減少イトラコナゾール濃度および期間は、治療するのに成功している

本手順の全体的な目的は、両生類キトリ fungus（Bera key tridium, dendro, he または BD）に感染した両生類に対し、抗真菌化学療法剤である triazole を用いて治療することです。まず、BD の培養を行い、動物に真菌病原体を接種します。次に、皮膚スワブを用いて DNA 抽出および QPCR による検査を行い、BD への感染を確認します。

次に、感染した動物を0.0025%エコナゾール溶液で1日5分間、6日間にわたって浸漬処理します。最終ステップとして、治療完了後、少なくとも4週間にわたり皮膚スワブのQPCR解析を行い、治療個体の感染状態をモニタリングして治療が成功したことを確認します。この手順は、抗真菌薬イトラコナゾールの低濃度かつ短期間の治療が、bd感染動物の治療に有効であることを示しています。推奨される治療量（0.01%イトラコナゾール溶液を11日間使用）に対する本治療法の主な利点は、推奨量の4分の1という低濃度かつ6日間という短縮された治療期間であってもBD感染の治癒に有効であり、同時に推奨治療量による負の副作用を最小限に抑えられることです。

テキストプロトコルに従ってBDをトリトンブロス中でインキュベートし、Zo胞子の運動性を確認した後、各プレートに5 mLの熟成した水道水を満たし、Zo胞子が培地に進入するまで10分間待ちます。次に、Zo胞子懸濁液をポータブル容器に移します。ヘモサイトメーターを用いてZo胞子濃度を推定し、熟成した水道水で混合液を3 mLあたり1×10⁶個の濃度に希釈して、ここに示すLatoria vei Alpinaなどの動物に接種します。

50 milliliterの容器の上に保持し、接種混合液3 millilitersを腹部に注ぎます。次に、接種液の流出液が入った容器に動物を入れます。容器に蓋をし、確実に感染させるため、接種容器内で動物を24時間保持します。

BD病原体による汚染を防ぐため、使用済みの手袋を外し、廃棄前にオートクレーブ処理に回してください。新しい手袋を装着した後、次の動物への接種を行ってください。

接種から24時間後、動物を消毒済みの個別のテラリウムに2週間戻します。2週間後、溶液を10%の漂白剤で処理し、すべての液体廃棄物を廃棄前に消毒することを忘れないでください。滅菌綿棒で動物をスワブし、BD感染が成功したかを確認します。

スワブを動かす間およびストロークの合間に、ゆっくりと回転させます。腹部の左右各5回、各大腿部、および4本の肢それぞれに5回ずつ、計45回のストロークでスワブします。スワブは1.5 milliliterのマイクロチューブに入れ、minus 20 degrees Celsiusで保存してください。

市販のDNA抽出キットを使用してスワブからゲノムDNAを抽出し、テキストプロトコルに記載されている通りにQPCRを実施します。テキストプロトコルに従い、イトラコナゾールの3つの投与量に対応した3つの処理浴を準備します。次に、個々の両生類を消毒済みの容器に入れます。

35 mLの処理溶液を入れた50 mLの缶容器を用意します。動物を交代させる際に必ず手袋を交換することを忘れず、動物が完全に浸っていることを確認しながら、容器を時々そっと回し、5分間静置します。5分後、動物を消毒済みのエリアに戻します。

5分間の処置をさらに5日間、毎日繰り返します。処置終了の1週間後、およびその後4週間にわたり週1回、動物にBD感染があるか再度検査し、感染が消失したことを確認してください。処置が完了した後でも、動物は引き続き汚染のリスクがあるものとして取り扱う必要があることに注意してください。

感染後、動物は少なくとも1か月間、別のエリアに隔離して飼育する必要があります。治療が不成功に終わった場合は、再度行う必要があります。種や生活史のステージによって、感染への反応や治療法への反応が異なるため、治療を広く導入する前に試験的に実施する必要があります。

BDはバイオハザードであるため、テラリウムおよび処理容器を10%漂白剤溶液で浸漬し、毎週個別のテラリウムを消毒してください。少なくとも30秒間浸漬し、水で2回すすいで漂白剤を洗い流した後、カエルの生存のために容器を24時間乾燥させてから再利用してください。ここでは、11日間のBD処理後または6日間のBD処理後の様子を示します。

黒い矢印は治療の最終日を示しています。実線は対照群の生存率を示しています。黒い実線は、BD陽性であったがBD治療を受けなかった動物を示しています。

また、実線のグレーの線は、BD陰性でBD治療を受けなかった動物を示しています。破線は、示された濃度のエコナゾール投与を受けた治療群の生存率を示しています。0.0025%の濃度で6日間ネブライザー投与を受けたすべての動物は、治療終了から4週間後にBD陰性となり、したがってこの治療は成功したとみなされました。

さらに、この用量のエコナゾール治療による死亡率は、BD陽性対照群と比較して有意な差は見られませんでした。なお、0.01%および0.005%のエコナゾールを用いて11日間治療を行った場合、BD陽性対照群と比較して死亡率が有意に上昇したことに注意してください。真菌病原体であるBDはバイオハザードであるため、手袋の着用と交換、すべての固形廃棄物のオートクレーブ処理、および消毒などの予防措置を忘れないでください。

本手順に従う際は、すべての液体廃棄物を適切に処理してください。