的な線維芽細胞成長因子</td><td>Peprotech</td><td>100-18B-1000</td><td></td></tr><tr><td>上皮成長因子</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>1514012</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル(コーティング液)</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>NeuroCult&reg;分化キット (マウス)</td><td>幹細胞技術</td><td>05704</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>eBioscience</td><td>00-4666-56</td><td></td></tr><tr><td>CaおよびMgなしのダルベッコのPBS(DPBS)(10x)</td><td>PAAラボラトリーズ</td><td>H15-011</td><td></td></tr><tr><td>マイコトレース</td><td>PAAラボラトリーズ</td><td>Q052-020</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>シグマ</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>免疫蛍光</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>PAAラボラトリーズ</td><td>B11-035</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール p-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)-フェニルエーテル</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗ネスチン</td><td>Abcam</td><td>ab11306</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗GFAP</td><td>ダコ</td><td>203344</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗ヒストンH3(リン酸化S10)&nbsp;</td><td>アブカム</td><td>ab14955</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ 抗 MAP-2</td><td>アブカム</td><td>ab32454</td><td></td></tr><tr><td>ラット 抗 MBP</td><td>AbD セロテック</td><td>MCA409S</td><td></td></tr><tr><td>抗 O4 抗体 クローン 81 |MAB345</td><td>ミリポア</td><td>MAB345</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>実装液</td><td>ダコ</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>EAE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フロイントのアジュバント 不完全</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>F5506</td><td></td></tr><tr><td>結核菌</td><td>DIFCO</td><td>H37Ra</td><td></td></tr><tr><td>モグ(35&ndash;55)&nbsp;</td><td>Espikem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>百日咳毒素</td><td>リスト 生物学研究所</td><td>181</td><td></td></tr><tr><td>Tissue processing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iris はさみストレート</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>鈍い/曲がった鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11080-02</td><td></td></tr><tr><td>脳スライサー</td><td>Zivic 機器</td><td>BSMAS005-1</td><td></td></tr><tr><td>外科用ブレード</td><td>スワン・モートン</td><td>324</td><td></td></tr><tr><td>P200、P1000 ピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ケタミン (Vetalar)</td> <td>ベーリンガーインゲルハイム</td><td>01LC0030</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン (ロンプン)</td><td>バイエル</td><td>32371</td><td></td></tr><tr><td>脳定位固定装置フレーム</td><td>KOPF</td><td>モデル 900</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトン シリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>7762-04</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr></tbody></table>

慢性eaeを有するマウスにおける神経幹/前駆細胞の全身注射

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

神経幹/前駆細胞（NPCの）は、再生神経の脳の修復や復元を目的とした移植のアプローチのための有望な幹細胞源である。このディレクティブは、脳の修復が神経疾患のいくつかの前臨床モデルでの焦点または全身NPC移植後に達成されていることを豊富な証拠から生じている。 これらの実験データは、緊急の評価を必要とする脳疾患のための修復、幹細胞治療の主なハードルの一つとして細胞送達経路を同定した。実質内の幹細胞移植は、例えば、脊髄損傷およびパーキンソン病のような単離され、アクセス可能な脳の病変によって特徴付けられる病状の論理的なアプローチを表す。残念ながら、この原理は、多発性硬化症（MS）を含む、不十分、多焦点を特徴とする状態に適用炎症性および散在性（時間的にも空間の）性質である。このように、脳はシステム経験による標的EMIC NPC送達は、脳および中枢神経系（CNS）の実験的慢性炎症性損傷の影響を受け齧歯類およびヒト以外の霊長類の脊髄に細胞を送達するための低侵襲性治療上有効なプロトコルとなっている。 細胞送達のこの代替方法は、（i）に特異的にそれらの生得的な能力、NPCのpathotropismに依存している機能的な細胞接着分子および炎症性サイトカインおよびケモカイン受容体を介して環境を感知し; （II）静脈後漏れるの解剖学的障壁交差または脳室内（ICV）注射（ 静脈 ）; （iii）の炎症性の脳および脊髄損傷の複数の血管周囲部位（単数または複数）のレベルで蓄積する。および（iv）インビボで異なる宿主標的細胞上に顕著な組織栄養および免疫調節効果を発揮する。 ここでは、我々はIVのために開発した方法が記載されている。と&lt;EM慢性CNS炎症性脱髄のモデルとして実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）マウスにおける同系のNPC&gt; ICV配信、および再生神経学における炎症を起こした脳の選択的標的化のための貴重な技術のような全身性幹細胞送達を想定。

NPCの派生と特性評価 SVZ解剖は、機械的および酵素的解離（ 図1A）によって6〜8週齢のC57Bl / 6マウスのた（n = 5-7マウス/プール）のプール上で行われる。 CGMにおける培養の数日後、自由に浮遊ニューロスフェアは、（ 図1Aおよび1B）を形成し始める。主な球を回収し、機械的に、すべての4-5 DIVを継代する。継代時には、生細胞および死細胞の数を把握し、累積細胞数は、成長曲線（ 図1C）を生成するためにプロットされる。これによりNPC製剤のグローバルな安定性を評価するための間接的なパラメータを提供し、伝播速度の指標を与える。および未分化神経細胞（ 例えばネスチン）（ 図2A）、ニューロスフェアとして増殖している場合には、NPCは分裂活性のマーカー（5μg/ mlのリン酸化ヒストンH3、PHH3）を発現する。治療的にEであるとされ、未分化のNPC移植後のEAEにおけるfficacious...

神経幹/前駆細胞（NPCの）の移植は、再生神経学に大きな約束を保持している。のNPCの全身送達は、脳および中枢神経系の実験的慢性炎症性損傷の影響を受け齧歯類およびヒト以外の霊長類の脊髄に幹細胞を提供するために効果的な、侵襲的な低、かつ治療に非常に効果的なプロトコルになっています。

慢性EAEを有するマウスにおける神経幹/前駆細胞の全身注射

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

このプロトコルの全体的な目的は、多発性硬化症の疾患モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎を発症したマウスに対し、静脈内注射を介して中枢神経系（CNS）に神経幹前駆細胞を届けることです。これは、まず成マウスの脳室下帯から神経幹前駆細胞（NPC）を誘導することによって達成されます。次のステップとして、in vivoでの細胞同定および追跡のため、ウイルスベクター技術を用いてNPCに遺伝的にタグを付けます。次に、増殖したニューロスフィアを単一細胞懸濁液に解離させ、目的の密度で再懸濁し、疾患のピークにあるEAEマウスの尾静脈に注入します。最終的に、死後の器官および組織の病理学的検査および免疫組織化学染色を行い、注入された幹細胞の生存分布と統合を同定および特性評価します。この手法の主な利点は、炎症を起こした神経系に幹細胞および前駆細胞を移植するための、低侵襲で安全かつ効果的な方法を提供することです。この手法は、神経系の炎症性疾患モデルにおいて、全身投与された幹細胞の安全性および有効性に関する3つの重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法を視覚的に実演することは、脳幹細胞の分離から多発性硬化症のマウスモデルへの全身投与に向けた準備に至るまでの重要な実験ステップを理解する上で、特に若手研究者にとって有用です。最初のステップは、解剖に必要なすべての溶液を揃えることです。適切な無菌操作を用いて行ってください。摘出したばかりの脳をブレインスライサーマトリックスに設置します。カミソリ刃2枚を用いて、脳の前極から2 mm（視索を除く）の位置で冠状断を作成し、さらにその切断部位から後方に3 mmの位置で再度切断します。脳スライスを清潔なシャーレに移し、解剖顕微鏡下で側脳室下帯組織を分離します。組織を細切した後、あらかじめ調製しろ過した消化液 30 milliliters に加えます。静かに振盪し、15分ごとに振盪しながら30分間インキュベートします。遠心分離後、上清を除去し、ペレットを 200 microliters の完全培地で再懸濁します。ピペッティングにより、培地またはCGMを加えます。まずP1000を使用し、次にP200ピペットを使用します。単一細胞懸濁液が得られたら、CGMで5 mLまで希釈し、新しいフラスコに移します。細胞をインキュベーターに入れ、5〜7日間かけてニューロスフィアを形成させます。準備が整ったら、懸濁液を15 mLチューブに回収し、遠心分離します。上清を除去し、ペレットを200 µLのCGMで再懸濁します。P 200ピペットチップを用いて100〜150回的にピペッティングし、ニューロスフィアを機械的に解離させます。CGMを加えて懸濁液を1mLにします。次に、懸濁液を正確に希釈します。適切な容量の検体を生存染色剤と混合し、ヘモサイトメーターに充填して細胞数を測定します。細胞を適切な濃度に再懸濁し、新しいフラスコに移します。in vivoにおける移植細胞の同定を容易にするため、これらの手順を4〜5日ごとに繰り返します。NPCの導入から72時間後に、レポーター遺伝子をコードするウイルスベクターをNPCに導入します。蛍光レポーター遺伝子の発現は、免疫蛍光染色またはフローサイトメトリーで確認できます。準備が整ったら、遠心分離によりGFP発現ニューロスフェアを回収し、上清を除去します。次に、細胞凝集塊解離溶液を200 µL加え、10分間インキュベートします。細胞を回収し、気泡が入らないように注意しながら、穏やかに再懸濁して単一細胞懸濁液を得ます。細胞の計数および希釈後、使用直前まで細胞懸濁液を氷上で保持します。ニューロスフィアの準備が整ったら、あらかじめCNSマウスモデルとして準備しておいたマウスを用意します。損傷処置は、疾患の発現がピークに達したときに行う必要があります。まず、マウスをウォーミングボックスに約10分間入れ、尾静脈を拡張させます。準備が整ったら、ウォーミングボックスからマウス1匹をマウス拘束具に移します。拘束具を閉じて動きを制限し、尾を固定します。適切な局所用溶液を用いて、尾の注射部位を滅菌させます。1 mL インスリン用注射器に 150 µL の細胞懸濁液を充填し、気泡が完全に取り除かれていることを確認します。尾の背面に沿って静脈を確認し、尾の中下部の静脈と平行になるように針を配置します。ここでは静脈が皮膚表面に近いため、処置が容易になります。針を静脈にゆっくりと挿入し、少量の血液を吸引して、針が正しく配置されていることを確認します。その後、溶液を尾静脈にゆっくりと注射します。注射後、針を抜き、数秒間圧迫して止血します。マウスを新しいケージに入れ、回復するまで観察してください。あらかじめ定めた実験上のタイムポイントで、すべてのマウスに対して同様の手順を繰り返します。処理群および対照群の動物からサンプルを回収し、CNSおよびその他の組織へのNPCの浸潤と統合を解析します。ニューロスフィアとして増殖しているとき、NPCは、緑色で示されるphospho histone H3などの有糸分裂活性のマーカーや、赤色で示されるnestinなどの未分化神経細胞のマーカーを発現します。適切な分化条件下で播種すると、NPCは、アストログリアマーカーのGFAP、ニューロンマーカーのmicrotubule-associated protein 2、およびオリゴデンドログリアマーカーのO4およびmyelin basic proteinなど、3つの神経系譜に特有のマーカーを発現します。核はDAPIで対比染色します。移植後に治療効果を発揮するために必要な未分化NPCは、CD44およびvery late antigen 4のα4サブユニットを含む細胞表面接着分子を発現している必要があります。これらの例は、導入されたNPCが、増殖中のニューロスフィアとして、および成長因子除去後にin vitroで分化する際の両方でGFPを発現していることを示しています。EAEマウスに全身投与された同系NPCは、移植後最大45日まで、脳および脊髄の両方において、矢印で示されるCNS損傷部位の血管周囲領域にほぼ排他的に見出されます。この手順の重要なステップは細胞の解離です。実際、単一細胞懸濁液の調製は、後の血管閉塞につながる可能性のある凝集塊や凝集を防ぐために不可欠です。この技術は、小型実験動物の脳内への非周期的な幹細胞の効率的な導入に向けた低侵襲プロトコルを探索していた再生医療の研究者にとって、そして将来的には炎症性神経疾患を患う人間への応用に向けて、道を切り拓くものとなりました。このビデオを視聴することで、脳疾患モデルの実験動物における組織特異的幹細胞の分離、調製、および全身投与に関連するトラブルシューティングについて、明確な理解を深めていただければと思います。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

特定のマウス系統では、ミエリン塩基性タンパク質で実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）の誘導に抵抗することができます。ここで説明するには、無反応を逆にし、いくつかの典型的なEAE耐性マウスの汚れに麻痺性疾患を引き起こす単純な予防接種プロトコルです。...

移入、抗原チャレンジにより実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）抵抗性マウス系統の応答がないことを克服する

このビデオは、ミエリン由来のペプチドにアジュバントを注入して自己反応性T細胞を活性化し、脳に移動することにより、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発する方法を示しています。百日咳毒素は、血液脳関門の透過性を高めるために投与され、これらのT細胞や他の免疫細胞が脳に入ることを可能にします。これらの免疫細胞は脱髄を引き起こし、神経伝達の障害とEAEの発症につながります。...

マウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の生成

このビデオでは、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を使用して多発性硬化症のマウスモデルを確立しています。マウスにニューロンペプチドとアジュバントを含むエマルジョンを注入すると、自己反応性T細胞を活性化する免疫応答が引き起こされます。これに続いて、百日咳毒素(PTX)を注射して血液脳関門の透過性を高め、自己反応性T細胞が脳に浸潤できるようにします。この浸潤は、最終的にミエリン損傷をもたらすシグナル伝達カスケードを開始し、多発性硬化症の脱髄状態を模倣しています。...

マウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

実験的自己免疫性脳脊髄炎を研究するために、成体マウスの露出した脊髄にガラス窓を埋め込み、維持する方法を説明します。これらのウィンドウは、2光子顕微鏡を使用して生きた動物の細胞内レベルで細胞動態を監視するための脊髄への慢性的な光学アクセスを提供します。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎の成体マウスにおけるガラス脊髄窓の埋め込み

実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、多発性硬化症の確立された動物モデルである。 C57BL / 6マウスは、中枢神経系における自己反応性免疫細胞によって引き起こさ昇順弛緩性麻痺をもたらす、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）ペプチド35-55（MOG 35-55）で免疫する。疾患の誘導およびモニタリングのためのプロトコルを説明する。...

ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG<sub&gt; 35〜55</sub&gt;）C57BL / 6マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）誘発

この原稿は、実験的な自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルの誘導と採点の方法、およびさまざまな疾患段階におけるフローサイトメトリーと定量的PCRをそれぞれ使用して、リンパ節、脾臓、血液、脊髄の免疫細胞分布とmRNAサイトカインレベルの評価を説明しています。...

マウスおよび種々の組織における免疫細胞の疾患に依存する分布の評価における実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

我々は、in vivoでのライブ生物発光およびSJL / Jマウスにおける多発性硬化症の実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルにおける視神経炎や脳炎の近赤外イメージングのための技術を示します。...

マウスにおける多発性硬化症のEAEモデルにおける視神経炎と脳炎症の生物発光と近赤外イメージング

生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の障害を調査するためのプロトコルを紹介します。具体的にはグリア limitans...

生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の内皮細胞およびグリアの障壁の障害の可視化

本プロトコルは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質を使用し、臨床スコアリングシステムを使用して疾患プロセスをモニタリングするマウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘発を記載しています。実験的自己免疫性脳脊髄炎関連症状は、マウス大腿骨マイクロコンピューター断層撮影分析とオープンフィールドテストを使用して分析され、疾患プロセスを包括的に評価します。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導と多様な評価指標

これまでのところ、すべての主要な中枢神経系常在細胞タイプを同じマウスから同時に単離するためのプロトコルは、満たされていない需要です。プロトコルはneuroinflammationの間に複雑な細胞ネットワークを調査し、同時に必須のマウス数を減らすために素朴で、実験的な自己免疫の脳脊髄炎のマウスで適当なプロシージャを示す。...

成体自己免疫性脳脊髄炎マウスからの主要な中枢神経系常在細胞型の同時単離

実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、多発性硬化症の動物モデルとして機能します。この記事では、EAEにおける脊髄の炎症、脱髄、および軸索損傷をスコアリングするためのアプローチについて説明します。さらに、マウス血清中の可溶性ニューロフィラメント光レベルを定量化する方法が提示され、生きたマウスの軸索損傷の評価が容易になります。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系の炎症、脱髄、および軸索損傷のスコアリング

学ぶ神経幹/前駆細胞の全身静脈注射法。EAEマウスモデルを用いて、低侵襲的な幹細胞移植によるCNSへの細胞送達と生存・統合の評価方法を解説。再生医療研究に有用です。

慢性EAEを有するマウスにおける神経幹/前駆細胞の全身注射

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