Name: ポリソームプロファイリングによってストレス状態の間に翻訳開始の分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 学ぶポリソームプロファイリングによるストレス条件下での翻訳開始解析法。哺乳類細胞を用いてリボソーム分画を分離し、タンパク質のポリソーム結合をウェスタンブロットで評価します。この手法は翻訳制御メカニズムの解明に有用です。

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PAは、ラバル大学の医学部からの奨学金の受取人 &quot;ピエール·デュラン」です。ポリソーム精留塔をRMに自然科学とカナダの工学研究会（MOP-CG095386）によってサポートされていたこの作品は、RMR Mにイノベーション助成金のためのカナダの財団（MOP-GF091050）を通じて取得した新しいCIHR研究者の給与賞を保持している。 私たちは、博士に感謝しています。有益な助言のためのE. Khandjian、I. Gallouzi、S.ジ - マルコとA. Cammas。

プロトコルは、ガイドラインに従っています ラバルの倫理審査委員会により承認されました。 1。細胞培養の準備と脳の操作<ol><li>哺乳類とショウジョウバエ細胞<ol><li>アメリカン·タイプ·カルチャー·コレクションが推奨するようにしたHeLa子宮頸癌細胞とシュナイダーショウジョウバエの胚細胞を増殖させる。低継代の細胞を操作します。 </li><li> 80％の集密度の実験日に到達するために、プレートの細胞。最良の結果を得るには、各実験条件についての細胞の〜12×10 6を使用しています。ポリソーム分析のための抽出物を加える前に、少なくとも90分間、新鮮な完全培地を添加することにより翻訳を刺激する。 </li></ol></li><li>脳の分離：生後9〜16日の間、老齢マウスの脳を分離します。安楽死は、麻酔および頸椎脱臼した後、CO 2吸入を必要とする。犠牲に続いて、脳全体のどちらかの場所を隔離I-80℃でTまたは直接すぐに使用冷PBS 1Xにそれを転送します。 </li></ol> 2。密度勾配分画系の製造に<ol><li> 5分間、0.1％SDSで配管システムを洗浄します。 </li><li> DEPC水で洗浄する前に、5分間RNaseZAPソリューションで、その後、5分間、70％エタノールでチューブシステムを洗浄します。 </li><li>装置の配管系を乾燥させるために空気をポンプ。 </li></ol>ショ糖勾配の3。準備<ol><li> 20mMのトリス-HCl、pH7.4、1.25のMgCl 2、150mMのNaCl、および1mM DTT、15％、55％ショ糖溶液を作る。 </li><li>生成する 製造業者の使用説明書に記載されているように、前者イスコモデル160勾配を用いて15％から55％線形スクロース勾配。しかし、勾配の気泡や乱流の生成を避けるために、周知TRIS蠕動ポンプの速度を制御することが重要である。使用するまで4℃で勾配を維持する。 </li><li>勾配メーカープログラムが実行されている時間の間、4℃で超遠心機を冷却する</li></ol> 4。細胞の作製とマウスの脳の抽出物<ol><li>細胞抽出物の準備<ol><li>氷と洗浄細胞の上に置いてプレート（S）は、冷PBS 1Xで3回。 </li><li>補充した溶解緩衝液1ml（pH7.4の20mMトリス塩酸、1.25のMgCl 2、150mMのNaCl、1mMのDTT、1％ノニデットP40、5 U / mlのRNase阻害剤、収穫細胞（〜12×10 6個）完全なミニEDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル錠付き）、エッペンドルフチュー​​ブに転送し、1ccののU100インスリン注射器28 G 1/2を介してそれらを15Xを渡すことでよく混ぜる。細胞溶解物を氷上で15分間休憩しましょう​​。 </li><li> 10×対物レンズを用いた位相差顕微鏡で観察することにより細胞溶解を評価するためにスライド上に細胞溶解物を数滴入れた。唯一の核は見えるはずず、細胞膜は、細胞溶解のために証明する見えないはずです。対照として、観察未溶解細胞。 </li><li> 4℃で20分間、11,000×gでの遠心分離によって細胞溶解物を明確にし、ポリリボソームを含む可溶性ライセートを保つ。 </li></ol></li><li>マウス脳抽出物の調製<ol><li>溶解緩衝液2mlの氷冷Dounceホモジナイザーで10ストロークにより単離された脳全体（〜500mg）をホモジナイズし、4℃で15分間、11,000×gで遠心分離することによってホモジネートを明らかにする</li><li> 50％ショ糖のクッションの上に得られた上清をロードし、4℃で、TH-641超遠心ローターを用い20万×gで2時間沈降を進める</li><li>溶解緩衝液1ミリリットル中にポリリボソームを含む半透明のペレットを再懸濁し、上下にピペッティングしてよく混ぜます。勾配上にロードする前に30分間氷上サスペンション残りをしましょう​​。 </li></ol></li></ol> 5。ショ糖勾配超遠心分離に抽出ロード<ol><li>濃度を測定分光光度計を用いて、細胞質抽出物中に存在するRNAの。慎重にゆっくりと15パーセント〜55％ショ糖勾配上に〜抽出物の20 OD 260単位をロードします。利用可能なスペース2-3 mmは遠心分離中のチューブをオーバーフローを回避するために、管の表面に存在することを確認してください。 </li><li> 4℃で、TH-641超遠心ローターを用い23万×gで2時間30分の超遠心機を用いて勾配を遠心分離遠心分離が終了すると、チューブを外し、勾配を乱さないように注意深く氷の上に置きます。 </li></ol>ポリソームプロファイリングのための細胞質抽出物の6。画<ol><li>製造者によって記載されているように、自動化された密度分画システムにショ糖勾配を配置し、分画の自動分別と収集を進める（0.5ミリリットルずつ）。 </li><li> 254 nmの吸光度を連続的に監視して、個々のエッペンドルフチュー​​ブに各画分（〜500μl）を収集します。 parall中勾配分別操作のELは、polyribosomalプロファイルはチャート紙で編集されます。代わりに、ポリソームプロファイルの電子買収を持つようにチャートレコーダーに接続され、データ取得手段を使用しています。 </li><li>各実行の最後に、ドライアイス上で収集したエッペンドルフを転送します。このとき、ストアのいずれかを-80℃で画分を集め、以下のように直接またはタンパク質-RNA複合体を沈殿させる。 </li></ol> 7。タンパク質抽出および分析<ol><li>ショ糖勾配の各収集画分に、100パーセントの冷エタノール2容量を追加して、RNA-タンパク質複合体は、-20℃で一晩沈殿させてみましょう。 </li><li>遠心機で4℃で20分間11,000 xgで各RNA-タンパク質沈殿物を70％エタノールで洗浄する。乾燥した特異的抗体を用いたウェスタンブロットに進む前に、SDS-PAGEサンプル緩衝液中に沈殿物を再懸濁する（ 図2参照）。 </li></ol> 8。RNA抽出およびAnalysis <ol><li>セクション7.1のように、RNA-タンパク質複合体を沈殿させる。 0.1％SDSを含有する溶解緩衝液中の各RNA-タンパク質沈殿物を再懸濁する。 55℃の水浴中で30分間、2 mg / mlのプロテ​​イナーゼKを有する沈殿物のタンパク質成分を消化する。 </li><li> &quot;：クロロホルムフェノール」、クロロホルム2ボリューム、2 MのNaOAc pHが4の0.1ボリュームと20分間、4℃で万×gで遠心分離の1ボリュームを追加することにより、沈殿物のRNA成分を抽出。 1容量のイソプロパノールおよびグリコーゲン0.2μgの/μLを添加することにより、-20℃で一晩、各試料の得られた水相から沈殿物のRNA。 4℃で10,000×で1時間沈殿物を回転70％冷エタノールでRNAペレットを洗浄します。 </li><li> RNA分解酵素を含まない水を少量にRNAペレットを再懸濁します。量を評価 と品質 RNAを分光光度計を用いて。 </li></ol>

<ol><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Fournier, M. -J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell International. 10 (12), (2010).</li>
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<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
<li>Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+footprints+on+a+transcriptome+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal footprints on a transcriptome landscape.</a> Genome Biology. 10 (4), (2009).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

スクロース勾配上のポリソームプロファイル解析は、細胞または組織から単離したポリソーム9,11-14の濃度を分析することによって、翻訳開始の測定を可能にする。この手法は、 生体内で翻訳開始を測定するのに最適な（ない場合は一意の）アプローチである。これは、細胞周期15の間、細胞を増殖させるの並進状態を監視するために、及び翻訳開始には、ウイルス感染症、低酸素13,16、放射線17、および化学薬物療法で使用される18を含むストレスの様々な種類の効果を評価するために使用される。この技術は、細胞培養物ならびに脳および肝臓などの特定の組織の翻訳開始を評価するためにうまく機能している間しかし、それは病変組織および腫瘍対正常の翻訳開始を比較するために使用することができる場合に確立されていない。 ポリソームプロファイルの変化はまた、翻訳elongaを変更する条件の下で発生する可能性がありますのTiONまたは終了。終結の抑制は対照と比較し、より大きなポリソームをもたらすはずであ...

真核細胞は、常に迅速な適応細胞応答を必要とする有害な生理学的および環境ストレス条件の範囲に遭遇する。細胞ストレス応答は、抗生存と生存促進作用性因子との間の正確なバランスを必要とする。このバランスを崩壊させることは、癌や神経変性疾患などのヒトの病理の発展をリードする不可逆的な結果をもたらす可能性がある。ストレス反応の第一段階の間、細胞は、mRNAの翻訳のレベルでの遺伝子発現の変化の協調制御を伴う生存促進経路を活性化する。 真核生物のmRNAの翻訳は、翻訳開始因子（EIFS）、特異的なRNA結合タンパク質（のRBD）と、RNA分子の1との間の協調的な相互作用を伴う複雑な細胞プロセスである。開始、伸長、および終結：mRNA翻訳、3つの異なるフェーズに分割される。すべての3つのフェーズがレギュレーションの対象となりますがlatory機構は、翻訳制御メカニズムは、主にこのようにしてタンパク質合成2の律速段階を構成する翻訳の開始位相を、標的とする。 翻訳開始は 、 私は開始前複合体の形成につながる、三元複合体と40Sリボソームサブユニットへのその後の結合に会った eIF2a.GTP.Met-tRNAの形成に始まる高度に秩序プロセスです。次のステップは、そのようなeIF4F複合eIF3と、翻訳開始因子の活性が関与するmRNAに前開始複合体の動員である。このように形成された48S開始前複合体は、開始コドンAUGを認識するまで、mRNAの5 &#39;非翻訳領域のスキャンを開始するには、この機械を有効に特定の立体構造変化を受ける。翻訳開始因子の多くは、その後解放され、60Sサブユニットが翻訳のために、複雑な有能なリボソーム80Sを形成するために動員され、Aトンその時点でタンパク質合成を開始する（ 図1）。一染色体は、いわゆるポリソーム（またはポリリボソーム）の製造時に同じmRNAを翻訳することができ、複数の80S。ポリソームmRNA上の密度は、開始、伸長および終結率を反映し、したがって、特定の転写物の翻訳可能性の尺度である。しかしながら、ポリソームプロファイルは、主に開始段階におけるmRNA翻訳の変化を評価するために使用される。ここでは、翻訳開始阻害剤としてのプロテアソーム阻害剤を使用している。この薬物による癌細胞の処理は、翻訳開始因子eIF2a をリン酸化し、3 HRIというストレスキナーゼの活性化によって特徴付けストレス応答を誘導する。 eIF2aのリン酸化は、哺乳動物細胞4における翻訳開始の阻害を引き起こす主要なイベントの一つです。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cells</td></tr><tr><td>HeLa子宮頸がん細胞</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション(バージニア州マナッサス;ATCC)</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Schneider Drosophila 胚細胞</td><td>American Type Culture Collection (バージニア州マナッサス;ATCC)</td><td>CRL-1963</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">培地とサプリメント</td></tr><tr><td>シュナイダー's ショウジョウバエミディアム</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>SO146-500ml</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ<td>11995-073</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>フィッシャーサイエンティストサイエンティスト</td><td>SH30396-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ライフテクノロジー</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">スクロース溶液</td></tr><tr><td>D-スクロー</td><td>ス フィッシャー科学者</td><td>BP220-212</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49767</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>フィッシャーサイエンティスト</td><td>B3925</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">溶解バッファー</td></tr><tr><td>トリスHCl</td><td>フィッシャーサイエンティスト</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl<サブ>2</サブ></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Tekniscience</td><td>3624-05</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DTT</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>D 9779</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nonidet P40 (Igepal CA-630 )</td><td>MJS Biolynx</td><td>19628</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SDS</td><td>テクニサイエンス</td><td>4095-02</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RNase阻害剤(RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor)</td><td>Life technologies</td><td>10777-019</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>抗プロテアーゼ(完全、ミニ、EDTAフリー)</td><td>ロシュ</td><td>11,836,170,001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">RNA抽出</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>ライフ</td><td>テクノロジーAM2542</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>フェノール:クロロホルム</td><td>フィッシャーサイエンティスト</td><td>BP1754I-400</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>フィッシャーサイエンティスト</td><td>C298-500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>グリコーゲン</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ<td>10814-010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>アクロスオーガニック</td><td>327270010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">抗体</td></tr><tr><td>抗FMRP抗体</td><td>フルニエet al., Cancer Cell International, 2010</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ポリソームプロファイリングによってストレス状態の間に翻訳開始の分析

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

mRNA翻訳の正確な制御は、特に、生理学的および病理学的ストレスに応答して、真核細胞の恒常性に必須である。このプログラムの変更は、損傷した細胞の増殖、癌発生の顕著な特徴、または例えば神経変性疾患において見られるような時期尚早の細胞死につながることができる。翻訳調節の分子基盤について知られていることの多くは、密度勾配分画システムを用いてポリソーム分析から得られた。この手法は、線形スクロース勾配上で細胞質抽出物の超遠心分離に依存しています。回転が完了すると、システムは、異なる翻訳に対応し、遠心分離ゾーンの分画および定量化は、このようにポリソームプロファイルをもたらす、リボソーム集団を可能にする。ポリソームプロフィールの変化は、ストレスの種々のタイプに応答して生じる翻訳開始の変化や欠陥の指標である。この技術は、目を評価することができ電子翻訳開始の特定のタンパク質の役割、および特定のmRNAの翻訳活性を測定する。ここでは、正常または応力のいずれかの培養条件で、真核細胞および組織の翻訳開始を評価するために、ポリソームプロファイルを実行するために我々のプロトコルが記載されている。

前述のように、ポリソームプロフィールはストレス条件下で翻訳開始の変化の分析を可能にする。 図1は、前述のように、翻訳開始の簡略図が翻訳開始複合体の順序付けられたアセンブリーを含む多段階プロセスである。正常な成長条件下で、翻訳開始複合体は、その検出ソームプロファイルによる活性翻訳開始のための証明（;未処理図2）ポリリボソームに変換される。ストレス条件下しかしながら、翻訳開始は、80Sモノソームやポリソームの蓄積のピークの減少（;プロテアソームインヒビター図2）で得られたブロックされている。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51164/51164fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51164/51164fig1.jpg" width="500px" /> <str...

ここでは、ストレス条件に応答する真核細胞のmRNA翻訳の開始の変化を分析するための方法を記載している。このメソッドは、非翻訳リボソームからリボソームを翻訳するショ糖勾配に速度の分離に基づいています。

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

この手順の目的は、ポリソームプロファイリングを用いて、哺乳類細胞および組織における翻訳開始にストレス条件が及ぼす影響を測定することです。まず、哺乳類がん細胞を抗がん剤で処理し、次に細胞抽出液を調製します。第2のステップでは、ショ糖勾配を作成します。次に、細胞抽出液をショ糖密度勾配にロードし、超遠心分離を行ってリボソーム画分を分離します。最終的に、特異的抗体を用いたウェスタンブロット解析を行い、標的タンパク質とポリソームの結合を評価します。代謝標識などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、翻訳の開始段階に対するストレス条件の影響を評価できる点にあります。この手法は、抗がん剤が翻訳開始に影響を与えるか、またどのように影響するかといった、ストレス治療分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の意義は、翻訳開始の新たな調節経路の解明に寄与するため、がん治療にまで及びます。本手法は、細胞培養における翻訳開始調節への知見を提供できるだけでなく、脳や腫瘍などの単離組織を含む他の系にも適用可能です。自動密度勾配分画システムの準備として、まず装置のチューブシステムを0.1% SDSで5分間洗浄します。次に、チューブシステムを70% ethanolで5分間洗浄し、続いてRNA Zap溶液で5分間洗浄します。最後に、DEPC処理水を用いて洗浄し、空気を送り込むことでチューブシステムを乾燥させます。次に、15%および55%のスクロース溶液を調製し、ISCO社製model 60グラジエントフォーマーを用いて15～55%の直線的なスクロース密度勾配を作成します。メーカーの指示に従い、グラジエントメーカーのプログラム実行中に勾配内に気泡や乱流が生じないよう、ペリスタルティックポンプの速度を慎重に制御することが重要です。超遠心機を4 °Cまで冷却してください。作成した密度勾配は、使用時まで4 °Cで保持します。本実験では、あらかじめ播種し、コンフルエンシーが80%に達したHeLa子宮頸がん細胞（低継代）を使用します。実験当日。新鮮な細胞から抽出を行うこと、および本手順中のRNA汚染を避けることが重要であるため、抗がん剤を添加する90分前に、細胞の培地を新鮮な完全培地に交換する。翻訳を刺激するため、細胞をインキュベーターに戻す。コントロールとして、抗がん剤を細胞培養液に直接添加します。DMSOで37°C、5% CO2条件下で4時間インキュベートします。4時間後、プレートを氷上に置き、冷PBSで細胞を3回洗浄します。最良の結果を得るため、1 mLのライシスバッファーで細胞を回収します。各実験条件につき、約12 million個の細胞を使用してください。スクレイピングしたプレートから細胞をエプンドチューブに移し、シリンジを用いて15回繰り返しパスすることで十分に混合させます。細胞溶解物を氷上で15分間静置します。次に、細胞溶解物を数滴スライドガラスに滴下し、10倍の対物レンズを用いた位相差顕微鏡で細胞の溶解状態を確認します。細胞溶解が確認されたら、4°Cで20分間、11,000 Gsで遠心分離を行い、細胞溶解液を清澄化します。ポリリボソームを含む可溶性溶解液を新しいチューブに移し、細胞質抽出物をショ糖密度勾配にロードするまで氷上に保持します。分光光度計を用いてRNA濃度を測定し、約20 OD₂₆₀単位の抽出物を15〜55%ショ糖勾配に慎重かつゆっくりとロードします。遠心分離中にチューブから液が溢れるのを防ぐため、チューブの表面に2〜3 mmの空きスペースがあることを確認してください。チューブをローターにセットします。ローターを超遠心機に設置し、密度勾配を 230,000 G、4 °Cで2時間30分間遠心分離します。遠心分離が完了したら、チューブを取り出し、勾配を乱さないように注意して氷上に置きます。細胞質抽出液の分画を開始するには、ショ糖密度勾配を自動密度分画装置にセットし、製造元の指示に従って自動分画および分画回収を行います。勾配分画操作と並行して250 nmでの吸光度を継続的にモニタリングしながら、0.5 mLずつの分画を個別のeinorチューブに回収します。ポリリボソームプロファイルは、各ランの終了時にチャートペーパーに記録されます。回収した分画の入ったエンドチューブを氷上に移動させます。この手順を開始するために、各回収分画に2倍量の100%冷エタノールを加え、RNAタンパク質複合体を-20°Cで一晩沈殿させます。タンパク質を抽出するには、各RNAタンパク質沈殿物を70%エタノールで洗浄し、風乾させた後、4°Cで11,000 Gで20分間遠心分離し、沈殿物を再懸濁させます。SDS-PAGEサンプルバッファー。RNA抽出のためのウェスタンブロット解析に進む前に、各RNAタンパク質沈殿物を0.1% SDSを含む溶解バッファーに懸濁させ、沈殿物のタンパク質成分を2 mg/mLのproteinase Kで30分間消化します。55 °Cの水槽中で、1 volumesのフェノール・クロロホルム、2 volumesのクロロホルム、および0.1 volumeの2 M 酢酸ナトリウム（pH 4）を加えます。その後、氷上で15分間静置します。4°Cで20分間、10,000 Gで遠心分離します。得られた各サンプルの水相を回収し、1等量のイソプロパノールと0.2 µg/µLのグリコーゲンを加えて、-20°Cで一晩静置してRNAを沈殿させます。翌日、沈殿物を4°Cで1時間、10,000 Gで遠心分離します。上清を除去し、RNAペレットを70%冷エタノールで洗浄した後、少量のRNA用超純水でRNAペレットを再懸濁させます。分光光度計を用いて、RNAの量と質を評価します。ここに示すのは、細胞質抽出物から得られた代表的なポリソームプロファイルである。これらは、通常条件で培養したHeLa細胞、またはプロテアソーム阻害剤で4時間処理したHeLa細胞から調製され、15～55%（w/v）の線形ショ糖密度勾配を用いて遠心分離されたものである。各プロファイルにおいて、40 Sリボソーム、60 Sリボソーム、80 Sモノソーム、およびポリソームの位置が示されている。勾配の上部から下部までの画分が左から右に示されています。回収した画分を、大型リボソームタンパク質L 28およびポリソーム結合タンパク質FMRPに対する抗体を用いてウェスタンブロットで分析しました。これらは、通常の増殖条件下におけるポリソームの完全性のコントロールとして機能します。翻訳開始複合体はポリリボソームへと変換され、ここに見られるように、ポリソームプロファイリングによる検出は翻訳開始が活性であることを示しています。プロテアソーム阻害剤による処理は、ポリソームピークを減少させ、同時に80Sモノソームを増加させており、これは翻訳開始の抑制を示しています。この手順を行う際は、RNaseフリーの環境で作業し、勾配を慎重に取り扱い、細胞溶解を制御することが重要です。特定のタンパク質やmRNAのポリソームとの結合が、抗がん剤治療の実施後にどのように影響を受けるかといった追加の疑問を解決するために、ウェスタンブロッティングやノーザンブロッティングなどの他の手法を実施することができます。この技術の開発により、がんや神経変性疾患などのヒト疾患における翻訳開始因子の調節の影響を探索するための、翻訳制御分野の研究者に道が開かれました。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

この記事では、真核細胞からリボソームを翻訳するの抽出のためのプロトコルについて説明します。解凍したら、リボソームが異なるリボソーム集団を分析できるようにショ糖密度勾配分画によってmonosomesとpolyribosomesに分かれています。このように、このメソッドは、翻訳の調節を調べるためのゴールドスタンダードです。...

真核生物のポリリボソームプロファイル解析

リボソームはタンパク質合成の中心的な役割を果たしている。ショ糖密度勾配遠心分離によりポリリボソーム（ポリソーム）分画は、ゲノムワイドな規模での個々のmRNAの翻訳効率の直接測定を可能にする。さらに、この方法は、シャペロンおよびシグナル伝達分子としてのリボソーム及びポリソーム関連因子の生化学的分析のために使用することができる。...

ゲノム規模で哺乳類Translatomesのソーム分画および分析

細胞がストレスに適応する能力は、彼らの生存にとって非常に重要です。mRNA翻訳の制御は、プロテオームの迅速な制御を可能にする適応戦略の1つです。ここでは、ストレス条件下で選択的に翻訳される特定のmRNAを同定するための標準化されたポリソームプロファイリングプロトコルを提供します。...

ポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNAの翻訳の評価

このプロトコルは、結合したリボソームの数に基づいて植物組織から転写物を抽出し、分画する簡単な方法を説明しています。これにより、翻訳活性の全体的な推定と、特定のmRNAの翻訳状態の決定が可能になります。...

工場ポリソームプロファイリングのための簡単​​な方法

翻訳制御蛋白質量の制御に重要な役割を果たしています。ここでは、我々...

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

体外の能力を計測する Toeprinting の目的は、リボソームさまざまな条件の下でフォームの翻訳開始複合体に RNA を転写しました。このプロトコルは toeprinting 哺乳類の RNA のための方法を記述してキャップ依存、IRES...

哺乳類の Mrna の翻訳開始複合体形成の Toeprinting 分析

ポリソーム プロファイリング技術の全体的な目標は、タンパク質合成時に個々 の mRNAs のトランスクリプトーム Mrna...

リーシュ マニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

哺乳類の脳の発達には、翻訳のレベルでの遺伝子発現の適切な制御が必要です。ここでは、発達中の脳におけるmRNAの翻訳状態を評価するための、組み立て易いショ糖勾配および分画プラットフォームを備えたポリソームプロファイリングシステムについて説明する。...

ポリソームプロファイリングを用いたマウス脳の発達における翻訳の解析

生きた酵母や哺乳動物細胞におけるホルムアルデヒド架橋を用いた翻訳(タンパク質生合成)複合体を迅速に安定化させる技術を紹介する。このアプローチにより、一過性の中間体と動的RNA:タンパク質相互作用の解剖が可能になります。架橋された複合体は、深いシーケンシングベースのプロファイリング方法、顕微鏡、質量分析など、複数のダウンストリームアプリケーションで使用できます。...

真核細胞からのトランスレーショナル複合体の迅速な インビボ 固定と分離

このプロトコルでは、自動グラジエントメーカーやグラジエント分画システムを使用せずにポリソームプロファイルを生成する方法について説明します。...

グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング

ここで紹介するプロトコールは、ショ糖密度勾配遠心分離により 、シロイヌナズナからトランス ラトーム、リボソームに関連するmRNAを非ポリソームおよびポリソームRNAに単離するためのポリソームプロファイリングを含みます。この方法は、熱ストレスを受けた...

ポリソームプロファイルを用いた熱ストレス下での翻訳効率試験

学ぶポリソームプロファイリングによるストレス条件下での翻訳開始解析法。哺乳類細胞を用いてリボソーム分画を分離し、タンパク質のポリソーム結合をウェスタンブロットで評価します。この手法は翻訳制御メカニズムの解明に有用です。

ポリソームプロファイリングによってストレス状態の間に翻訳開始の分析

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