ポリソームプロファイリングによってストレス状態の間に翻訳開始の分析
May 19th, 2014
ここでは、ストレス条件に応答する真核細胞のmRNA翻訳の開始の変化を分析するための方法を記載している。このメソッドは、非翻訳リボソームからリボソームを翻訳するショ糖勾配に速度の分離に基づいています。
この手順の全体的な目標は、ポリソームプロファイリングによって哺乳類の細胞および組織の翻訳、開始に対するストレス条件の影響を測定することです。これは、最初に哺乳類のがん細胞を抗がん剤で治療し、次に細胞抽出物を調製することによって達成されます。2番目のステップは、スクロース、グラデーションを作成することです。
次に、細胞抽出物をスクロースにロードし、グラジエントし、超遠心分離してリボソーム画分を分離します。最終的には、特異的抗体を用いたウェスタンブロット分析を行い、試験したタンパク質とポリソームとの関連を評価します。代謝標識のような既存の方法のこの手法の主な利点は、翻訳の開始ステップに対するストレス条件の影響を評価できることです。
この方法は、抗がん剤が翻訳開始に影響を与えるかどうか、またどのように影響するかなど、ストレス治療分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の意味は、翻訳開始の新しい調節経路を明らかにするのに役立つため、癌治療にまで及びます。この方法は、細胞培養における翻訳開始制御に関する洞察を得ることができますが、脳や腫瘍などの単離された組織などの他のシステムにも適用できます。
最初に自動密度勾配分画システムを準備するには、装置のチューブシステムを0.1%SDSで5分間洗浄します。次に、チューブシステムを70%エタノールで5分間洗浄し、続いてRNA Zap溶液を5分間洗浄します。そして最後に、DEPC、水を使用して、システムに空気を送り込むことにより、チューブシステムを乾燥させます。
次に、15%および55%ショ糖溶液を調製し、ISCOモデルone 60グラジエントフォーマーを使用して線形15〜55%ショ糖グラジエントを生成します。メーカーの指示に従って、グラジエントメーカープログラムが実行中にグラジエントに気泡や乱流が発生しないように、トリスペリスチューブポンプの速度を慎重に制御することが重要です。この実験は、以前に80%のコンフルエンスに達するようにめっきされた低通過ヘロ子宮頸がん細胞を利用するまで、勾配を摂氏4度に保ちます。
実験当日。この手順では、新鮮な細胞から抽出を行い、抗がん剤を追加する90分前にRNA汚染を避けるために、細胞の培地を新鮮で完全な培地に置き換えることが重要です。翻訳を刺激するには、細胞をインキュベーターに戻します。
DMSOを摂氏37度、4時間後に5%二酸化炭素で4時間インキュベートし、プレートを氷の上に置き、1ミリリットルの溶解緩衝液で冷たくPBS採取細胞で細胞を3回洗浄すると、最良の結果が得られます。各実験条件に約1,200万個の細胞を使用します。
掻き取ったプレートからアイノールチューブに細胞を移し、シリンジに15回通してよく混合します。細胞ライセートを氷の上で15分間休ませます。次に、数滴の細胞溶解物をスライドに置き、10倍対物レンズを使用した位相コントラスト顕微鏡で細胞溶解を評価します。
細胞溶解が検証されたら、摂氏4度で20分間、11, 000Gで遠心分離することにより、細胞溶解物を清澄化します。ポリリボソームを含む可溶性ライセートを新しいチューブに移し、氷上に置いてから、細胞質抽出物をショ糖勾配にロードします。分光光度計を使用して存在するRNAの濃度を慎重に測定し、抽出物の約20 OD、2つの60ユニットを15〜55%のショ糖勾配にゆっくりとロードします。
遠心分離中にチューブがオーバーフローしないように、チューブの表面に2〜3ミリメートルの空きスペースがあることを確認してください。チューブをローターにロードします。ローターを超遠心分離機に載せ、摂氏4度で230、000Gの勾配を2時間30分間遠心分離します。
遠心分離が完了したら、チューブを取り外し、勾配を乱さないように慎重に氷の上に置きます。細胞質抽出物の分画を開始するには、ショ糖グラジエントを自動密度分画システム上に配置し、メーカーが説明したように自動分画とフラクションの収集を進めます。各0.5ミリリットルのフラクションを個々のアイノアチューブに収集し、グラジエント分画操作と並行して250ナノメートルでの吸光度を連続的に監視すると、ポリリボソームプロファイルは各実行の終わりにチャート紙上で編集されます。
フラクションを集めたエンドチューブを氷上に移します。この手順を開始するには、収集した各画分に2容量の100%冷エタノールを加え、RNAタンパク質複合体をマイナス20°Cで一晩沈殿させます。タンパク質の抽出のためには、70%エタノールで空気乾燥させた洗浄後、各RNAタンパク質沈殿物を摂氏4度で20分間11, 000Gで遠心分離し、沈殿物を再懸濁します。
RNA Resusの抽出のためのウェスタンブロット分析に進む前に、各RNAタンパク質沈殿物を0.1%SDSを含む溶解バッファーに懸濁し、沈殿物のタンパク質成分を2ミリグラム/ミリリットルのプロテイナーゼKで30分間消化します。摂氏55%の水浴で、フェノールクロロホルムの1つの容量、クロロホルムの2つの容量と2モルの酢酸ナトリウムpH 4の0.1容量を追加します。氷の上で15分間休ませます。
10, 000 GS で摂氏 4 度で 20 分間遠心分離します。1容量のイソプロパノールとグリコーゲン1マイクロリットルあたり0.2マイクログラムを添加し、摂氏マイナス20度で一晩放置することにより、各サンプル沈殿物RNAの水相を収集します。翌日、1時間、摂氏4度で10, 000Gで沈殿物を回転させます。
上清を取り除き、RNAペレットを70%冷たいエタノールで洗浄し、RNAペレットを少量のRNAに再懸濁します。無料の水。分光光度計を使用してRNAの量と質を評価します。
ここに示されているのは、細胞質抽出物からの代表的なポリソームプロファイルです。正常な状態で、またはプロテアソーム阻害剤による4時間の処理後に増殖したhelo細胞から調製し、15〜55%の容量で遠心分離して線状ショ糖勾配を重み付けします。40 sリボソーム60 s、リボソーム80 s、モノスおよびポリソームの位置は、各プロファイルに示されている。
グラジエントの上から下までの画分を左から右に示しています 大きなリボソームL28タンパク質に対する抗体、および通常の増殖条件下でポリソーム完全性のコントロールとして機能するポリソーム関連タンパク質FMRPを使用して、ウェスタンブロットによって画分を収集および分析しました。翻訳開始複合体は、ポリリボソームに変換され、ポリソームプロファイリングによる検出は、ここで観察されるようにアクティブな翻訳開始をテストします。プロテアソーム阻害剤による治療は、ポリソームのピークを減少させ、それに伴ってDS Monosが増加し、翻訳開始の阻害を示します この手順に参加している間、勾配を慎重に処理し、この手順に従って細胞溶解を制御するために、r naseのない環境で作業することが重要です。
西洋の血液や北の血液などの他の方法は、特定のタンパク質やポリソームとのM MNAとの関連が抗癌治療によって影響を受けるような追加の質問に答えるために実行することができますその開発後。この技術は、アリー翻訳の分野の研究者が、癌や神経変性疾患などのヒト疾患における翻訳開始因子の調節の影響を調査する道を開きました。
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概要
この記事では、真核細胞におけるmRNA翻訳の開始に対するストレス条件の影響を分析する方法について説明しています。この技術は、翻訳中のリボソームと非翻訳中のリボソームを分離するためにショ糖勾配遠心分離によるポリソームプロファイリングを含みます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 翻訳メカニズム
背景
- mRNA翻訳の理解は、ストレスに対する細胞応答を研究する上で重要です。
- ポリソームプロファイリングは、翻訳開始を評価するための強力な技術です。
- ストレス条件は哺乳類細胞におけるタンパク質合成に大きな影響を与えることができます。
- 代謝ラベリングのような従来の方法は、翻訳開始を評価する上で限界があります。
研究の目的
- 哺乳類細胞における翻訳開始に対するストレスの影響を測定すること。
- リボソーム活性の分析に用いられる既存の方法を改善すること。
- ストレス下での翻訳を研究する研究者向けの詳細なプロトコルを提供すること。
使用された方法
- 抗がん剤で哺乳類がん細胞を処理すること。
- 処理された細胞から細胞抽出物を調製すること。
- リボソーム分離のためのショ糖勾配を作成すること。
- リボソームフラクションを分離するために超遠心分離を行うこと。
- ポリソームとタンパク質の関連性を評価するためにウェスタンブロット分析を実施すること。
主要な結果
- この方法は、翻訳中のリボソームと非翻訳中のリボソームを効果的に分離します。
- ストレス条件は翻訳の開始を変化させることが示されました。
- ウェスタンブロット分析により、特定のタンパク質とポリソームの関連性が確認されました。
- この技術は、ストレスに対する細胞応答に関する洞察を提供します。
結論
- 記述された方法は、ストレス下での翻訳開始を研究するための価値あるツールです。
- 従来の代謝ラベリング技術に比べて利点があります。
- 将来の研究は、この方法を基にして細胞の様々なストレス応答を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Polysome profiling enables biopharma teams to interrogate translation initiation dynamics under stress, a critical inflection point for understanding cellular adaptation and therapeutic response. This method provides predictive confidence in target validation by quantifying translational changes in response to drug treatment or disease-relevant stressors. Its application supports risk-adjusted portfolio decisions by clarifying mechanistic effects on protein synthesis pathways implicated in oncology and neurodegeneration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct assessment of translation initiation in response to candidate therapeutics or stressors.
- Supports mechanistic de-risking by revealing pathway-specific effects on ribosome engagement.
- Facilitates functional target validation through quantitative polysome profile shifts.
- Provides evidence for prioritizing targets based on translational control mechanisms.
Screening & Assay Development
- Establishes validated biological systems for downstream compound screening.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of ribosomal activity for assay standardization.
- Enables detection of compound-induced changes in translation initiation efficiency.
- Supports scalable profiling across cell lines and tissue types for platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Aligns translational biomarker discovery with disease-relevant stress responses.
- Maintains continuity from in vitro discovery to preclinical tissue analysis.
- Informs risk-adjusted advancement by linking molecular mechanism to phenotypic outcome.
- Provides predictive de-risking for late-stage biological liabilities.
Pipeline & Workflow Integration
Polysome profiling integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational validation in disease models.
- Discovery Biology: Quantifies translation initiation to clarify pathway engagement and biological de-risking.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative profiles for compound evaluation and assay readiness.
- Analytics: Generates absorbance-based ribosome distribution data and protein association outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Extends to tissue-level profiling for biomarker alignment and disease relevance.
- Enterprise Reuse: Adaptable across cell lines, tissues, and stress paradigms for broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in translation control.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible workflows for cross-team implementation.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of assets with translational liabilities.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ribosome biology, ultracentrifugation, and RNA/protein analytics.
- Demands access to automated density gradient fractionation and western blot infrastructure.
- Necessitates rigorous RNase-free technique and cross-team standardization for reproducibility.
- Adaptable to diverse model systems, including cell lines and primary tissues.
- Careful gradient handling and lysis control are essential for data integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:45
Preparation of the Density Gradient Fraction System and Sucrose Gradients
3:04
Preparation of Cell Extracts
5:10
Loading Extracts onto Sucrose Gradients and Ultracentrifugation
6:03
Fractionation of Cytoplasmic Extracts for Polysome Profiling
6:46
Extraction of Protein and RNA for Analysis
8:45
Results: Polysome Profiling Detects Changes in Translation Initiation in Response to Stress Conditions
10:01
Conclusion
