Name: 全マウント神経筋接合解析のための トランス対アブドミン筋 の解剖 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: 学ぶマウスのトランス対アブドミン筋の解剖法と免疫蛍光法による神経筋接合部の可視化。高解像度共焦点顕微鏡を用いて運動ニューロン疾患の病態を解析する効果的な手法です。

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この研究は、カナダ保健研究所(助成番号MOP 38040)からR.K.、筋ジストロフィー協会(米国)からR.K.、SMAからR.K.とL.M.Mの家族、T.H.G.へのSMAトラスト、T.H.G.への筋ジストロフィーキャンペーンへの助成金によって支されました。L.M.Mはカナダ多発性硬化症協会のポストドクター・フェローシップの受賞者であり、R.K.はオタワ大学から大学健康研究委員長を受けています。

すべての手順は、機関によって定められた動物ケア基準に従って行われるべきです。
1. マウスからの腹部の筋肉の解剖
<ol><li>開始する前に、4%パラホルムアルデヒド(PFA)を構成してください。注意: 常にPFAをヒュームフード内に保管し、適切な保護具を着用してください。</li>
	<li>承認された方法でマウスを安楽死させる。 注: ビデオに示されたマウスは、CO2 の過剰摂取と子宮頸部脱臼によって安楽死させた。このマウスは、CD1 /C57Bl6ハイブリッドバックグラウンド上の4週齢の野生型マウスです。このマウスは、もともと購入されたマウスからオタワ大学の動物施設で飼育されました。</li>
	<li>股関節のレベルで皮膚を通して最初の切開を行い、マウスの周りのすべての方法を皮膚をカットします。</li>
	<li>皮膚を剥がし、前肢のレベルに達するまで上向きに引っ張ります。</li>
	<li>腰のレベルで腹部の筋肉を切り抜き、椎骨柱に到達するまで切開を続けます。</li>
	<li>この時点で、上肢に到達するまで、筋肉と肋骨を上向きに切り始めます。</li>
	<li>反対側の椎柱に到達するまでまっすぐ切ります。</li>
	<li>開始したポイントに達するまで下向きに切ります。</li>
	<li>下からダイヤフラムを離し(TVA筋肉に損傷を与えないように注意)、0.2mm解剖ピン付きのSYLGARDコーティングされた解剖皿にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に入れます。</li>
	<li>胸のケージと関連する筋肉を皿の中にピン留めし、表面的な側面を上にして、筋肉が完全に伸びることを確認します。</li>
	<li>1x PBSを注ぎ、4%PFAに交換します。</li>
	<li>蓋をして室温でロッキングプラットフォームに15分間放置します。</li>
	<li>室温で10分間PBSで3倍洗います。</li>
</ol>*この時点で固定筋肉は、その後の解剖の前に一晩冷蔵庫に残すことができます。
2. TVA筋肉の分離
<ol><li>TVA筋肉の単離を進めるには、解剖顕微鏡の下で、最後の数本の肋骨のレベルで外的斜筋を切断することから始めます(コメント付きガイドの 図1 を参照)。</li>
	<li>内側斜筋の始まりに達するまで、リネアアルバの横にまっすぐ切り捨て(下のTVAを切り裂かないように注意してください)。</li>
	<li>その後、下のTVAの上部から上の 直腸腹部 と外部斜めの筋肉を解放するために横切ります。</li>
	<li>TVA筋肉から血管と上にある脂肪を取り除きます。</li>
	<li>上の最後の肋骨から筋肉を解放します。</li>
	<li>筋肉の余白をカットし、PBSを含む24ウェルプレートに取り除きます。</li>
</ol>3. TVA筋肉の免疫蛍光標識と顕微鏡
以降のすべてのステップでは、細かいチップピペットを使用して液体を取り除き、揺れるプラットフォームにプレートを残します。特に明記されていない限り、以降のすべてのステップは室温で実行されます。
<ol><li>蛍光タグ付きバンガロトキシンを1:1000に含むPBSでインキュベートを30分間培養し、NmJにラベルを付けます。これは暗い部屋またはホイルの下で行うことができます。</li>
	<li>PBSで2%トリトンX-100のウェルあたり300 μlを加えて筋肉を透過させ、30分間ロッキングプラットフォームに放置します。</li>
	<li>30分間のブロッキング試薬(4%BSA、PBSで1%トリトン)でインキュベート。</li>
	<li>一次抗体を含むブロッキング試薬中にインキュベート(ニューロフィラメント1:100;シナプス小胞タンパク質2、1:250)を一晩で4°Cで。</li>
	<li>1x PBSで3倍を洗います。</li>
	<li>1:250二次抗体を2〜4時間含有するPBS中でインキュベートする。</li>
	<li>1x PBSで3倍を洗います。</li>
	<li>十分な蛍光実装メディアとカバースリップを使用して、ガラススライドに筋肉を取り付けます。</li>
	<li>スライドは標準的な蛍光顕微鏡の二重バンドパスフィルターを使用して最もよく見られる。</li>
	<li>NMJは、少なくとも40Xの目的を備えた共焦点顕微鏡上のZシリーズ投影を使用して最もよく画像化されます。</li>
</ol>

<ol><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu. Rev. Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li>
<li>Dupuis, L., Loeffler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+junction+destruction+during+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+insights+from+transgenic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis: insights from transgenic models.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 341-346 (2009).</li>
<li>Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+neuromuscular+synaptic+vulnerability+in+motor+neurone+disease%3A+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol.+Appl.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36, 133-156 (2010).</li>
<li>Murray, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 949-962 (2008).</li>
<li>Kariya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+SMN+protein+impairs+maturation+of+the+neuromuscular+junctions+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Reduced SMN protein impairs maturation of the neuromuscular junctions in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2552-2569 (2008).</li>
<li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+TDP-43+causes+age-dependent+progressive+motor+neuron+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Loss of TDP-43 causes age-dependent progressive motor neuron degeneration.</a> Brain. 136, 1371-1382 (2013).</li>
<li>Martinez-Hernandez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+defects+in+type+I+spinal+muscular+atrophy+in+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Synaptic defects in type I spinal muscular atrophy in human development.</a> J. Pathol. 229, 49-61 (2013).</li>
<li>Fischer, L. R., Li, Y., Asress, S. A., Jones, D. P., Glass, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+SOD1+leads+to+oxidative+stress+in+peripheral+nerve+and+causes+a+progressive+distal+motor+axonopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Absence of SOD1 leads to oxidative stress in peripheral nerve and causes a progressive distal motor axonopathy.</a> Exp. Neurol. 233, 163-171 (2012).</li>
<li>Cifuentes-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofilament+accumulation+at+the+motor+endplate+and+lack+of+axonal+sprouting+in+a+spinal+muscular+atrophy+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model.</a> Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).</li>
<li>Fischer, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis+is+a+distal+axonopathy%3A+evidence+in+mice+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol.%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man.</a> Exp. Neurol.. 185, 232-240 (2004).</li>
<li>Diers, A., Kaczinski, M., Grohmann, K., Hubner, C., Stoltenburg-Didinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+of+peripheral+nerve%2C+motor+end-plate+and+skeletal+muscle+in+patients+suffering+from+spinal+muscular+atrophy+with+respiratory+distress+type+1+%28SMARD1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure of peripheral nerve, motor end-plate and skeletal muscle in patients suffering from spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1).</a> Acta Neuropathol. 110, 289-297 (2005).</li>
<li>Ang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+axonal+sprouting+and+neuromuscular+junction+loss+in+an+animal+model+of+Charcot-Marie-Tooth+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Motor axonal sprouting and neuromuscular junction loss in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 281-293 (2010).</li>
<li>Simon, C. M., Jablonka, S., Ruiz, R., Tabares, L., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor-induced+sprouting+preserves+motor+function+in+a+mouse+model+of+mild+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor-induced sprouting preserves motor function in a mouse model of mild spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 973-986 (2010).</li>
<li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul.+Disord%22%5BJournal%5D)">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul. Disord. 20, 740-743 (2010).</li>
<li>Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+photo-bleaching+to+delineate+single+Schwann+cells+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction.</a> J. Vis. Exp. (4460), (2013).</li>
<li>Murray, L. M., Thomson, D., Conklin, A., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+translation+elongation+factor+%28eEF1A2%29+expression+in+vivo+differentiates+between+Wallerian+degeneration+and+dying-back+neuronal+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Loss of translation elongation factor (eEF1A2) expression in vivo differentiates between Wallerian degeneration and dying-back neuronal pathology.</a> J. Anat. 213, 633-645 (2008).</li>
<li>Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+smn+threshold+in+mice+dictates+onset+of+an+intermediate+spinal+muscular+atrophy+phenotype+associated+with+a+distinct+neuromuscular+junction+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul.+Disord%22%5BJournal%5D)">A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology.</a> Neuromuscul. Disord. 22, 263-276 (2012).</li>
<li>Comley, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ApoE+isoform-specific+regulation+of+regeneration+in+the+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">ApoE isoform-specific regulation of regeneration in the peripheral nervous system.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2406-2421 (2011).</li>
<li>Wright, M., Kim, A., Son, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+administration+of+muscarinic+antagonists+and+triple-immunostaining+of+the+levator+auris+longus+muscle+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li>
<li>Ling, K. K., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+neuromuscular+denervation+of+clinically+relevant+muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 21, 185-195 (2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このビデオでは、マウスからのTVA筋肉の解剖と筋肉内のNmJの全マウント免疫蛍光標識のためのプロトコルを詳述しました。また、この筋肉を示すデータを示すデータを提示し、SMAのマウスモデルにおける神経筋接合病理を解析するために使用することができる。
この手法の成功は、さまざまな要因に依存しています。最も一般的な問題のいくつかを以下に概説します。まず、免疫体質染色が悪い。これには、このプロトコルに記載されているものとは異なる試薬を使用することが最も一般的な理由の1つがあります。高品質の電子顕微鏡検査グレードPFAは、このプロトコルに記載されている抗体の選択と同様に、良好な染色を確保するために非常に重要です。さらに、古い動物(すなわち>3ヶ月)では、良質の染色を得ることはより困難な場合があります。これは、筋肉を取り巻く筋膜の厚さの増加と、外的斜めと 斜めの 腹部との間の脂肪蓄積の増加のためである。免疫蛍光に進む前に、脂肪を取り除くことを重要です。また、筋肉を覆う筋膜の一部を剥ぎ取る必要があるかもしれません, これは厚くなる可能性があります.筋線維に何らかの損傷を与え、インナーブパターンに混乱を招くことなく、筋膜や脂肪を筋肉から取り除くのは困難な場合があります。しかし、この技術を注意深く行えば、少なくとも1歳までマウスから良好な品質染色を得ることができる。若いマウス(すなわち、3ヶ月未満の)では、筋線維のからかいや分離を行う必要はないはずです。第二に:解剖および染色に続くNmJを見つけることが困難である。これはしばしば、解剖が最後の肋骨の下に広がっていないためです。NmJの大部分は、最後の肋骨のすぐ下に位置しているので、筋肉のこの部分が解剖に含まれていることを確認するために注意を払う必要があります。第三に: TVA筋肉にEO筋肉の付着.これは、個人が内部斜め(IO)筋肉のレベルを下回る解剖を拡張しようとする場合にしばしば苦情です。IOも存在するTVA筋肉の面積は、どの筋肉がどの筋肉であるかの区別が困難な場合があり、分析が難しい。このため、私たちは日常的にTVA筋肉の最も優れた部分を解剖するだけです。このレベルでは、EOとTVAの筋肉の間に付着性がないため、これは重大な問題ではないはずです。
TVA筋肉を使用する際の重要な障害の1つは、付加的な筋肉と比較して、外科的操作または物質の注入のいずれかのためのアクセシビリティである。これらのタイプの実験は、特定の筋肉におけるNMJ生理学を調査するために重要であり得る。TVAは確かに チビアリス前部 または 胃頭蓋のようなより一般的に使用される筋肉よりも容易にアクセスできないが、以前の研究は肋間神経18の外科的傷害によってTVAを否定することが可能であることを示している。我々はまた、最近、一般的な麻酔下の物質の局所投与のためにこの筋肉を使用しています (未発表データ).これらの実験は適度な技術的課題を表すことができますが、この研究は、それらが実行可能であり、病理学的および生理学的操作の両方の下でNJの分析のためにこの筋肉の有用性を拡張することを示しています。
TVA筋肉は、インネクレーションパターンの全体マウント分析に使用できる体全体に位置する薄い平らな筋肉の数の一つです。他の筋肉は、脳幹の顔の核から発する運動ニューロンによって内在する頭蓋筋のグループを含み、長さ、オーリリスの優れた、及び内転筋を包含する14,19に対する切離を包含する。さらに、TVAを取り巻く筋肉は、EO、IO、および直腸腹部を含む、また、NMJ分析のために標識および使用することができる。マウスモデルにおけるNMJ病理の包括的な分析のためには、全身に位置する筋肉の数を考慮し、単一の筋肉に分析を制限しないことが重要です。これは、異なる筋肉20間のNMJ病理のレベルにおいて有意な不均一性がある運動ニューロン疾患のマウスモデルで例示される。このような筋肉間変動は、運動ニューロンの脆弱性のメカニズムを調査する際に非常に貴重なツールであり、したがって、単一の筋肉に分析を制限することは、研究の可能性を大幅に減少させる可能性があります。

神経筋接合部(NmJ)は、低い運動ニューロンと骨格筋線維とのシナプス接続である。それらは伝統的に三者シナプスと考えられており、ニューロン(シナプス前末端)、筋線維(シナプス後末端)、および末端シュワン細胞1から構成されている。NmJは、運動ニューロン疾患およびマウスモデル2,3の範囲における病理学における早期かつ重要な標的であるように見える。典型的な症状としては、運動エンドプレートがシナプス前の内挿を欠く場合、シナプス前末端の腫脹、およびNMJ形態4-11の複雑さの低下を伴う脱児が含まれる。代償応答はまた、末端および節線発芽を含む、軸索プロセスが残りのシナプス末端またはノード間から再インナー化されたデンナー化されたエンドプレート12,13まで延びるところも注目できる。シナプス活性とNMJ形態の密接な相関により、NMJ形態の解析から運動ニューロンの機能状態に関する多くの情報を得ることができます。NJの喪失は神経筋病理4,10の最初の側面の1つを頻繁に表すので、内在レベルでの定量は、病理の進行および治療介入の潜在的効果に関する重要な情報を与えることができる。さらに、NMJの損失は病理学的進行における重要なステップを表すため、接続を安定させ、再生を促すことができる治療薬の開発は、大きな利益をもたらす可能性がある。
NMJの形態を分析する際には、筋肉の選択が非常に重要です。主な考慮事項のいくつかは、筋肉の繊維の種類を含めることができます, 体の位置, 人間の条件との比較分析.また、物質の注入や外傷性神経損傷などの操作が必要な場合には、実験的なアクセシビリティも考慮することが重要です。一般に、運動ユニットのサブタイプの範囲を反映して、全身に位置する筋肉の範囲を解析することが好ましい。しかし、多くの場合、筋肉の選択は解剖の容易さの影響を受けます。その結果、NMJ分析は、しばしば胃頭筋のような大きな付垂筋に対してのみ行われる。このような筋肉で良好なNMJ染色を得るためには、筋線維の切断または機械的破壊がしばしば必要とされる。その結果、インナレーションパターンが破壊され、インナレーションパターンの包括的かつ高品質な分析、発芽および脱毛がしばしば損なわれる可能性がある。別のアプローチは、断面を必要とせず、無傷で染色され、取り付けることができる薄い平らな筋肉を使用することです, 筋肉の全体のインナーブの包括的な概要を可能にします.このような分析に使用できる筋肉の数があります, 頭蓋筋のグループを含みます, (浮動オーリスロンサスを含みます, オーリキュラリス優れ, および内転管アウリスロングス)14,胸部筋肉 (例えば.三角柱 )15、および腹部(例えばトランス対筋腹部(TVA)))筋肉。このような筋肉を使用する際の主な障害は、損傷を受けずにそれらを解剖するために必要な技術的専門知識です。
本ビデオでは、マウスからTVA筋肉の免疫蛍光標識を解剖し、実行するプロトコルを提供し、インネクレーションパターンとNMJ形態の包括的な分析を可能にします。TVA筋肉は、腹部筋肉の最も深い層を含む主に遅いけいれん筋肉であり、より低い肋間神経によって内在化される。これまでの研究では、小児運動ニューロン疾患脊髄性筋萎縮症(SMA)の多くのマウスモデルおよび早期発症運動ニューロン変性4,16の他のマウスモデルにおいて、病理に対して一貫して非常に脆弱であることが示されている。したがって、TVAは末梢神経障害におけるNMJ分析を行うのに有用な筋肉であることを示唆する。

<table><tbody><tr><td>パラホルムアルデヒド水溶液 (16%)</td> <td>Electron Micropscopy Sciences</td><td>15700</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Angled Sprung Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors - ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 シリコーンエラストマーキット</td><td>ダウコーニング</td><td>地元のサプライヤーに依存</td><td>これを使用して、筋肉をピン留めするための解剖皿を作る</td></tr><tr><td>Minutien ピン</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-ブンガロトキシン、アレクサ フルオア 488 コンジュゲート</td><td>Invitrogen</td><td>B-13422</td><td></td></tr><tr><td>牛血清からのアルブミン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>ニューロフィラメント 一次抗体 (2H3)、上清</td><td>発生研究 Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-166-003</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Mounting Medium Dako</td><td></td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Slides (Superfrost Plus;白)</td><td>フィッシャー12-550-15</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カバースリップフィ</td><td>ッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>CD1 / C57BL6マウス</td><td>ジャクソンラボ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

全マウント神経筋接合解析のための トランス対アブドミン筋 の解剖

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

神経筋接合形態の解析は、特定の運動ニューロンの生理的状態に関する重要な洞察を与えることができる。細い平らな筋肉の分析は、後肢など、伝統的に使用される太い筋肉(例えば.ガストロクネミウス。細い筋肉は、特定の筋肉の全体のインナーブパターンの包括的な概要を可能にし、その結果、運動ニューロンの選択的に脆弱なプールの識別が可能になる。これらの筋肉はまたモーター単位サイズ、軸索分岐、および末端/節線の発芽のような変数の分析を可能にする。このような筋肉を使用する際の一般的な障害は、それらを解剖するための技術的な専門知識を得ています。このビデオでは、若いマウスから対流性腹部(TVA)筋を解剖し、免疫蛍光を行って軸索および神経筋接合(NJ)を可視化するためのプロトコルを詳しく説明します。我々は、この技術がTVA筋肉のインナーレーションパターンの完全な概観を与え、小児運動ニューロン疾患、脊髄性筋萎縮症のマウスモデルにおけるNMJ病理を調べることができることを実証する。

上記のプロトコルは、NMJ分析のためのTVA筋肉の分離と染色を指示する。これにより、筋肉のインジュレーションパターンの全体マウント分析と、NMJ形態の高解像度分析が可能です(図2)。この技術は、SMA4,17などの運動ニューロン疾患のマウスモデルにおけるNMJ病理を明らかにするためにうまく応用することができる(図3)。SMAのマウスモデルでは、病理に有意な筋肉内変動があるが、TVA筋肉は一貫して高い影響を受ける。これは、運動エンドプレートの脱用、シナプス前末端および末端発芽における神経フィラメントの蓄積によって証明される(図3)。ここで示した結果は、上記の手法が、マウスモデルにおけるNMJ病理のインナーレーションおよび分析の包括的な概要を提供する強力な方法であることを示す。
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1.jpg" width="600px"> 図 1.マウスの腹部の筋肉の概要.(A)画像は、最近安楽死させたマウスから取り除かれ、表面的な側の解剖皿に固定された腹部の筋肉を付けた胸部ケージを示す(A)。(B)Aの解剖は、腹筋のおおよその境界を示すためにアセトされています。表在性腹筋は、解剖の左側に見ることができ、外部斜め(青色で輪郭を描いた)と直腸腹部(赤で概説)が含まれる。解剖の右側では、表面筋が取り除かれ、腹部筋(緑色で概説)と斜め筋(黄色で輪郭を描いた)の視覚化が可能であった。このプロトコルの目的は、TVA筋肉の上の部分の解剖を指示することです, 固体緑三角形としてここに示されています.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像を表示</a>できます。
<img alt="Figure 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2.jpg" width="600px"> 図 2.TVA筋肉における神経筋接合部の全マウント概要。TVA筋肉からの一例を示す画像は、神経フィラメント(NF;緑)、シナプス小胞タンパク質2(SV2;緑色)およびブンガロトキシン(BTX;赤色)の免疫蛍光染色で視覚化した。画像は、グループ(B)または個々の(C)NJを示す全筋肉(A)または共焦点画像を示すモンタージュ蛍光顕微鏡写真である。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像を表示</a>できます。
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3.jpg" width="600px"> 図 3.SMAのマウスモデルからのTVA筋肉における神経筋接合病理。神経フィラメントの免疫蛍光染色(NF;緑)、シナプス小脳タンパク質2(SV2;緑)、バンガロトキシン(BTX;赤)のいずれかから視覚化されたTVA筋肉からのMJを示す共焦点顕微鏡写真(Smn2B/+)またはSMAマウスモデル(Smn 2B/--)。通常のNMJ形態はコントロールマウスで観察できるが、TvAではSmn2B/-マウスの筋には完全な脱ネル(白矢印)、部分的な脱ネル(紫色の矢印)末端発芽(青い矢印)およびシナプス前腫脹(黄色の矢印)の証拠がある。シナプス後のエンドプレートは、明らかに成熟していない表現型を反映した複雑性も低い。スケールバー = 50 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには ここをクリック</a>します。

本ビデオでは、マウスの 経対腹部 筋の解剖プロトコルを示し、免疫蛍光と顕微鏡を用いて神経筋接合部を可視化する。

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

横走ADOS筋は、腹筋群の最深層を構成する薄く平坦な筋肉です。この筋肉は、線状アルファを介して正中線に、また胸郭の深層面に付着しています。このビデオでは、この筋肉の上部を解剖し、免疫蛍光法を用いて神経支配パターンと神経筋接合部の構造を可視化します。この解剖には、添付のプロトコルに別途記載されているツールが必要です。適切な方法でマウスを安楽死させた後、被毛の飛散を最小限に抑えるために70% ethanolをスプレーします。マウスを仰向けに置き、股関節の高さで皮膚を切開します。腹筋を切断しないように注意しながら、マウスの周囲を一周するように切開を続けます。切開が完了したら、皮膚をマウスの頭部の方へ引き上げます。ここでも、腹筋を破裂させないように注意します。腹筋を切り開き、脊柱に達するまで切開を続けます。この時点で、胸骨の上まで肋骨を切断し、横隔膜を胸郭から剥離するように注意してください。マウスの反対側でもこの工程を繰り返します。次に、肋骨と胸骨を切断し、筋肉が付着した肋骨をアガロースコーティング済みの解剖皿に移します。昆虫解剖用ピンを用いて筋肉を固定してください。組織を4%PFAで固定し、ロッキングプラットフォームの上で15分間静置します。ここでは、ピン留めした筋肉の例を示します。画像の左側には、青色で囲まれた外腹斜筋と赤色で囲まれた腹直筋を含む、表在筋を確認できます。画像の右側ではこの層が剥離されており、黄色で囲まれた内腹斜筋と、緑色で囲まれた腹横筋が露出しています。ここでの目的は、腹横筋の上部を解剖することです。解剖顕微鏡下で、実線の緑色の三角形で示されている箇所において、肋骨を覆っている外腹斜筋を切断し、次に外腹斜筋を腹横筋の上方で切り下げます。画像の左側に接線方向の筋繊維として見えている内腹斜筋の起始部が見えるまで切り下げてください。血管を筋肉の表面からそっと剥がして除去します。次に、鈍的剥離を用いて腹横筋を上の肋骨から分離します。肋骨の下にある部分も含めるように注意しながら、筋肉の縁に沿って切開します。肋骨を取り除き、免疫蛍光染色のために筋肉を24ウェルプレートに移します。免疫蛍光染色のすべての手順は24ウェルプレート内で行ってください。細いチップのピペットを使用し、本稿のプロトコルに従って操作してください。本プロトコルで詳細に説明されている試薬を使用してください。免疫蛍光染色後、筋肉をガラススライド上に載せ、蛍光封入剤を用いて封入します。ピンセットを使用して慎重に筋肉を広げ、カバーガラスをかける前に平らにすることを確認してください。封入時に、筋肉を平らにするためにしっかりと押し付けてください。この画像に示すように、本プロトコルは腹横筋のホールマウント染色に使用でき、神経筋接合部および神経支配パターンを可視化することが可能です。この画像では、軸索とシナプス末端が緑色で示されており、SB twoおよびニューロフィラメントに対する抗体で標識されています。また、赤色で示されているのは運動終板であり、α-ブンガロトキシンでラベル付けされています。共焦点顕微鏡のZスタック（Z Series）を用いることで、神経筋接合部の形態の高解像度画像を得ることができます。本プロトコルは、マウスモデルにおける神経筋接合部の病理学的研究に適用可能です。例えば、これらの画像は、脊髄性筋萎縮症のマウスモデルにおける神経筋接合部の病理学的所見です。白または紫の矢印はそれぞれ完全または部分的な脱神経の証拠を、青い矢印は末端の発芽（sprouting）を、黄色の矢印はシナプス前終末の腫脹を示しています。このような解析により、運動ニューロン疾患における病理学的プロセスに関する重要な知見を得ることができます。

dissection-transversus-abdominis-muscle-for-whole-mount-neuromuscular

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

アクセス可能なシナプスの電気生理学のアプリケーションでは、シナプス変異体の分析に有用なシナプス活性の定量的な尺度を提供しています。この記事では、神経筋接合部（NMJ）のを公開するために使用される解剖の方法を説明します...

解離性とC. elegansの神経筋接合部から録音する

で、アクティブなゾーンの解剖とイメージングショウジョウバエ神経筋接合部

このような神経筋接合部（NMJs）で端末シュワン細胞（SCS）と密集した組織内の個々の細胞を可視化に挑戦している。...

シーケンシャル神経筋接合部におけるシングルシュワン細胞の輪郭を描くのにフォトブリーチング

このビデオは、ショウジョウバエの背側縦筋の神経筋接合部の構造的完全性を評価するためのプロトコルを示しています。この手順では、ニューロンと筋肉を2つの異なる抗体で染色し、突然変異型と野生型のハエの蛍光パターンを比較します。突然変異型ハエのニューロン染色の減少は、神経変性を示していますが、筋肉構造は無傷のままです。...

ショウジョウバエの背側縦筋神経筋接合部の構造的完全性の評価

神経筋接合部(NMJ)は、シナプス不全に至ることもあるさまざまな条件で変化します。本稿では、このような構造変化を定量化するための蛍光顕微鏡法について述べる。...

神経筋接合部：測定シナプスサイズ、断片化および共焦点蛍光顕微鏡を用いてシナプスタンパク質の密度の変化

筋肉内への取り込みと分子の逆行性輸送の有効性は、運動端板（MEPs）に対する注射部位の位置に依存します。ここでは、トレーサーの運動ニューロンへの逆行性輸送を最適化するために、骨格筋上のMEPの位置を特定する方法について説明します。...

モーターエンドプレートに沿って筋肉内注射：直接運動ニューロンへのシャトルトレーサーへの低侵襲アプローチ

神経筋接合部 (NMJ) の機能評価は、筋肉と神経の間の通信に不可欠な情報を提供できます。ここで使用して 2 つの異なる筋神経剤、すなわちヒラメ坐骨とダイヤフラム隔 NMJ...

神経筋接合部機能を測定

ここでは、出生後初期の発達段階で単一の筋線維を効率的に得る方法を、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー(EDMD)の非常に重篤なモデルであるホモジューザイゴウス変異体ラミンΔ8-11マウスモデルから提案する。...

出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

神経筋接合成分を正確に検出する能力は、病理学的または発達的プロセスのために、そのアーキテクチャの変更を評価する上で非常に重要です。ここでは、定量的測定を行うために使用できる全マウント神経筋接合部の高品質画像を得るための簡単な方法の完全な説明を提示する。...

全山神経筋接合部の免疫蛍光解析と形態測定解析のための単一骨格筋線維の解剖

このプロトコールは、異なるバイオマーカー、すなわち、ニューロフィラメント200、小胞アセチルコリントランスポーター、α-バンガロトキシン、およびS100を有する蛍光免疫組織化学を用いて、ラット内側腓腹筋におけるシナプス前末端、シナプス後部受容体、およびシナプス周囲シュワン細胞間の空間的相関を調べる方法を示す。...

ラット内側腓腹筋における神経筋接合部の形態学的特徴の可視化

このレポートは、 ショウジョウバエ の幼虫の神経筋接合部を視覚化するための新しいサンプル調製手順を提供します。この方法は、従来の方法と比較してサンプルのカールを防ぐのにより効果的であり、 ショウジョウバエの...

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部の透過型電子顕微鏡法のためのサンプル調製プロセスの最適化

学ぶマウスのトランス対アブドミン筋の解剖法と免疫蛍光法による神経筋接合部の可視化。高解像度共焦点顕微鏡を用いて運動ニューロン疾患の病態を解析する効果的な手法です。

全マウント神経筋接合解析のためのトランス対アブドミン筋の解剖

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全マウント神経筋接合解析のための トランス対アブドミン筋 の解剖

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