Name: 蛍光SAPC-DOPSナノベシクルを用いて脳腫瘍、関節炎のin vivo光イメージング中 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学ぼう、マルチアングル回転光学イメージング（MAROI）を用いてマウス脳腫瘍と関節炎モデルで蛍光マーカーの最適角度を決定する方法。この技術はin vivoイメージングの精度と再現性を向上させ、がん・関節炎研究の診断と治療に応用可能である。

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この作品は、NIH / NCI助成金番号1R01CA158372-01（チー）に新薬国家重点プロジェクト無償数009ZX09102-205（チー）により部分的にサポートされていました。書き込み支援は博士ジュディRacadioから提供され、血液腫瘍のシンシナティ大学の学科によって資金を供給された。シンシナティ大学医学部の大学のVontzコアイメージングラボ（VCIL）。

動物使用の倫理声明。シンシナティ小児病院研究財団（動物福祉保証番号A3108-01）：すべての動物実験は、シンシナティ大学の施設内動物管理使用委員会（11-05-05-02 IACUCプロトコル番号）によって承認された。マウスを含むすべての実験は、シンシナティ大学およびシンシナティ小児病院研究財団の動物ケアのガイドラインに従った。 1。動物モデルを準備します 注：以下の通り三つの異なる動物モデルは、我々の先行研究で用いられてきた。 <ol><li>同所脳腫瘍マウス：頭蓋内に人間U87-ΔEGFR-Luc細胞を注射されてきたのNu /ニュースキン無胸腺雌マウスを使用してください。これらのマウスは、ヒト神経膠芽腫の典型的な特徴を示す積極的な腫瘍を開発しています。 </li><li>遺伝子操作した脳腫瘍モデルマウス13：MUT3（GFAP-CRE品種; Nf1loxをP / +; Trp53loxP/loxPとTrp53の - / +）雄性マウス; PtenloxP /のloxPメスMut6マウスを生成する（GFAP-CRE; Nf1loxP / +; Trp53-/loxP; PtenloxP / +）。女性B6CBAF1 / Jマウスと雄のMUT3マウスを交配することによりB6CBAF1 / J株でMUT3マウスを維持する。 P9とP12の間にマウスの遺伝子型とその組織を収穫した後に遺伝子型を確認してください。 </li><li> K / BXN関節炎：腹腔KRN XがうなずくF1マウスからの150μlの血清を用いて投与されている使用C57BL/6Jマウス。これらのマウスは、関節炎の血清注射後24〜48時間を開発しています。関節炎マウスのイメージングは​​、血清投与マウスは明白な巨視的関節炎を呈した時点次の7日目に行われる。マウスは、次のステップで概説された基準を用いて評価する必要があります。 <ol><li> 0 =検出可能な関節リウマチ、1 =腫脹および/または足の発赤や1桁、2 =関与する2つの関節、3 = 3関節invol：次のように関節炎指数巨視的スコアリングシステムを使用して、巨視的関節炎マウスの評価VED、全体の足と桁の4 =重度の関節炎。関節炎採点システムが影響を受け関節の数、マウスの足における関節炎の重症度を決定するために使用される。可能な限り最高の関節炎スコアでさえマウスはほとんど不動の兆しを見せていない。しかし、関節炎（例えば食品や水の消費量を抑制する腫れ足から厳しい不動など）、過度の痛み、監視対象の週3回マウスを屠殺している。 </li><li>注：無菌性は、実験を通して維持されている流体は、マウスの尾静脈にIV注射した。清潔な、無菌、使い捨てシリンジおよびバイアルを、研究溶液の調製および投与に使用される。 </li></ol></li></ol>蛍光標識SAPC-DOPSナノベシクルの2。準備<ol><li> SAPCタンパク質産生：SAPC正確なヒト配列を有する組換えSAPCタンパク質を大腸菌で産生された大腸菌細胞は、以前に改変して説明4。SAPCは、高速液体クロマトグラフィー精製に続いて​​、エタノールによって沈殿させた。凍結乾燥後、乾燥SAPCを用い、その濃度は、その重量によって決定した。 </li><li>以前7,10,11に記載されているようSAPCタンパク質を混ぜる。ガラス管中DOPS（0.18 mg）及びCVM（0.03 mg）を混合し、脂質溶媒を蒸発させ、窒素ガスを使用する。 </li><li>以前7,10,11に記載されているように約15分間乾燥PBS緩衝液1ミリリットル中の混合物を、バス音波処理を中断し、混合物にSAPCプロテインパウダー（0.32 mg）を追加します。そして、自由のCVM色素を除去するためにセファデックスG25カラム（PD-10）を介してサスペンションを渡します。最終製品の励起および発光極大、 すなわち SAPC-DOPS-CVMのナノベシクルは、それぞれ、653 nmおよび677 nmのです。 </li></ol> 3。イメージング<ol><li> MAROIシステムをテストする（ステップ1で上述）脳腫瘍および関節炎のマウスモデルを使用する。 2％のイソフルランで行うために、マウスを麻酔。 1〜2％のイソフルランはmaintaです撮像手順の間、INED。暖かい空気は、連続的に、穏やかに撮像期間中の撮像チャンバーに送達される。眼を覆う潤滑するように、無菌の人工涙液軟膏小ビーズは、マウスのそれぞれの眼に適用される。最初はカメラ（ 図1）に向け、その背骨と仰臥位でマウスを配置することにより、MARSシステムにマウスを置きます。 MARS 380°支持フィルムを校正し、ブルカーMIプロトコル]タブでローテーションソフトウェアを使用して、マウスを置きます。以下のようにして前SAPC-DOPS-CVM政権に対するマウスのベースライン画像を得る。 </li><li>静脈内にマウスの尾静脈にSAPC-DOPS-CVMを200μlを注入。マウスや関節炎、脳腫瘍保有マウスを制御するために管理します。 </li><li>画像マウス24時間後に注射し、再び蛍光（25秒の露光時間）とX線（10秒の露光時間）を考えて7-9日後に注射でI380°にわたって10°刻みでメイジ、回転データセットにギャップがないことを確認するために若干の重複を作成する。ブルカーMIソフトウェアを使用して、解剖学的局在化のためのX線画像上に蛍光を重ねる。 </li></ol> 4。画像解析<ol><li>疾患部位（腫瘍および関節炎）の視野（FOV）の幅を取り囲む長方形のROIを描画します。 ROIは380°の回転の過程で、動物の移動に伴って視野内の病気の機能を維持するのに十分な大きさでなければなりません。脳腫瘍マウス（同所及びトランスジェニックモデル）については、各腫瘍モデルおよびすべての時点（ベースライン、24時間、および9日）その3（3）は、それぞれの対照マウスに同じ長方形のROIを使用しています。各マウスの矩形ROIの位置決めは、各動物の対応するX線画像上の解剖学的ランドマークを利用して、全ての時点にわたって保存される。腫瘍モデルで同定解剖学的ランドマーク（単数または複数）はまた、ナンプラーに使用されなければならない各モデルのそれぞれの対照で同一の矩形のROIをCE。一貫性のあるROIの配置を可能にするX線画像上で識別解剖学的なランドマークは、頭蓋底および頬骨弓の後面があります。彼らは右上で可視化し、事後-前部（PA）の画像横頭蓋骨を残している。 </li><li>自動バックグラウンド除去した後、すべての画像の平均蛍光強度を決定する。蛍光画像は、Bruker MIイメージングソフトウェアを使用して、フォトン/秒/ mm 2のコンバータを使用することができる。撮像角度の関数としての蛍光値をプロットし、エラーをExcelのグラフまたは他のソフトウェアを使用して、対照マウスから得られた平均化蛍光値の標準偏差をバ​​ーとして適用する。 </li></ol>

<ol><li>Pizzonia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodality+animal+rotation+imaging+system+%28Mars%29+for+in+vivo+detection+of+intraperitoneal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multimodality animal rotation imaging system (Mars) for in vivo detection of intraperitoneal tumors.</a> Am J Reprod Immunol. 67, 84-90 (2012).</li>
<li>Al-Mehdi, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+depth+of+cellular+imaging+in+the+intact+lung+using+far-red+and+near-infrared+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biomed+Imaging%22%5BJournal%5D)">Increased depth of cellular imaging in the intact lung using far-red and near-infrared fluorescent probes.</a> Int J Biomed Imaging. , (2006).</li>
<li>Gertner-Dardenne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipophilic+fluorochrome+trackers+of+membrane+transfers+between+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells.</a> Immunol Invest. 36, 665-685 (2007).</li>
<li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+human+saposins+expressed+in+Escherichia+coli.+Evidence+for+binding+and+activation+properties+of+saposins+C+with+acid+beta-glucosidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional human saposins expressed in Escherichia coli. Evidence for binding and activation properties of saposins C with acid beta-glucosidase.</a> J Biol Chem. 269, 16746-16753 (1994).</li>
<li>Wang, Y., Grabowski, G. A., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+vesicle+fusion+induced+by+saposin%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Phospholipid vesicle fusion induced by saposin.</a> C. Arch Biochem Biophys. 415, 43-53 (2003).</li>
<li>Qi, X., Chu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusogenic+domain+and+lysines+in+saposin%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Fusogenic domain and lysines in saposin.</a> C. Arch Biochem Biophys. 424, 210-218 (2004).</li>
<li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-selective+targeting+and+cytotoxicity+by+liposomal-coupled+lysosomal+saposin+C+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer-selective targeting and cytotoxicity by liposomal-coupled lysosomal saposin C protein.</a> Clin Cancer Res. 15, 5840-5851 (2009).</li>
<li>Kaimal, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saposin+C+coupled+lipid+nanovesicles+enable+cancer-selective+optical+and+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Saposin C coupled lipid nanovesicles enable cancer-selective optical and magnetic resonance imaging.</a> Mol Imaging Biol. 13, 886-897 (2011).</li>
<li>Lu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4+can+recognize+SapC-DOPS+to+stimulate+macrophages+to+express+several+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Res%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4 can recognize SapC-DOPS to stimulate macrophages to express several cytokines.</a> Inflamm Res. 60, 153-161 (2011).</li>
<li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saposin+C+coupled+lipid+nanovesicles+specifically+target+arthritic+mouse+joints+for+optical+imaging+of+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Saposin C coupled lipid nanovesicles specifically target arthritic mouse joints for optical imaging of disease severity.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Abu-Baker, S., Chu, Z., Stevens, A. M., Li, J., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+and+selectivity+in+skin+cancer+by+SapC-DOPS+nanovesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Therapy%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity and selectivity in skin cancer by SapC-DOPS nanovesicles.</a> Journal of Cancer Therapy. 3, 321-326 (2012).</li>
<li>Wojton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+delivery+of+SapC-DOPS+has+antiangiogenic+and+antitumor+effects+against+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Systemic delivery of SapC-DOPS has antiangiogenic and antitumor effects against glioblastoma.</a> Mol Ther. 21, 1517-1525 (2013).</li>
<li>Kwon, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pten+haploinsufficiency+accelerates+formation+of+high-grade+astrocytomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Pten haploinsufficiency accelerates formation of high-grade astrocytomas.</a> Cancer Res. 68, 3286-3294 (2008).</li>
</ol>

開示することは何もありません。

リウマチ条件の固形腫瘍および炎症性病巣の位置や大きさを正確に決定するには、適切な治療を実施し、疾患の進行または寛解をフォローアップすることが重要です。貴重ながら、現在の撮像戦略（X線、MRI、超音波、X線コンピュータ断層撮影）は、疾患の状態の不完全な評価を提供。例えば、関節炎の関節損傷は、一般に、骨構造にではなく、軟組織の炎症および破壊、疾患の初期段階の特性に関する情報を提供するX線によって評価される。ここに提示MAROI方法はまた、疾患組織または器官の完全な3Dマッピングおよび再構成を可能にする、統合された非侵襲的かつ単純なプラットフォームにX線および洗練された軟組織画像モダリティ（ 例えば、MRI又は超音波）の両方の利点を兼ね備えマウスなどの小動物。 この方法は、選択的親和oを利用しますF SAPC-DOPSは、がんや炎症性細胞の膜に豊富に存在する公開されるホスファチジルセリン残基のためナノベシクル。このバインディングの決定要因はSAPC、ホスファチジルセリン7,10,11等のアニオン性リン脂質に対する強い親和性を有する融合性リソソームタンパク質である。蛍光プローブ（CVM）に結合すると、全身に注入されたSAPC-DOPSは、蛍光イメージングにより、腫瘍および関節炎サイトにさかのぼることができます。 本手法の限界は、現在では、マウスのような小動物のイメージングにその使用を制限し、その感度、に関連しています。他のイメージング方法と同様に、対雑音比を最適な蛍光シグナルが腫瘍の大きさまたは関節炎の程度によって制約され、そのような耳（脳画像法）、腸などの高バックグラウンド（自家蛍光）を有する組織または器官を画像化する際に損なわれることがある/糞（腹部イメージング）と足（後肢イメージング）。この点において、我々が発見したようなCVMプロとして遠赤色色素vides可視範囲内の他の蛍光プローブよりも、生体内の設定で、より良いスペクトル分離と解像度。 他の落とし穴は、撮像中に両方の麻酔をかけ、 死後 （ 死後硬直 ）しばらく動物の潜在的な動きがあります。後肢の位置決めは、特に、回転時の移動を回避するために安定化させることはしばしば困難である。その現在の状態での技術は、スキャン時間限り60分で完全な回転を完了し、高品質の画像を取得するために必要に応じて用いて、また時間がかかる。 MAROIの方法は、他の画像診断法に比べて多くの利点を提供する。 38（またはそれ以上）の異なる角度からの画像病変組織する能力は単一面からそれを評価する際に妨げられることがあり、蛍光の可視化を可能にする。それが不適切な角度で撮像起因する偽陰性の数を最小限に抑えることができるので、これは動物実験で有用である。 overlによる瑛X線と蛍光画像、患部の正確な解剖学的局在を決定することができる。最後に、生（ インビボ ）イメージングの可能性は、実行されるべき縦断的研究を可能にする。

動物全体のイメージングは​​、動物の生理病理の研究に強力なツールとなっています。現在の撮像系の中で、MS FXのPROは、研究者が正確に生きているマウスでは、蛍光標識された（又は発光）の化合物および/または組織を視覚化すると同時に、X線画像を得ることができる。最近導入されたマルチモーダル動物の回転システム（MARS）でマウスを完全に自動化された回転は、特定の角度1における蛍光/発光及びX線画像の両方を捕捉するために達成される。画像取得は、順次の画像シリーズは、1°と小さく、特定の、増分角度で撮像することができるようにプログラムすることができる。これは、動物の最適配向、 すなわちを識別できるようにするものである。ここで、内部で発生した蛍光/発光シグナル、システムの検出装置との間の距離が最短であること。これは、順番に、その後のイメージングのための動物の正確な再配置を容易にし、SE縦研究中ssions。 本稿では、蛍光マーカー強度のin vivo定量のためのマルチアングル回転光学イメージング（MAROI）システムの実装について説明します。 MAROI信号曲線分析を正確に患部または目的の生物学的プロセスをマッピングするために蛍光シグナル分布の直接相関のための縦断的研究に用いることができる。 このシステムは、マウスの生体内、同所性腫瘍による自発的、ならびに関節炎の病巣によって蛍光標識SAPC-DOPSのナノベシクルの吸収をモニターするために使用した;それは、動物の完全な回転報道から派生したマルチスペクトルおよびマルチモーダルのデータセットを提供した。 in vivoイメージングのために現在利用できる多数の蛍光プローブの中では、近赤外、遠赤のスペクトル領域で発光するものが皮膚や組織との最低の干渉を与える、最高の浸透と画像解像度を提供olution。私たちは、SAPC-DOPS（SAPC-DOPS-CVM）4月12日にラベルを付けるには 、遠赤色蛍光細胞リンカー（例647/Em 667）、CellVueマルーン（CVM） の2,3を使用していました。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグルミディア</td><td>ムギブコ(ニューヨーク州グランドアイランド)</td><td>11965</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco (ニューヨーク州グランドアイランド)</td><td>16000077</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>ハイクロン(ユタ州ローガン)</td><td>SV30010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ジオレオイルホスファチジルセリン</td><td>Avanti極性脂質(アラバスター、アラバスター州)</td><td>840035C</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CellVue Maroon</td><td>Molecular Targeting Technologies, Inc.(ペンシルベニア州エクストン)</td><td>C-1001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sephadex G25カラムPD-10</td><td>Amersham Pharmacia Biotech、(ピスカタウェイ、ニュージャージー州)</td><td>17-0851-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ラットおよびマウスのための新しい標準的な定位固定装置</td><td>ハーバード装置(マサチューセッツ州ホリストン)</td><td>726335</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bransonic超音波クリーナーモデル1510</td><td>ブランソン超音波(コネチカット州ダンベリー)</td><td>CPN-952-118</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>マルチスペクトルFXシステム</td><td>Bruker Corporation (マサチューセッツ州ビレリカ)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>多角度回転光学イメージングデバイス</td><td>Bruker Corporation (マサチューセッツ州ビレリカ)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

蛍光sapc-dopsナノベシクルを用いて脳腫瘍、関節炎のin vivo光イメージング中

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

私たちは、蛍光マーカーで標識された生理病理学的過程のin vivoモニタリングのためのマルチアングル回転光学イメージング（MAROI）システムについて説明します。マウスモデル（脳腫瘍および関節炎）を、この方法の有用性を評価するために使用した。 CellVueマルーン（CVM）フルオロフォアでタグ付けされたサポシンC（SAPC） - ジオレオイルホスファチジルセリン（DOPS）ナノベシクルを静脈内投与した。次いで、動物をインビボイメージング·システムの回転ホルダ（MARS）に入れた。画像は380°にわたって10°ステップで取得した。関心領域（ROI）の矩形領域は、モデル疾患部位で全画像の幅全体に配置した。 ROI内の、すべての画像に対して、平均蛍光強度は、バックグラウンドを差し引いた後に計算した。研究されたマウスモデルにおいて、標識は、同所ナノベシクルおよびトランスジェニック脳腫瘍の両方において、関節炎部位（つま先と足首）に取った。マルチアングルIMAの曲線解析GE ROIが最も高い信号と角度を決定した。したがって、各疾患部位を撮像するための最適な角度を特徴付けた。蛍光化合物の撮像に適用MAROI方法についてマウスモデルにおける疾患状態のin vivo定量分析のために、非侵襲的、経済的、かつ正確なツールである。

私たちは、遠赤色染料（CVM）で標識SAPC-DOPSのナノベシクルは、具体的に同所自発マウス脳腫瘍に蓄積するだけでなく、K / BXNマウスの関節炎の関節であることをここに証明している。マウスの完全な回転中に各疾患部位の上に配置ROIから取得したシリアル蛍光/ X線画像は、最高蛍光強度との最適な撮像角度を明らかにしたMAROI曲線分析に供した。 MARSシステムを使用する主な目的は、最も正確な測定値をとることができるように、蛍光の最適角度を決定することである。脳腫瘍または関節炎を有するマウスを使用して3つの実験からの代表的な結果を示す。 SAPC-DOPS-CVMおよびMARSシステム（ 図1）による関節炎、腫瘍または炎症を観察するための最良の可能な画角を使用することを決定した。 X線の取得に続いて、蛍光画像は、すべての10°を取得したマウスの380°回転時。蛍光画像は、画像表示装置および回転ムービーの生成に対応するX線画像上にオーバーレイした。 同所性脳腫瘍モデルからの結果を図2に実証される。代表的な同所性腫瘍を有するマウス（Ortho1）の蛍光画像を図2Aに示されている。この動物のための最適な画角は、蛍光光子の強度が最大（ 図2B）となる位置10°である。測定はSAPC-DOPS-CVM（ベースライン）を注射し、注射後24時間前に撮影された。対照マウス（腫瘍無料）は、同様の治療を受けた。 図3は、遺伝子操作した脳腫瘍モデルマウスから比較可能なデータを示しています。蛍光画像と光子の測定はSAPC-DOPS-CVM（ベースライン）の注射の前に採取し、24時間（ 図3Aおよびれた&lt;強い&gt; 3B）および注入後の9日間（ 図3C）。これらのグラフは、腫瘍を有する動物（腫瘍Mut49）で最適な撮影角度は20°24時間後に注射が、10°9日後に注射への変更であることを示している。これはおそらく、腫瘍増殖を反映して、形態学的変化と相関し、その蛍光シグナルの変化を示唆している。 表1に示すように、MAROI方法は、明らかに蛍光シグナルが離れて最適な撮像角度からの回転を増加させるための突起で減少することを示している。動物の物理的な向きは、最適な撮像角度からオフセット±10°であった場合は、脳腫瘍では、蛍光シグナルの平均7％の減少が得られた。蛍光シグナルの平均21％の減少が±20°で測定した。このように最適な角度から比較的小さなオフセットは、有意な信号の減衰になることがあります。画像の位置決めのためのMAROI技術を利用することを可能にするINVEより一貫した信頼性のあるデータを生成するstigators。 MAROI方法は、最終的にSAPC-DOPS-CVM注射後SAPC-DOPS-CVM 24時間までに関節炎の関節のターゲティングを評価するために使用した。この動物は、3関節炎と3を獲得した。関節炎マウスのつま先と足首の蛍光画像を図4Aおよび4Bに示されている。 10°回転の間隔で、対応する光子の測定は、 図4Cおよび4Dにグラフ化されています。つま先と足首見つかり最適な撮像角はそれぞれ、140°、120°である。 要約すると、蛍光SAPC-DOPSのナノベシクルとMAROIシステムの組み合わせは、小動物の腫瘍、関節炎の進行の定量的研究を可能にし、ライブイメージングのための、非侵襲的に正確で高感度な戦略を表しています。 360°マルチモーダルイメージングデータセットを取得する可能性がかなり即興達成可能なシングルアングル画像化技術を使用しているものと比較してエスデータ分析および解釈。 <img alt="表1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187table1.jpg" width="600px" /> 表1の各マウスモデルにおける最適撮像角度最大光子蛍光（FLR最適な角度）の角度と標準解剖学的角度（X線）との違いを見ることができる。これらの二つの角度はますます異なってくる場合には、測定された信号が大幅に変更されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187table1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig1.jpg" width="600px"/&gt; 図1。マルチアングル回転光学イメージング（MAROI）デバイス。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig2.jpg" width="600px" /> 図2同所性脳腫瘍マウスモデルにおける画角対蛍光シグナル。 10°の最適な画角でのピークの蛍光シグナルの（A）の画像。青いボックスは、ROIが放出された光子を定量化するために使用示す（B）。光子放出に対する画角のグラフ。代表同所腫瘍を有するマウス（Ortho1）が3非腫瘍マウスでは、同一のROIからの平均蛍光値に対してグラフ化されている。測定は、（注入前）は、ベースラインで採取し、24時間後に充血し、N。エラーバーは標準偏差を表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig3.jpg" width="600px" /> 遺伝子操作したマウスモデルの自発的な脳腫瘍での画角の関係を図3。蛍光シグナル。 （A）20℃の最適な画角でのROI 1（上青色のボックス）のピーク蛍光信号の画像は（B）および（C）。ROI 1からの光子放出に対する画角のグラフ。からの値代表自発脳担癌マウス、腫瘍ムート49は、3つの非腫瘍マウスから平均値に対してグラフ化する。測定は、（注入前）ベースライン時および24時間（B）および9日（C）ポスト噴射した。エラーbは<html> ARSは、標準偏差を表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig3highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig4.jpg" width="600px" /> 図4。つま先と足首関節の関節炎のマウスでの画角対蛍光シグナル。 （A）及び（B）。赤枠で示されたROI内で、つま先（A）と足首関節（B）のピークの蛍光信号を示す。（C）対角度のグラフは、TOEのための光子の放出を意味するイメージ。 。ピーク光子放出角度の（D）のグラフ140°の角度で見た対足首のための光子放出を意味することができ;最大強度は、120°の角度で発生します。ターゲットは= &quot;_blank&quot;&gt;拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

私たちは、サポシンC（SAPC） -ジオレオイルホスファチジルセリン（DOPS）ナノベシクルで配信蛍光マーカーのin vivo定量のためのマルチアングル回転光学イメージング（MAROI）システムについて説明します。癌および関節炎のマウスモデルを用いて、我々はMAROI信号曲線分析が正確なマッピングおよび疾患過程の生物学的特徴付けのために使用することができる方法を実証する。

蛍光SAPC-DOPSナノベシクルを用いて脳腫瘍、関節炎のin vivo光イメージング中

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

本手順の目的は、蛍光解析に最適な角度を決定するために、マウスの生体内で360度のイメージングを行うことです。まず、正位脳腫瘍、工学的脳腫瘍、および関節炎の動物モデルを調製します。次に、SAPs Cタンパク質を産生し、SAP D-O-P-S-C-V-Mナノ小胞を調製します。次に、ナノベシクルを動物の尾静脈に注入します。最後に、蛍光画像およびX線画像を撮影し、解析を行います。最終的に、蛍光画像解析に最適な角度を示すためにM-A-R-O-I法を用います。2D平面蛍光イメージングなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、M-A-O-M-A-R-O-I法を用いることで、研究者が蛍光イメージング解析に最適な角度を決定できる点にあります。CEP CS Vesicalは腫瘍や炎症組織を標的とすることができるため、この技術的な意義は癌や関節炎の治療および診断へと拡大します。すべての動物実験は、シンシナティ大学およびシンシナティ小児病院研究財団の機関動物ケアおよび使用委員会によって承認され、これらの研究および脳腫瘍正位移植マウスを用いた試験が実施されました。遺伝子組み換え脳腫瘍マウスおよびA-K-B-X-N関節炎マウスモデルを使用します。テキストプロトコルに従い、以下の関節炎指数マクロスコピックスコアリングシステムを用いてマウスの関節炎を評価します。0は関節炎が検出されない状態、1は足指の腫れおよび/または発赤、または1つの指に症状がある状態、2は2つの関節に症状がある状態、3は3つの関節に症状がある状態、4は足および指全体に重度の関節炎がある状態とします。E. coli細胞でリコンビナントヒトSAP Cタンパク質を産生し、エタノールによる沈殿および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による精製を行った後、凍結乾燥して乾燥SAP Cの重量濃度を測定します。SAP Cタンパク質を混合するために、0.18 mgのDOPSと0.03 mgのCVMをガラスチューブに合わせ、窒素ガスを用いて脂質溶媒を蒸発させます。次に、0.32 mgのSAPs海蛋白粉末を混合物に加えます。この乾燥混合物を1 mLのPBS緩衝液に懸濁させ、15分間バスソニケーションを行います。懸濁液をCidex G 25カラムに通し、遊離のCVM色素を除去します。SAP C-D-O-P-S-C-V-M ナノ粒子は、それぞれ 653 nanometers および 677 nanometers の励起および放出極大波長を持ちます。Mars システムを用いた多角度回転光学イメージング（M-A-R-O-I）法を検証するため、記述されたマウスモデルのいずれかのマウスを 2%ISO フルオリンで麻酔し、Brucker MI rotator タブのプレビュー画面を確認しながら、脊髄がカメラに向くように Mars システム内で仰臥位に配置し、Mars 380 度サポートフィルムを校正します。マウスを配置し、尾静脈から SAPs C-D-O-P-S-C-V-M 200 microliters を静脈内投与します。24 時間後、および投与から 7〜9 日後に、380 度にわたって 10 度刻みで蛍光画像および X 線画像を撮影し、回転データセットに隙間が生じないようわずかにオーバーラップさせます。Bruker社の回転ソフトウェアを用い、解剖学的局在を特定するために、蛍光画像とX線画像を重ね合わせます。画像を解析するには、脳腫瘍マウスの病変部位の視野（FOV）の幅を包含する、長方形の関心領域（ROI）を設定します。自動背景減算後、解剖学的指標を用いてROIの位置をマークし、すべてのタイムポイントにおいて、各腫瘍モデルおよび対応する対照マウスに同一のROIを適用します。Brucker MIソフトウェアを使用して、蛍光画像を1平方ミリメートルあたりの1秒あたりの光子数に変換し、すべての画像の平均蛍光強度を決定します。蛍光値を撮像角度の関数としてプロットし、コントロールマウスから得られた平均蛍光値の標準偏差をエラーバーとして適用します。代表的な正位腫瘍担持マウスの蛍光画像をこの図に示します。ここでは、遠赤色色素で標識したDOPSナノベシクルをシードとしたSAPsが、マウスの正位および自然発生的な脳腫瘍、ならびにKBXNマウスの関節炎部位に特異的に集積することを実証します。Marsシステムの主な目的は、ここで示されているように、最も正確な測定を行うための最適な蛍光角度を決定することです。この個体における最適な画像角度は10度です。蛍光光子強度が最大となる位置におけるベースライン測定を、SAP C-D-O-P-S-C-V-Mの注入前および注入24時間後に行い、腫瘍のないコントロールマウスにも同様の処置を施した。これらの図は、遺伝子組み換え脳腫瘍マウスモデルから得られた同様のデータを示している。蛍光画像および光子測定は、ベースライン時、SAP C-D-O-P-S-C-V-M注入後24時間、および9日後に実施した。グラフは、腫瘍担持動物tumor mute 49における最適な撮像角度が、投与24時間後には20度であるものの、投与9日後には10度に変化することを示しています。これは、蛍光信号の変化が、おそらく腫瘍の成長を反映した形態学的変化と相関していることを示唆しています。この表に示されているように、M-A-R-O-I法では、最適な撮像角度から回転角が増加するにつれて、投影における蛍光信号が減少することが明確に示されています。脳腫瘍において、蛍光信号に平均7%の減少が認められました。動物の身体的な向きが最適な撮像角度から±10度以上ずれていた場合、±20度では平均21%の蛍光信号の減少が測定されました。したがって、最適角度からわずかにずれるだけで、信号強度が大幅に減少することがあります。M-A-R-O-I法を用いて画像のポジショニングを行うことで、より一貫性のある信頼性の高いデータを取得することが可能になります。最終的に、M-A-R-O-I法を用いて、注入24時間後のSAPs C-D-O-P-S-C-V-Mによる関節炎部位への標的能を評価しました。この動物は関節炎を起こした関節が3か所あり、スコアは3となりました。対応する光子測定のグラフに基づいた、関節炎マウスの足趾および足首の蛍光画像がここに示されています。10度ずつの回転において、足趾と足首で得られた最適な撮像角度は、それぞれ140度および120度でした。このビデオを視聴することで、研究者が蛍光撮像分析のための最適角度を決定することを可能にするM-A-R-O-Iデータの準備および取得方法について、十分に理解できるはずです。

in-vivo-optical-imaging-brain-tumors-arthritis-using-fluorescent-sapc

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蛍光SAPC-DOPSナノベシクルを用いて脳腫瘍、関節炎のin vivo光イメージング中

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