慢性EAEを有するマウスにおける神経幹/前駆細胞の全身注射
April 15th, 2014
神経幹/前駆細胞（NPCの）の移植は、再生神経学に大きな約束を保持している。のNPCの全身送達は、脳および中枢神経系の実験的慢性炎症性損傷の影響を受け齧歯類およびヒト以外の霊長類の脊髄に幹細胞を提供するために効果的な、侵襲的な低、かつ治療に非常に効果的なプロトコルになっています。
このプロトコルの全体的な目標は、実験的自己免疫性脳脊髄炎、多発性硬化症を模倣する疾患モデルに罹患したマウスの静脈内注射を介して神経幹前駆細胞をCNSに送達することです。これは、まず成体マウスの脳室内領域から神経幹前駆細胞(NPC)を誘導することによって達成されます。第2のステップは、ウイルスベクター技術を用いてNPCに遺伝的にタグを付け、in vivo細胞の同定と追跡を行うことです。
次に、増殖するニューロスフェアを単一細胞懸濁液に解離し、所望の密度で再懸濁し、疾患のピーク時にEAEマウスの尾静脈に注入します。最終的には、注入された幹細胞の生存分布と統合を特定し、特徴付けるために、死後の臓器および組織の病理学および免疫組織化学が実施されます。この技術の主な利点は、幹細胞と前駆細胞を炎症神経系に移植するための低侵襲で安全かつ効果的な方法を提供することです。
この方法は、神経系の炎症性疾患のモデルにおける全身注射幹細胞の安全性と有効性に関連する3つの主要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、脳幹細胞の分離から多発性硬化症のマウスモデルにおける全身注射の準備までの重要な実験ステップの理解に役立つため、特に若い科学者にとって有用です。適切な滅菌技術を使用します。
新たに分離した脳を脳スライサーマトリックスに置きます。2つのカミソリの刃を使用して、脳の前極から2ミリメートルの冠状切片を作成します。これは、視軌跡と前のカットの3ミリメートル後部を除いてです。脳スライスを清潔なペトリ皿に置き、解剖顕微鏡で作業して脳室下ゾーン組織を分離します。
組織をミンチした後、それを30ミリリットルの以前に調製してろ過した消化液に加えます。穏やかに振って、15分ごとに振とうしながら30分間インキュベートします。遠心分離後、上清を取り除き、ペレットを200マイクロリットルの完全な成長に再懸濁します。
ピペッティングによるミディアムまたはCGM。最初はP 1000で、次にP 200ピペットで。単一細胞懸濁液に到達したら、CGMで5ミリリットルまで増やし、新しいフラスコに移します。
細胞をインキュベーターに入れ、ニューロスフェアを5〜7日間形成します。準備ができたら、懸濁液を15ミリリットルのチューブに集めて遠心分離します。上清を取り除き、口蓋を200マイクロリットルのCGMに再懸濁します。
ニューロスフェアをP 200ピペットチップに100〜150回通すことにより、機械的に解離します。サスペンションをCGMで1ミリリットルまで上げます。次に、懸濁液を正確に希釈します。
適切な量をバイタルステインと混合し、ヘモサイトメーターで細胞数を決定します。細胞を正しい濃度に再懸濁し、新しいフラスコに移します。これらの手順を4〜5日ごとに繰り返して、in vivoで移植された細胞を同定するのに役立ちます。
NPCは、NPC形質導入の72時間後にレポーター遺伝子をコードするウイルスベクターで形質導入されます。蛍光レポーター遺伝子の発現は、免疫蛍光法またはフローサイトメトリーのいずれかによって検証可能です。準備ができたら、遠心分離によりGFP発現ニューロスフェアを回収し、上清を除去します。
次に、200マイクロリットルの細胞凝集体解離溶液を加え、10分間インキュベートします。細胞を回収し、それらを穏やかに再懸濁して、単一細胞懸濁液を得る。気泡が出ないように注意してください。
細胞をカウントして希釈した後、使用する準備ができるまで細胞懸濁液を氷上に保ちます。ニューロスフェアの準備ができたら、CNSのマウスモデルとして機能するように以前に準備されたマウスを回収します。損傷治療は、疾患の発現のピーク時に行われるべきです。
まず、マウスをウォーミングボックスに約10分間入れて、尾静脈を拡張させます。準備ができたら、1匹のマウスをウォーミングボックスからマウス拘束装置に移します。拘束装置を閉じて動きを制限し、尾を分離します。
テールの注射領域を適切な局所溶液で滅菌します。1ミリリットルのインスリン注射器に150マイクロリットルの細胞懸濁液を入れ、すべての気泡を確実に取り除きます。静脈を尾の背側表面に位置させ、針を尾の中央下部の静脈と平行に配置します。
ここでは、静脈は皮膚の表面に近くなります。したがって、手順を容易にします。針を静脈にそっと挿入し、数マイクロリットルの血液を採取して正しい位置を確保します。
次に、溶液を尾静脈にゆっくりと注入します注射後、針を取り外し、数秒間圧力をかけて出血を遅らせます。マウスを新しいケージに入れ、回復するまで監視します。所定の実験時間におけるすべてのマウスについて、同じ手順を繰り返す。
サンプルは、処理された動物および対照動物から収集され、ニューロスフェアとして増殖するときのCNSおよび他の組織へのNPCの浸潤および統合を決定するために分析されますNPCは、緑色で示されるリン酸化ヒソンH 3などの有糸分裂活性のマーカーを発現し、適切な分化条件下でプレーティングすると赤で示される巣のような未分化神経細胞のマーカーを発現します。 NPCは、アストログリアマーカー、GFAP、ニューロンマーカー、微小管状関連タンパク質2、およびオリゴジルグリアマーカーO 4、およびミエリン塩基性タンパク質核などの3つの神経系統に典型的なマーカーを発現し、dpiで対比染色され、移植後に治療効果を発揮するはずの未分化MPCは、CD44および非常に遅い抗原4のα4サブユニットを含む細胞表面接着分子を発現しなければならない。これらの例は、形質導入されたNPCが、増殖するニューロスフェアとして、また成長因子の離脱時にin vitroで分化するときにGFPを発現することを示しています。EAEマウスに全身的に注射された同系NPCは、移植後45日までの脳と脊髄の両方で矢印で示されるCNS損傷の血管周囲領域にほぼ独占的に見られます。
この手順の重要なステップは、細胞の解離です。実際、単一細胞懸濁液の調製は、その開発後に血管閉塞につながる可能性のあるクランプまたは凝集体を回避するための基本です。この技術は、非周期性幹細胞を小実験動物の脳に効率的に送達するための低侵襲プロトコルを模索していた再生医療の研究者、および炎症性神経疾患に冒されたヒトのクローズアップの観点からの道を開きました。
このビデオをご覧になった後、脳疾患のある実験動物における組織特異的スタンスの分離、調製、および全身注射に関連するトラブルシューティングについて明確に理解できることを願っています。
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概要
このプロトコルは、実験的自己免疫性脳脊髄炎（多発性硬化症のモデル）を持つマウスにおいて、静脈内注射による中枢神経系（CNS）への神経幹細胞前駆細胞（NPC）の送達を概説しています。この方法は、効果的な幹細胞移植のための最小限の侵襲的なアプローチを重視しています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 再生医療
- 細胞療法
背景
- 神経幹/前駆細胞（NPC）は再生神経学に可能性を秘めています。
- NPCの全身送達は低侵襲的で効果的な治療プロトコルです。
- この研究は、NPCの送達を評価するために多発性硬化症を模倣するモデルを使用しています。
- NPCの遺伝子タグ付けにより、移植後の追跡と識別が可能になります。
研究目的
- 静脈内注射によるCNSへのNPC送達の方法を開発すること。
- 炎症環境における移植されたNPCの生存と統合を評価すること。
- 幹細胞移植のための安全かつ効果的なプロトコルを提供すること。
使用方法
- 成体マウスの心室下帯からNPCの誘導。
- ウイルスベクター技術を用いたNPCの遺伝子タグ付け。
- 増殖しているニューロスフェアの単一細胞懸濁液への解離。
- 疾患のピーク時のEAEマウスへのNPCの静脈内注射。
主要な結果
- 静脈内注射によるCNSへのNPCの成功した送達。
- 死後解析によるNPCの生存と分布の特徴づけ。
- 最小限の侵襲的な移植方法の有効性の実証。
- 炎症性の神経系におけるNPCの統合に関する洞察。
結論
- このプロトコルは、CNS疾患におけるNPC移植のための実行可能なアプローチを提供します。
- 最小限の侵襲的な技術は、幹細胞療法の安全性と有効性を高める可能性があります。
- さらなる研究により、神経炎症性疾患におけるNPCの治療的可能性が拡大される可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Systemic delivery of neural stem/progenitor cells (NPCs) offers a minimally invasive approach to target inflammatory lesions in the central nervous system, addressing a key challenge in regenerative neurology for multifocal diseases like multiple sclerosis. This method enables biodistribution to perivascular sites of damage, supporting mechanistic de-risking of cell therapies in neuroinflammatory conditions. It provides a translational bridge for evaluating NPC engraftment, immunomodulatory potential, and target engagement in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of NPC pathotropism and homing to inflammatory CNS lesions via intravenous delivery.
- Operational Value: Supports functional validation of NPC-mediated immunomodulation and tissue trophic effects in vivo.
- Predictive Value: Facilitates assessment of target engagement and biological activity in a disease-relevant EAE model.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable biodistribution data through immunohistochemistry and reporter gene tracking.
- Operational Value: Establishes reproducible NPC preparation and dissociation protocols for single-cell suspension delivery.
- Assay Readiness: Enables standardized evaluation of cell survival, integration, and lineage differentiation post-transplantation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Models systemic NPC delivery in chronic inflammatory demyelination, relevant to MS therapeutics.
- Mechanistic De-risking: Clarifies NPC interactions with host cells via surface adhesion molecules (e.g., CD44, VLA-4 alpha subunit) in vivo.
- Pipeline Continuity: Supports risk-adjusted advancement by defining NPC behavior in inflammatory environments over 45 days.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for immunomodulatory cell therapies in neuroinflammatory diseases.
- Discovery Biology: Tests NPC homing mechanisms and paracrine signaling in a disseminated inflammatory CNS model.
- Screening: Delivers standardized, vesicle-free NPC suspensions suitable for intravenous administration and tracking.
- Analytics: Enables quantitative assessment of NPC distribution, survival, and multilineage differentiation via postmortem histology and immunofluorescence.
- Translational Research: Links NPC delivery to immunomodulatory outcomes in a model with temporal and spatial lesion dissemination.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable platform for evaluating diverse NPC lines or genetic modifications in EAE and related models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in NPC mode of action by demonstrating perivascular accumulation and immune regulation in vivo.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized neurosphere dissociation, cell counting, and tail vein injection procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by validating NPC safety, biodistribution, and target modulation in a clinically relevant model.
- Portfolio Impact: Supports risk-stratified prioritization of NPC candidates based on CNS engraftment and phenotypic stability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neural tissue dissection, neurosphere culture, and viral transduction for reporter gene labeling.
- Dependent on sterile surgical techniques, intravenous injection precision, and post-transplantation tissue processing for histology.
- Necessitates standardization across laboratories for NPC dissociation, concentration, and injection volume to ensure reproducibility.
- Must account for variability in EAE disease timing and severity when aligning injection with peak clinical symptoms.
- Limited by the need for postmortem analysis to assess biodistribution, precluding longitudinal in vivo imaging without additional labeling strategies.
