Name: 減少イトラコナゾール濃度および期間は、治療するのに成功している Batrachochytriumのdendrobatidis両生類の感染 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-14T18:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: 学ぶ、Batrachochytrium dendrobatidisに感染した両生類の治療法。イトラコナゾールの低濃度・短期間（0.0025%、6日間）治療が有効で、従来法より副作用と死亡率を低減できる。QPCRで効果を確認する。

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私は中の助けを実験計画を概念と素材を支援、治療レジメンと剖検を確立する助けA. Pessier分析し、MWHチャットフィールド、MJ Robak、K.タスカーとDレンゲルヘルプCLリチャーズ-Zawackiに感謝したいと思います研究室や撮影中にそのスペースを使用するためのサポートとタロンガ動物園でのM·マクファデンとP.ハーロウ。プロジェクトは、部分的に、LA Brannellyに授与ルイジアナ州環境教育委員会の許可を経てライフ·テクノロジーズによって野生生物水産ルイジアナ州省によって資金を供給された。

倫理承認：本研究は、そのメソッドは、チューレーン大学の動物への使用、およびケア委員会（。プロトコルなし0407）によって承認された。 1。 Bdの感染症の検査<ol><li> BD用拭き取り<ol><li>無菌綿棒で綿棒動物ventrumに5回、各太もも、それぞれの側、および45ストロークの合計各肢に5回。拭き取りは両生類の皮膚にBD用のサンプリングの非侵襲的な方法である。 </li><li>静かに、DNAの最大量を綿棒で収集されていることを確認するために、ストロークの際との間で綿棒を回転させます。 </li><li> -20℃で1.5ミリリットルマイクロチューブに保管して綿棒</li></ol></li><li> DNA抽出および定量PCRアッセイ<ol><li>動物の組織のための取扱説明書に従って、市販のDNA単離キットを使用してスワブからのゲノムDNAを抽出する。 </li><li>ボイル以下の定量的リアルタイムPCR（定量PCR）を用いて抽出したDNAを分析する<eM&gt;ら17、以下の変更を加えて。： </li><li> DNA抽出サンプルを二重脱イオン水で1:10に希釈する。 </li><li> PCR阻害を防止するために、ウシ血清アルブミン（BSA）0.7μlを添加する。 </li><li> PCR阻害が結果に影響を与えていなかったことを確認するために、各サンプル中の内部陽性対照を含める。 </li><li>正と負の制御と遊走子（感染症）の負荷を推定するための希釈一連の標準を使用して実行サンプル。 </li></ol></li></ol> 2。接種<ol><li>文化のBd <ol><li> （40分間121°C）オートクレーブ処理し、冷却させ、1 Lの逆浸透水または脱イオン水に、10gのトリプトンを添加することによってトリプトンブロスを調製する。一度23℃に冷却し、1ミリリットルのペニシリン - ストレプトマイシンを追加します。 </li><li> Bdの株 （J. LongcoreからJEL411、PhyllomedusaキツネザルからGuabal、パナマから単離された）、23℃で7日間、リプトンブロスで成長</li></ol></li><li> Bを転送リプトンと寒天平板にロス文化。 <ol><li>プレートを作るために、1Lの逆浸透または脱イオン水、オートクレーブ（40分間121℃）に10グラムのトリプトンと10グラム寒天を加える。 </li><li>オートクレーブ処理した混合物を、層流フードでは、タッチするのに十分なクールですが、それは凝固する前に、ペトリ皿に入れ、フル1/4-1/3たら。 </li><li>寒天が完全に凝固し、冷却したときに、各プレートに0.5ミリリットルのBdブロスを追加し、プレートの周りに均等に分散。乾燥することができます。 </li><li>プレートは 、BD の遊走子、パラフィルムでシールプレートを接種したら。 </li><li>プレートは5〜7日、23℃でインキュベートすることができます。接種前に実行可能性を確保するために運動を遊走子確認してください。 </li></ol></li><li>遊走子接種ソリューションの洪水プレート<ol><li> Bdのインキュベーションおよび成長の5〜7日後に、エージング水道水5mlで各プレートをあふれさせると遊走子を10分間メディアを入力することができます。 </li><li>遊走子suspeを注ぐポータブル容器にnsion。 </li><li>血球計数器で遊走子濃度を推定。 </li><li>高齢者水道水で3ミリリットル当たり1×10 6の濃度に混合物を希釈。 </li></ol></li><li>動物に接種<ol><li>個々の50ミリリットルの容器では、そのventrum上で3ミリリットルの接種液を注ぐことにより、各動物に接種。余分な接種物接種用容器の底に滴下することができます。 </li><li>各動物には感染を確実にするために24時間接種容器内に残ります。 </li><li>接種の24時間後に、個々の消毒をterrariaに動物を戻す。 </li><li>感染は2週間用にビルドすることができます。綿棒と定量PCRの結果の感染を確認し、治療を開始。 </li><li> BD-ネガティブコントロールの場合、5ミリリットルと洪水BD-フリーの寒天プレートは、上記と同じ方法を使用して、水道水、かつモック接種動物歳。 </li></ol></li></ol> 3。治療計画<ol><li> PREPA処理槽の再<ol><li> 1Lの両生類リンゲル液（ - 最小有効治療濃度0.0025％のイトラコナゾール）に2.50ミリリットルの水イトラコナゾール（1％イトラコナゾール内用液）を追加します。 <ol><li>両生類リンゲル溶液レシピ：1 Lの逆浸透水または脱イオン水、6.6グラムの塩化ナトリウム、0.15グラムの塩化カリウム、0.15グラムの塩化カルシウム、および0.2グラムの重炭酸ナトリウム。オートクレーブ溶液（40分間121°C）し、室温まで冷却する。 </li><li> 0.01％イトラコナゾール処理濃度については、1Lの両生類リンゲル液に10.00ミリリットル水イトラコナゾール（1％イトラコナゾール内用液）を追加</li><li> 0.005％イトラコナゾール処理濃度については、1Lの両生類リンゲル液に5.00ミリリットルの水イトラコナゾール（1％イトラコナゾール内用液）を追加します。 </li></ol></li><li> BD-陽性およびBD-ネガティブコントロールの場合、無イトラコナゾールと両生類のリンゲル液中の動物を入浴。 </li></ol></li><li>治療&lt;OL&gt; <li>処理液の35ミリリットルで消毒50ミリリットルの容器内の個々の両生類を配置します。 </li><li>動物が完全に静かにコンテナを回転させることによって5分間カバーされていることを確認してください。 </li><li>消毒しterrariaに動物を返します。 6日間繰り返します。 </li></ol></li><li>治療の成功を確実にする<ol><li>日間の治療上のBd感染の試験動物が始まる。 </li><li>テスト1週間の治療が終了した後のBd感染の動物、および感染がクリアされたことを確認するために4週間、週に一度。 </li></ol></li></ol>バイオハザードとして4、BD <ol><li>個々のterrariaを毎週消毒。 <ol><li> 10％の漂白剤溶液浴中terrariaと治療コンテナを浴びる。 </li><li>流水で二回、各漂白コンテナを洗浄します。 </li><li>容器は再使用する前に24時間乾燥させます。 </li></ol></li><li>クリーンニトリル手袋を着用し、交差汚染を防ぐために、動物を取り扱う際Bdは病原体の。各動物の取り扱いの間に手袋を変更します。 </li><li> 10％の漂白剤の解決策をもたらすことにより、廃棄前に、すべての液体廃棄物を消毒する。 </li><li>可能性のある廃棄前にBdのにさらされているすべての固形廃棄物をオートクレーブ。 </li></ol>

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<li>Martel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+safe+antifungal+treatment+protocol+to+eliminate+Batrachochytrium+dendrobatidis+from+amphibians%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Developing a safe antifungal treatment protocol to eliminate Batrachochytrium dendrobatidis from amphibians.</a> Med. Mycol. 49 (2), 143-149 (2011).</li>
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<li>Young, S., Speare, R., Berger, L., Skerratt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloramphenicol+with+fluid+and+electrolyte+therapy+cures+terminally+ill+green+tree+frogs+%28Litoria+caerulea%29+with+chytridiomycosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Zoo+Wildlife+Med%22%5BJournal%5D)">Chloramphenicol with fluid and electrolyte therapy cures terminally ill green tree frogs (Litoria caerulea) with chytridiomycosis.</a> J. Zoo Wildlife Med. 43 (2), 330-337 (2012).</li>
</ol>

著者は、競合する経済的利益を宣言していません。

このプロトコルを用いて、我々は、安全かつ効果的に両生類でBdのためのイトラコナゾール処置の治療投与量と時間を削減することができた。最低治療用量および時間（6日間0.0025％）は無症状感染Iについて治療の成功だったnebulifer。低用量と治療時間の両方の有効性は、両生類のすべての種と年齢のクラスに使用すべき安全かつ効果的な治療法はまだありませんように 、BD 感染治療のための臨床治療試験の必要性を示しています。 イトラコナゾール処理から生じる死因は、この点11で不明である。剖検および組織病 ​​理学は、中または直後Brannelly らで治療期間後に死亡した個体の小さなサブセットを行った。15研究。それは動物が死亡していないことは明らかであるが、これらの分析の結果は、死因に関して決定的だったツボカビの。適度な自己分解は、治療群間の微妙な違いを検出するために我々の能力に影響を与えた可能性があり、死亡と試料の保存の...

両生類は現在、すべての脊椎動物の分類群1の生物多様性の最大の下落を経験している。ツボカビ、ツボカビ真菌病原体Batrachochytriumのdendrobatidis（BD）によって引き起こされる皮膚病、これらの劇的な下落2の主要な原因の1つであるBdは生物多様性の損失を生じさせるための記録最悪病原体である：それは両生類の600以上の種に感染し、持ってできるだけ多く200種が絶滅危惧または2,3絶滅したそのうちの300種以上の減少を引き起こした。両生類ツボカビ菌は、特定のホストされていない、それは 、BD 感染が深刻な病気を引き起こす進行するためにホストの資質が許すかは不明である。ツボカビは、電解質の損失および心不全4で得られた、皮膚におけるイオンチャネルを破壊することによって死を引き起こす。また、（何のBdの遊走子を含まない） のBd上清オタマジャクシ5最先端レベルの免疫応答を引き起こすGの研究者は 、BD は 、副生成物6毒性を生産信じています。 多くの種が急速に減少しているため、キャプティブ保証コロニー繁殖プログラムは、重要な保全対策であり、いくつかの種のための唯一の生命線である。確立し、無病コロニーを維持することは両生類管理施設のための挑戦である。 Bdの感染症を治療するための現在の化学療法の方法は、有効であるが、治療される動物に有害であることができ、単一の治療法は、種および両生類7歳クラスの両端に成功しなかった。 Bdの感染の治療のいくつかの臨床試験では、07行われている。治療の三最も一般的に使用される方法は、温熱療法、クロラムフェニコールおよびイトラコナゾールである。温熱療法は、ほとんど副作用を有すると思われるnonchemotherapeutic治療選択肢である複数のライフステージで使用することができ、GENERである同盟国効果的。治療試験では、チャットフィールドとリチャーズ- Zawacki 8は、処置した動物の96％が10日間30°Cに収容された後、感染をクリアしていたことが分かった。この試験は100パーセント成功しませんでしたが、それは他の人が自分の種のための温熱療法を評価するためのベースラインを提供しています。温熱療法は、多くの種に有効であるが、長時間にわたって高温に留まることができない多くの高山種について非実用的である。クロラムフェニコール、抗菌性は、多くの種でのBdを治療するために成功裏に使用され、 インビトロでの真菌の成長を阻害されている。抗菌ように、クロラムフェニコールは、具体的には真菌を攻撃しないが、真核細胞9においてアポトーシスを引き起こすことが知られている。これは、作用の正確なメカニズムは不明であるが、クロラムフェニコール療法は、細胞内の胞子を死滅させる、皮膚におけるアポトーシスを引き起こすことが推測されている。臨床試験は行われないので、したが用量および治療 ​​時間が評価されておらず、現在の治療プロトコルは、典型的には、地上両生類のためのこの治療は実用的でない、2〜4週間10,11のための浸水を必要とする。ヒトへの暴露は、再生不良性貧血12のまれな形態と関連していたので、クロラムフェニコールはまた、獣医学的使用のためのいくつかの国で制限されています。 イトラコナゾール、アゾール系抗真菌は、最も広く飼育されている両生類のBd感染の治療のために使用される。最も広く使用されるプロトコルは、5分11日間連続日の0.01％イトラコナゾール溶液中に入浴動物である。このプロトコルは、両生類のために有効であるが、それは両生類11,13での臨床試験に基づくものではない、哺乳動物への投与に使用される基準に由来した。このプロトコルは、特に属ラナにし、オタマジャクシ、最近metamorphs 11で、特定の種の負の副作用を引き起こす可能性があります。オタマジャクシ処理は、イトラコナゾールのはるかに低い濃度（0.0005％）を用いて成功しているが、脱色14と関連していた。これと同じ濃度は、最近のmetamorphsでトライアルが行われ、感染15の治療に失敗したことが判明した。イトラコナゾール治療によるマイナスの副作用の危険性がありますので、いくつかの専門家は、11日間連続して1の半分の通常の濃度（0.005％）を使用し、これが BD 感染の16を硬化させることに成功したことが判明しました。 本研究では 、BD 感染 15を治療するためのイトラコナゾールを使用して臨床治療試験の要約である。プロトコルは、イトラコナゾールの BD感染動物の治療のための安全かつ効果的である最低用量や治療時間を見つけるための試みを説明しています。本研究で使用した動物は、湾岸のヒキガエルの最近のmetamorphs、Incilius nebuliferた。

<table><tbody><tr><td>0.1%水性イトラコナゾール、Sporonox</td><td>Janssen Pharmaceutica Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>S640-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP510-100</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</sub</td><td>>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>滅菌綿棒</td><td>医療およびワイヤー機器</td><td>MW113</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml マイクロチューブ</td><td>Sarstedt</td><td>73.703.217</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNEasy 血液および組織キット</td><td>Qiagen</td><td>69581</td><td></td></tr><tr><td>7500 リアルタイム PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351104</td><td></td></tr><tr><td>VIC IPC</td><td>Applied Biosystems</td><td>4308323</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM2618</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Invitrogen</td><td>30391023</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>Invitrogen</td><td>Q10029</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>Σ Aldrich</td><td>CLS430589</td><td></td></tr></tbody></table>

減少イトラコナゾール濃度および期間は、治療するのに成功している<em&gt; batrachochytriumのdendrobatidis</em&gt;両生類の感染

Reduced Itraconazole Concentration and Durations Are Successful in Treating Batrachochytrium dendrobatidis Infection in Amphibians

両生類は、任意の脊椎動物クラスの最大の下落を経験しているし、これらの減少の主な原因は、疾患ツボカビを引き起こす真菌の病原体、Batrachochytriumのdendrobatidis（BD）、である。キャプティブ保証コロニーが絶滅両生類で世界的に重要であり、絶滅の重大な脅威のそれらのための唯一の生命線である。無病コロニーを維持することは、キャプティブ経営者の優先事項である、まだすべての種のため、ライフステージ全体で安全かつ効果的な治療が同定されていない。一般的に使用される投与量は、いくつかの個人や種に害を及ぼす可能性があるが、最も広く使用されている化学療法は、イトラコナゾールである。我々は、イトラコナゾールの低い、より安全で効果的な投与量は、Bdの感染症を治すために見つけることができるかどうかを評価するための臨床治療の治験を行った。我々は発見した0.01から0.0025パーセント処理濃度を低下させ、11から処理時間を減少させることによって5分浴の-6日間、カエルは副作用が少ないと少ない治療に関連した死亡の BD感染の硬化させることができた。

すべての動物は、治療が終わった4週間後にBD-陰性であった場合は、イトラコナゾール治療が成功したと考えられた。治療が開始される前に、2週間接種後、全てのBD-接種した動物は、治療後4週が終了している間、BD-陽性対照動物は（16,765.12の平均遊走子負荷を持っていた、（17.34±）1,121.7の平均遊走子負荷で、感染していた）14643.08±。 Incilius nebuliferの治療（N = 15）が6日間、5分の日の0.0025％イトラコナゾール濃度のバスを使用して成功した。 （ 図1B）、多くの：BD-ポジティブコントロール（χ2,1 = 2.17、EXP（B）= 20,500、P = 0.339 Cox回帰）と比較した場合、イトラコナゾール治療のこの低濃度投与量は、死亡率に有意差は認められなかった誰は 、BDに感染した臨床試験の終了まで生存した。 <p class="jov...

両生類におけるBatrachochytriumのdendrobatidis感染が低減濃度（0.0025％）、および一般的に使用されるよりもイトラコナゾールの短い持続時間（6日間5分浴）を用いて除去することができる。以下で死亡率およびより少ない負の副作用は、この修飾治療プロトコルを用いて観察した。

減少イトラコナゾール濃度および期間は、治療するのに成功している<em&gt; Batrachochytriumのdendrobatidis</em&gt;両生類の感染

Amphibians are experiencing the greatest decline of any vertebrate class and a leading cause of these declines is a fungal pathogen, Batrachochytrium ...

本手順の全体的な目的は、両生類キトリ fungus（Bera key tridium, dendro, he または BD）に感染した両生類に対し、抗真菌化学療法剤である triazole を用いて治療することです。まず、BD の培養を行い、動物に真菌病原体を接種します。次に、皮膚スワブを用いて DNA 抽出および QPCR による検査を行い、BD への感染を確認します。次に、感染した動物を0.0025%エコナゾール溶液で1日5分間、6日間にわたって浸漬処理します。最終ステップとして、治療完了後、少なくとも4週間にわたり皮膚スワブのQPCR解析を行い、治療個体の感染状態をモニタリングして治療が成功したことを確認します。この手順は、抗真菌薬イトラコナゾールの低濃度かつ短期間の治療が、bd感染動物の治療に有効であることを示しています。推奨される治療量（0.01%イトラコナゾール溶液を11日間使用）に対する本治療法の主な利点は、推奨量の4分の1という低濃度かつ6日間という短縮された治療期間であってもBD感染の治癒に有効であり、同時に推奨治療量による負の副作用を最小限に抑えられることです。テキストプロトコルに従ってBDをトリトンブロス中でインキュベートし、Zo胞子の運動性を確認した後、各プレートに5 mLの熟成した水道水を満たし、Zo胞子が培地に進入するまで10分間待ちます。次に、Zo胞子懸濁液をポータブル容器に移します。ヘモサイトメーターを用いてZo胞子濃度を推定し、熟成した水道水で混合液を3 mLあたり1×10⁶個の濃度に希釈して、ここに示すLatoria vei Alpinaなどの動物に接種します。50 milliliterの容器の上に保持し、接種混合液3 millilitersを腹部に注ぎます。次に、接種液の流出液が入った容器に動物を入れます。容器に蓋をし、確実に感染させるため、接種容器内で動物を24時間保持します。BD病原体による汚染を防ぐため、使用済みの手袋を外し、廃棄前にオートクレーブ処理に回してください。新しい手袋を装着した後、次の動物への接種を行ってください。接種から24時間後、動物を消毒済みの個別のテラリウムに2週間戻します。2週間後、溶液を10%の漂白剤で処理し、すべての液体廃棄物を廃棄前に消毒することを忘れないでください。滅菌綿棒で動物をスワブし、BD感染が成功したかを確認します。スワブを動かす間およびストロークの合間に、ゆっくりと回転させます。腹部の左右各5回、各大腿部、および4本の肢それぞれに5回ずつ、計45回のストロークでスワブします。スワブは1.5 milliliterのマイクロチューブに入れ、minus 20 degrees Celsiusで保存してください。市販のDNA抽出キットを使用してスワブからゲノムDNAを抽出し、テキストプロトコルに記載されている通りにQPCRを実施します。テキストプロトコルに従い、イトラコナゾールの3つの投与量に対応した3つの処理浴を準備します。次に、個々の両生類を消毒済みの容器に入れます。35 mLの処理溶液を入れた50 mLの缶容器を用意します。動物を交代させる際に必ず手袋を交換することを忘れず、動物が完全に浸っていることを確認しながら、容器を時々そっと回し、5分間静置します。5分後、動物を消毒済みのエリアに戻します。5分間の処置をさらに5日間、毎日繰り返します。処置終了の1週間後、およびその後4週間にわたり週1回、動物にBD感染があるか再度検査し、感染が消失したことを確認してください。処置が完了した後でも、動物は引き続き汚染のリスクがあるものとして取り扱う必要があることに注意してください。感染後、動物は少なくとも1か月間、別のエリアに隔離して飼育する必要があります。治療が不成功に終わった場合は、再度行う必要があります。種や生活史のステージによって、感染への反応や治療法への反応が異なるため、治療を広く導入する前に試験的に実施する必要があります。BDはバイオハザードであるため、テラリウムおよび処理容器を10%漂白剤溶液で浸漬し、毎週個別のテラリウムを消毒してください。少なくとも30秒間浸漬し、水で2回すすいで漂白剤を洗い流した後、カエルの生存のために容器を24時間乾燥させてから再利用してください。ここでは、11日間のBD処理後または6日間のBD処理後の様子を示します。黒い矢印は治療の最終日を示しています。実線は対照群の生存率を示しています。黒い実線は、BD陽性であったがBD治療を受けなかった動物を示しています。また、実線のグレーの線は、BD陰性でBD治療を受けなかった動物を示しています。破線は、示された濃度のエコナゾール投与を受けた治療群の生存率を示しています。0.0025%の濃度で6日間ネブライザー投与を受けたすべての動物は、治療終了から4週間後にBD陰性となり、したがってこの治療は成功したとみなされました。さらに、この用量のエコナゾール治療による死亡率は、BD陽性対照群と比較して有意な差は見られませんでした。なお、0.01%および0.005%のエコナゾールを用いて11日間治療を行った場合、BD陽性対照群と比較して死亡率が有意に上昇したことに注意してください。真菌病原体であるBDはバイオハザードであるため、手袋の着用と交換、すべての固形廃棄物のオートクレーブ処理、および消毒などの予防措置を忘れないでください。本手順に従う際は、すべての液体廃棄物を適切に処理してください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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学ぶ、Batrachochytrium dendrobatidisに感染した両生類の治療法。イトラコナゾールの低濃度・短期間（0.0025%、6日間）治療が有効で、従来法より副作用と死亡率を低減できる。QPCRで効果を確認する。

減少イトラコナゾール濃度および期間は、治療するのに成功している

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