慢性EAEを有するマウスにおける神経幹/前駆細胞の全身注射

このプロトコルの全体的な目標は、実験的自己免疫性脳脊髄炎、多発性硬化症を模倣する疾患モデルに罹患したマウスの静脈内注射を介して神経幹前駆細胞をCNSに送達することです。これは、まず成体マウスの脳室内領域から神経幹前駆細胞(NPC)を誘導することによって達成されます。第2のステップは、ウイルスベクター技術を用いてNPCに遺伝的にタグを付け、in vivo細胞の同定と追跡を行うことです。

次に、増殖するニューロスフェアを単一細胞懸濁液に解離し、所望の密度で再懸濁し、疾患のピーク時にEAEマウスの尾静脈に注入します。最終的には、注入された幹細胞の生存分布と統合を特定し、特徴付けるために、死後の臓器および組織の病理学および免疫組織化学が実施されます。この技術の主な利点は、幹細胞と前駆細胞を炎症神経系に移植するための低侵襲で安全かつ効果的な方法を提供することです。

この方法は、神経系の炎症性疾患のモデルにおける全身注射幹細胞の安全性と有効性に関連する3つの主要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、脳幹細胞の分離から多発性硬化症のマウスモデルにおける全身注射の準備までの重要な実験ステップの理解に役立つため、特に若い科学者にとって有用です。適切な滅菌技術を使用します。

新たに分離した脳を脳スライサーマトリックスに置きます。2つのカミソリの刃を使用して、脳の前極から2ミリメートルの冠状切片を作成します。これは、視軌跡と前のカットの3ミリメートル後部を除いてです。脳スライスを清潔なペトリ皿に置き、解剖顕微鏡で作業して脳室下ゾーン組織を分離します。

組織をミンチした後、それを30ミリリットルの以前に調製してろ過した消化液に加えます。穏やかに振って、15分ごとに振とうしながら30分間インキュベートします。遠心分離後、上清を取り除き、ペレットを200マイクロリットルの完全な成長に再懸濁します。

ピペッティングによるミディアムまたはCGM。最初はP 1000で、次にP 200ピペットで。単一細胞懸濁液に到達したら、CGMで5ミリリットルまで増やし、新しいフラスコに移します。

細胞をインキュベーターに入れ、ニューロスフェアを5〜7日間形成します。準備ができたら、懸濁液を15ミリリットルのチューブに集めて遠心分離します。上清を取り除き、口蓋を200マイクロリットルのCGMに再懸濁します。

ニューロスフェアをP 200ピペットチップに100〜150回通すことにより、機械的に解離します。サスペンションをCGMで1ミリリットルまで上げます。次に、懸濁液を正確に希釈します。

適切な量をバイタルステインと混合し、ヘモサイトメーターで細胞数を決定します。細胞を正しい濃度に再懸濁し、新しいフラスコに移します。これらの手順を4〜5日ごとに繰り返して、in vivoで移植された細胞を同定するのに役立ちます。

NPCは、NPC形質導入の72時間後にレポーター遺伝子をコードするウイルスベクターで形質導入されます。蛍光レポーター遺伝子の発現は、免疫蛍光法またはフローサイトメトリーのいずれかによって検証可能です。準備ができたら、遠心分離によりGFP発現ニューロスフェアを回収し、上清を除去します。

次に、200マイクロリットルの細胞凝集体解離溶液を加え、10分間インキュベートします。細胞を回収し、それらを穏やかに再懸濁して、単一細胞懸濁液を得る。気泡が出ないように注意してください。

細胞をカウントして希釈した後、使用する準備ができるまで細胞懸濁液を氷上に保ちます。ニューロスフェアの準備ができたら、CNSのマウスモデルとして機能するように以前に準備されたマウスを回収します。損傷治療は、疾患の発現のピーク時に行われるべきです。

まず、マウスをウォーミングボックスに約10分間入れて、尾静脈を拡張させます。準備ができたら、1匹のマウスをウォーミングボックスからマウス拘束装置に移します。拘束装置を閉じて動きを制限し、尾を分離します。

テールの注射領域を適切な局所溶液で滅菌します。1ミリリットルのインスリン注射器に150マイクロリットルの細胞懸濁液を入れ、すべての気泡を確実に取り除きます。静脈を尾の背側表面に位置させ、針を尾の中央下部の静脈と平行に配置します。

ここでは、静脈は皮膚の表面に近くなります。したがって、手順を容易にします。針を静脈にそっと挿入し、数マイクロリットルの血液を採取して正しい位置を確保します。

次に、溶液を尾静脈にゆっくりと注入します注射後、針を取り外し、数秒間圧力をかけて出血を遅らせます。マウスを新しいケージに入れ、回復するまで監視します。所定の実験時間におけるすべてのマウスについて、同じ手順を繰り返す。

サンプルは、処理された動物および対照動物から収集され、ニューロスフェアとして増殖するときのCNSおよび他の組織へのNPCの浸潤および統合を決定するために分析されますNPCは、緑色で示されるリン酸化ヒソンH 3などの有糸分裂活性のマーカーを発現し、適切な分化条件下でプレーティングすると赤で示される巣のような未分化神経細胞のマーカーを発現します。 NPCは、アストログリアマーカー、GFAP、ニューロンマーカー、微小管状関連タンパク質2、およびオリゴジルグリアマーカーO 4、およびミエリン塩基性タンパク質核などの3つの神経系統に典型的なマーカーを発現し、dpiで対比染色され、移植後に治療効果を発揮するはずの未分化MPCは、CD44および非常に遅い抗原4のα4サブユニットを含む細胞表面接着分子を発現しなければならない。これらの例は、形質導入されたNPCが、増殖するニューロスフェアとして、また成長因子の離脱時にin vitroで分化するときにGFPを発現することを示しています。EAEマウスに全身的に注射された同系NPCは、移植後45日までの脳と脊髄の両方で矢印で示されるCNS損傷の血管周囲領域にほぼ独占的に見られます。

この手順の重要なステップは、細胞の解離です。実際、単一細胞懸濁液の調製は、その開発後に血管閉塞につながる可能性のあるクランプまたは凝集体を回避するための基本です。この技術は、非周期性幹細胞を小実験動物の脳に効率的に送達するための低侵襲プロトコルを模索していた再生医療の研究者、および炎症性神経疾患に冒されたヒトのクローズアップの観点からの道を開きました。

このビデオをご覧になった後、脳疾患のある実験動物における組織特異的スタンスの分離、調製、および全身注射に関連するトラブルシューティングについて明確に理解できることを願っています。