尿中エキソソームを単離するために、修正沈殿法
2015年1月16日
この原稿は、修正沈殿技術を使用してヒトの尿からエクソソームを分離するためのプロトコルを説明しています。
この手順の全体的な目標は、尿からのエキソソームの単離のための迅速でスケーラブルかつ効果的な代替手段を提供する、修正されたエキソソーム沈殿法を設計することです。これは、まず遠心分離によって尿サンプルから大きな死細胞と細胞破片を除去し、尿中エキソソームを含むスナットを新しいチューブに移すことによって達成されます。第2ステップでは、ペレットをDTTを含む単離溶液に溶解し、TAM馬の落下タンパク質を除去します。
その後、さらに遠心分離を行った後、TPフリー上清をexo quick TC試薬と一晩インキュベートし、翌日にエキソソームを沈殿させます。exo quick TC試薬で処理したサンプルを最後にもう一度遠心分離し、エキソソームペレットを取得します。最終的には、ウェスタンブロットやリアルタイムQPCRなどの下流プロセスをエクソソーム上で実行し、目的のバイオマーカーを特定することができます。
この技術の主な利点は、ウルトラセントリフィケーションろ過や沈殿などの既存の方法よりも、アーム法はウルトラ認証ステップを必要とせず、比較的迅速に実行するのが容易であると同時に、尿収集前にその後の分子分析に対して比較的純粋なエキソソーム収量を提供することです。新たに調製したプロテアーゼ阻害剤カクテルの3.125ミリリットルで空の滅菌レセプタクルに、次いでレセプタクル内の最初のボイド尿の約10ミリリットルを回収する。サンプルを15ミリリットルの円錐管に移します。
24時間採取した尿サンプルは、摂氏4度で保存することでエキソソームの単離にも使用できます。チューブを17,000GSおよび摂氏37度で10分間回転させて、尿中エクソソームから細胞の破片を除去または分離します。次に、ペレットを乱さないように注意しながら、上清を新しいチューブに移し、ペレットを500マイクロリットルの分離溶液に再懸濁します。
ペレットをDTTと最終濃度200ミリグラム/ミリリットル、摂氏37度で10分間インキュベートします。サンプルを2分ごとにボルテックスします。次に、ペレットが完全に溶解したら、サンプルに500マイクロリットルの分離溶液を加え、得られた懸濁液をすぐにスピンダウンします。
上清を以前に収集した上清とプールし、新しいペレットを50マイクロリットルの分離溶液に再懸濁します。エキソソームを単離するためのSDSページ分析では、まず、プールした上清11ミリリットルを3.3ミリリットルのexo quick TC試薬と摂氏4度で少なくとも12時間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを遠心分離し、上清を新しいチューブに移してSDSページ分析を行い、尿中エキソソームを含むペレットを使用してD-N-A-R-N-Aまたはタンパク質を抽出するか、摂氏マイナス80度で保存します。
NanoDrop分光光度計を使用して、2マイクロリットルのサンプルで260ナノメートルと280ナノメートルの吸光度を測定することにより、各抽出物のDNAとRNAの濃度を決定します。未処理の尿を含むレーンでは、SDSページ分析とウェスタン血液分析を使用したバイオマーカー検出の修正複製が示され、90〜100キロダルトンに対応する最初の尿中ペレットタンパク質の禁止が観察され、最終上清およびエキソソームペレットレーンでそれぞれTAM馬の落下タンパク質の存在と除去が示されました。TAMウマ落下タンパク質バンドは観察されず、初期のステップでTAMウマ落下タンパク質が除去され、エキソソームペレットの収量が増加したことを示しています。
この実験では、バイオマーカーAlexおよびTSG1 0 1は、少量のサンプルを使用した場合でも検出され、バイオマーカー分析のための非常に純粋なエキソソームペレットであり、TAM馬の落下タンパク質を含む豊富な可溶性タンパク質が存在しないことを示している。この技術は、慢性腎臓病の分野の研究者が尿中分離エクソソームを使用して糖尿病性腎症の早期発見と診断を行う道を開きました。
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概要
本稿では、改良された沈殿法を用いてヒト尿からエクソソームを単離するプロトコルについて記述します。本手法は、エクソソーム単離のための迅速でスケーラブルかつ効果的な代替手段を提供することを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物学
- エクソソーム研究
背景
- エクソソームは、細胞間コミュニケーションに関与する小型の細胞外小胞です。
- 尿からエクソソームを単離することで、さまざまな生物学的プロセスに関する知見を得ることができます。
- 現在の手法は時間がかかり、効率が低い場合があります。
- 改良された沈殿法により、エクソソームの回収率を向上させることができます。
研究目的
- 尿からエクソソームを迅速に分離する方法を開発すること。
- エクソソーム抽出のスケールアップ能と効率を向上させること。
- バイオマーカーの同定などのダウンストリームアプリケーションを容易にすること。
使用した手法
- 遠心分離により、尿検体から大きな細胞およびデブリを除去する。
- DTTを含む単離溶液でペレットを溶解する。
- 上清をexo quick TC試薬とともに一晩インキュベートする。
- 最終遠心分離を行い、エクソソームペレットを得る。
主要な結果
- 改良された手法により、尿からエクソソームを正常に単離することができた。
- 単離したエクソソームは、Western blotやqPCRなどのダウンストリーム解析に使用可能である。
- 不純物を効率的に除去することで、単離したエクソソームの純度が向上する。
- 本プロトコルは、より大量のサンプルサイズに合わせてスケールアップが可能である。
結論
- 改良された沈殿法は、エキソソーム分離のための有効な手法である。
- このアプローチにより、さまざまな生物学的研究におけるエキソソーム研究を効率化できる可能性がある。
- 今後の研究では、分離されたエキソソームのさらなる応用について検討される可能性がある。
よくある質問
産業界における重要性
尿中エクソソームを単離することで、腎疾患の非侵襲的なバイオマーカー探索が可能となり、腎治療薬開発における早期検出やメカニズム面でのリスク低減が促進されます。改良された沈殿法は、超遠心分離法に代わるスケールアップ可能で高収量な手法であり、ターゲットバリデーションのワークフローにおける再現性とスループットを向上させます。このアプローチは、コンタミネーションを低減し、下流の分子プロファイリングにおけるエクソソームの純度を高めることで、バイオマーカー同定における予測の信頼性を向上させます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： ネフロンの各セグメントから細胞種特異的なカーゴを反映したエクソソームを単離することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用上の価値： 超遠心分離を用いずにエクソソームを単離できる、迅速で拡張性の高い手法を提供し、技術的なばらつきを低減する。
- 予測的価値： プロファイリング用にmiRNAおよびmRNAが濃縮された高純度なエクソソームペレットを得ることで、バイオマーカー検出の信頼性を向上させる。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：疾患関連バイオマーカーを検出するためのWestern blotやqPCRなどのダウンストリームアッセイに向けて、検証済みのエクソソームサンプルを調製します。
- 運用の価値：ハイスループットなサンプル処理に対応した沈殿ベースのワークフローにより、エクソソームの単離を標準化します。
- アッセイへの適合性：RNA抽出およびタンパク質分析に適した一貫性のあるエクソソーム収量を実現し、再現性のあるバイオマーカースクリーニングをサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：疾患に関連するエクソソーム貨物を提供することで、尿中バイオマーカーの探索から前臨床検証への進展を支援します。
- メカニズム的リスク軽減：腎機能不全下でのエクソソーム内容物の変化の検出を可能にし、病態生理学的経路を明らかにします。
- 予測の信頼性：エクソソームバイオマーカーを糖尿病性腎症の早期兆候と結びつけることで、リスク調整に基づいた開発推進の意思決定を促進します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、仮説検証からリード化合物同定に至る創薬の連続的なプロセスに適合しており、非侵襲的なバイオマーカーの単離を可能にすることで、ターゲットの選定および前臨床試験への継続性に寄与します。
- 探索生物学：尿路細胞に由来し、細胞特異的なカーゴを反映するエクソソームを単離することで、仮説検証を支援します。
- スクリーニング：バイオマーカーアッセイの開発や化合物スクリーニングに適した、再現性のある定量的なエクソソーム出力を提供します。
- 分析：qPCRおよびWestern blotによるエクソソーム関連RNAおよびタンパク質レベルの測定を可能にし、条件間の比較分析を実現します。
- トランスレーショナルリサーチ：疾患に関連するカーゴの検出を通じて、尿中エクソソームバイオマーカーを腎疾患の前臨床モデルへと結びつけます。
- エンタープライズ再利用：複数の尿検体タイプや研究プログラムに適用可能な、拡張性と標準性を備えた単離プラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： バイオマーカープロファイリングに向けた高純度なエクソソーム分離により、メカニズムの曖昧さを軽減し、ターゲットバリデーションを強化する。
- 運用的価値： 超遠心分離工程を排除し、ワークフローを簡素化することで、標準化とスケールアップを向上させる。
- 戦略的価値： 腎疾患における早期バイオマーカー検出の信頼性を高めることで、より適切なgo/no-go判断を支援する。
- ポートフォリオへの影響： 強固なエクソソームバイオマーカーデータに基づき、リスク調整済みでの腎疾患治療候補薬の優先順位付けを可能にする。
実施上の考慮事項
- エクソソーム生物学およびRNA抽出やqPCRなどの分子生物学的手法の専門知識が必要です。
- 遠心分離装置、ExoQuick TC試薬、およびRNA/DNA定量用の分光光度計へのアクセスが必要です。
- インキュベーション時間、温度、および試薬の取り扱いを統一し、一貫性を確保するためのチーム間での標準化が求められます。
- 異なる尿採取プロトコルや保存条件に本手法を適用する際は、適応上の検討が必要です。
- 実用上の制限として、オーバーナイトのインキュベーションが必要であることや、移注時のエクソソーム消失を防ぐための慎重な取り扱いが挙げられます。
