中に神経芽細胞細胞質分裂を可視化する C.虫胚
March 12th, 2014
このプロトコルは、画像に線虫（Caenorhabditis elegans）の胚における組織内の細胞を分割する方法について説明します。いくつかのプロトコルは、初期胚の画像細胞分裂に、このプロトコルはどのように中期後期胚形成の間に開発し、組織内の細胞分裂像に説明して方法について説明している。
次の実験の全体的な目標は、Cエレガンス胚形成中に発生中の組織内で分裂する細胞を観察することです。細胞分裂を制御する遺伝子を研究するためには、目的の細胞を標識するトランスジェニックマーカーを安定して発現するCエルガン株を作成または取得することでこれを達成します。第2のステップとして、D-S-R-N-AをLの4匹の幼虫に24〜48時間供給することにより、目的の遺伝子を選択的にノックダウンします。
RNAI胚は、グラフィック雌雄同体から収集され、ライブイメージングのためにarosパッドに移されます。次に、広視野顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、胚を画像化し、細胞分裂の表現型を視覚化します。その結果、シーエルギンの胚形成中に神経芽細胞がどのように分裂するか、そしてその分裂に必要な遺伝子の役割が明らかになります。
この方法は、発生生物学および細胞生物学の分野における重要な問題を明らかにするのに役立ちます。例えば、この手法により、組織発生、細胞細胞のコミュニケーション、細胞移動、または細胞極性における有糸分裂の調節に関与する遺伝子とメカニズムを明らかにすることができます。適切なマーカーを発現するトランスジェニックワームをコントロールプレートまたはRNAIプレートに24〜48時間保持します。
4〜6人の墓の成虫を選び、それらをうつ病スライドで20〜30マイクロリットルのMナインバッファーに移します 胚を解放するには、滅菌メスを使用し、精子または外陰部のいずれかの側でワームを切断します。次に、ピペット球に取り付けられ、胚を通過するのに十分な幅のプルドキャピラリーを使用して胚を収集します。つまようじに接着したまつげを使用して、準備したばかりのアロスパッドに胚を移します。
胚を隣り合わせに押して、5〜10個の胚のグループを作成します。スライドをカバースリップで覆い、必要に応じてM nineバッファーを追加し、予熱した液体バラでカバースリップを密封します。自動フィルターを含む落射蛍光広視野顕微鏡を使用してください。
対物レンズ、高解像度CCDカメラ、高電動ステージ。すべてソフトウェアで制御します。このシステムにはそれらはありませんが、LEDとE-M-C-C-Dを使用すると、低倍率で胚への光毒性が制限されます。
手動で胚に焦点を合わせ、神経芽細胞を画像化します。倍率を上げて、背側間照合を受けている胚を選択するか、広視野顕微鏡で腹側閉鎖を早期に行います。GFP フィルターとテキサス赤色フィルターを選択し、広視野システム上の最適な Z 平面を決定します。
より少ないZacksとより少ない時間ポイントを使用すると、光毒性が減少し、絞りが30%に閉じられ、可能であれば、光強度を下げると光毒性がさらに減少します。あるいは、走査型レーザー対物レンズを制御するソフトウェア、E-M-C-C-Dカメラ、および高度に電動化されたステージを備えたライブスキャンスイープフィールドまたはスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用します。取得設定が最適化されたので、広視野顕微鏡で胚を画像化します。
RNAI Embryosの前に、まず胚をフィルムコントロールすることをお勧めします。スイープフィールドシステム付き。4、88、5、61、100ミリワットレーザーを40%の出力に設定し、スリットを50、露光時間を300ミリ秒に設定します。
これらの設定は、他の顕微鏡では異なることに注意することが重要です。スライドを顕微鏡ステージに置き、低倍率の対物レンズを使用して胚を見つけます。次に、60 x または 100 x オイル浸対物レンズに切り替えます。
集中したら、2分ごとに0.2ミクロンのZスタックを20個、合計10分間収集します。露光時間の調整が必要になる可能性があります。蛍光顕微鏡で胚をライブイメージングし、開口部を閉じ、ザックやタイムポイントの選択を減らす際には、光毒性を考慮する必要があります。
露光時間を短縮することで、可能であれば光毒性を抑えることができます。SWフィールドまたはスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用すると、この問題を解決するのに役立ちます。取得ソフトウェアを使用して、関心のある時間、ポイント、Z面を決定します。
目的の画像を複数のtiffとしてエクスポートします。Image Jのような処理ソフトウェアで関心のある各時点とチャネルに対して目的のZ平面を開き、多くの場合、数面のみにまたがるスタック神経芽細胞を作成します。各時点の Z 平面をスタックし、Z スタック投影を作成します。
これを他のチャネルについても繰り返します。目的の時点の Zack 投影法がすべて完了したら、投影法を開いて時系列を作成します。これは、チャネルごとに個別に行います。
各チャンネルで、必要に応じて明るさとコントラストを調整します。必要に応じて画像を回転させます。次に、関心のある領域を選択し、画像を切り抜きます。
次に、マージされたチャネル機能を使用してマージされた画像を作成します。チャンネルごとに異なる色を選択します。結合した画像をRGBファイルとして保存すると、画像がより鮮明に視覚化されます。
16ビットのTIFF画像を使用し、編集中の反転機能を選択して、各チャンネルのグレースケール画像を作成します。ミクロン単位の対象となるオブジェクトのサイズを決定するには、線を引き、その長さにピクセルのサイズを掛けます。これはイメージングパラメータによって決定されます。次に、計算された長さの割合をミクロン単位で表すスケールバーを作成します。
最終的には、最終的な画像を 8 ビット tiff として保存します。必要に応じて、画像J表皮を使用してtiffをムービーに変換します。C eleganceの形態形成は、表皮細胞の形状変化、遊走、および根底にある増殖性神経芽細胞の助けによる接着の組み合わせによって発生します。
表皮細胞は腹側正中線に移動し、神経芽細胞分裂胚を研究するために細胞の単層を形成し、GFPでタグ付けされた安定共生および神経芽細胞特異的マーカー、およびmチェリーでタグ付けされた母体駆動膜マーカーを腹側囲い込み中に拡大して画像化しました。分裂中の神経芽細胞を可視化 神経芽細胞の核を緑色、周囲の膜を赤色で示し、対照胚のmCherry膜プローブで輪郭を描いた分裂神経芽細胞のタイムラプス画像を広視野顕微鏡で撮影し、対照胚の分裂神経芽細胞をよりよく可視化しました。各チャンネルはグレースケールで保持され、画像はスイープフィールド共焦点顕微鏡対照胚を使用して反転されました。
ハム1GFPとMチェリーpHを発現するCoexを、神経芽細胞が分裂している領域で画像化しました。病気の発現をノックダウンするためにRNAIで処理された同じ胚を、広視野顕微鏡を使用して視覚化しました。対照胚とは異なり、多くの神経芽細胞は分裂中に失速または退行し、掃引野外顕微鏡法を用いて多核になりました。
また、多くの神経芽細胞が分裂中に失速または退行し、多核になることも明らかでした。この手法は、組織形成中の移動細胞の画像化にも使用できます。また、Zacksを使用してイメージングを高速化すると、細胞内ダイナミクスに関するより多くの情報を得ることができます。
さらに、適切な装置を使用すれば、この手法を光遺伝学を行うためのフォトチューナブルプローブの活性化に使用することができます。また、フレットやフレットなどの顕微鏡技術を適用して、タンパク質、タンパク質相互作用、またはタンパク質ダイナミクスの研究を行うことができます。
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概要
このプロトコルは、カエノラブディティス・エレガンスの胚の中期から後期の胚発生の間に組織内の分裂細胞をイメージする方法を説明しています。この研究は、神経芽細胞分裂とこのプロセスにおける特定の遺伝子役割の観察に焦点を当てています。
主要な研究要素
科学分野
- 神経科学
- 発生生物学
- 細胞生物学
背景
- 細胞分裂の理解は発生生物学にとって重要です。
- カエノラブディティス・エレガンスは胚発生を研究するためのモデル生物として機能します。
- トランスジェニックマーカーは分裂中の特定の細胞を視覚化するのに役立ちます。
- 遺伝子ノックダウン技術は細胞分裂における遺伝子機能を解明するのに役立ちます。
研究の目的
- C. elegansの胚発生の間に発達中の組織内の分裂細胞を観察すること。
- 細胞分裂を制御する遺伝子を研究すること。
- 神経芽細胞分裂の表現型を視覚化すること。
使用された方法
- トランスジェニックマーカーを発現するC. elegans株の作成または取得。
- L4幼虫にDSRNAを投与しての遺伝子ノックダウン。
- 生体イメージング用のRNAi胚の収集。
- 広視野または共焦点顕微鏡によるイメージング。
主要な結果
- 胚発生中の神経芽細胞分裂の視覚化。
- 細胞分裂に必要な遺伝子機能の特定。
- 発達中の組織における細胞分裂のメカニズムへの洞察。
- 生体イメージングにおけるトランスジェニックマーカーの有効性の実証。
結論
- このプロトコルはC. elegansの胚における分裂細胞のイメージングを成功裏に行います。
- 遺伝子ノックダウン技術は細胞分裂メカニズムへの洞察を提供します。
- この研究はモデル生物における胚発生の理解を深めます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables visualization of neuroblast cytokinesis in developing tissues, supporting mechanistic de-risking in target validation for developmental pathways. By linking gene function to cell division dynamics in a disease-relevant system, it enhances predictive confidence in early discovery stages. The approach provides a scalable, reproducible platform for interrogating therapeutic hypotheses in tissue morphogenesis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in neuroblast division, clarifying roles in intercellular communication during tissue formation.
- Operational Value: Uses transgenic markers and RNAi to establish causal links between genetic perturbations and cytokinesis phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, time-resolved imaging data on mitotic progression in live embryos.
- Operational Value: Standardizes live imaging workflows with controlled phototoxicity settings for reproducible phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects molecular mechanisms of cell division to tissue-level outcomes like ventral enclosure and epidermal morphogenesis.
- Operational Value: Supports continuity from gene discovery to phenotypic validation in a disease-relevant, in vivo model.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, providing imaging-based readouts that de-risk targets involved in mitotic regulation and tissue development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing division phenotypes following gene knockdown in developing tissues.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized embryo preparations with quantifiable mitotic endpoints.
- Analytics: Enables measurement of division timing, fidelity, and subcellular dynamics via Z-stack projections and time-lapse.
- Translational Research: Links neuroblast behavior to epidermal migration, offering insight into tissue formation mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for studying conserved mechanisms of cell division across genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by directly observing cytokinesis in vivo.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized embryo mounting, imaging parameters, and post-processing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking genetic targets to functional outcomes in tissue development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genes based on their role in cytokinesis and morphogenetic processes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, transgenic strain maintenance, and RNAi feeding protocols.
- Dependent on fluorescence microscopy infrastructure (widefield, confocal) with motorized stages and sensitive cameras.
- Necessitates standardization of embryo staging, mounting, and imaging conditions across operators.
- Adaptation to other tissue types or developmental stages may require optimization of markers and imaging depth.
- Phototoxicity management is essential for longitudinal imaging, necessitating controlled light exposure and Z-sampling.
