中に神経芽細胞細胞質分裂を可視化する C.虫胚

次の実験の全体的な目標は、Cエレガンス胚形成中に発生中の組織内で分裂する細胞を観察することです。細胞分裂を制御する遺伝子を研究するためには、目的の細胞を標識するトランスジェニックマーカーを安定して発現するCエルガン株を作成または取得することでこれを達成します。第2のステップとして、D-S-R-N-AをLの4匹の幼虫に24〜48時間供給することにより、目的の遺伝子を選択的にノックダウンします。

RNAI胚は、グラフィック雌雄同体から収集され、ライブイメージングのためにarosパッドに移されます。次に、広視野顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、胚を画像化し、細胞分裂の表現型を視覚化します。その結果、シーエルギンの胚形成中に神経芽細胞がどのように分裂するか、そしてその分裂に必要な遺伝子の役割が明らかになります。

この方法は、発生生物学および細胞生物学の分野における重要な問題を明らかにするのに役立ちます。例えば、この手法により、組織発生、細胞細胞のコミュニケーション、細胞移動、または細胞極性における有糸分裂の調節に関与する遺伝子とメカニズムを明らかにすることができます。適切なマーカーを発現するトランスジェニックワームをコントロールプレートまたはRNAIプレートに24〜48時間保持します。

4〜6人の墓の成虫を選び、それらをうつ病スライドで20〜30マイクロリットルのMナインバッファーに移します 胚を解放するには、滅菌メスを使用し、精子または外陰部のいずれかの側でワームを切断します。次に、ピペット球に取り付けられ、胚を通過するのに十分な幅のプルドキャピラリーを使用して胚を収集します。つまようじに接着したまつげを使用して、準備したばかりのアロスパッドに胚を移します。

胚を隣り合わせに押して、5〜10個の胚のグループを作成します。スライドをカバースリップで覆い、必要に応じてM nineバッファーを追加し、予熱した液体バラでカバースリップを密封します。自動フィルターを含む落射蛍光広視野顕微鏡を使用してください。

対物レンズ、高解像度CCDカメラ、高電動ステージ。すべてソフトウェアで制御します。このシステムにはそれらはありませんが、LEDとE-M-C-C-Dを使用すると、低倍率で胚への光毒性が制限されます。

手動で胚に焦点を合わせ、神経芽細胞を画像化します。倍率を上げて、背側間照合を受けている胚を選択するか、広視野顕微鏡で腹側閉鎖を早期に行います。GFP フィルターとテキサス赤色フィルターを選択し、広視野システム上の最適な Z 平面を決定します。

より少ないZacksとより少ない時間ポイントを使用すると、光毒性が減少し、絞りが30%に閉じられ、可能であれば、光強度を下げると光毒性がさらに減少します。あるいは、走査型レーザー対物レンズを制御するソフトウェア、E-M-C-C-Dカメラ、および高度に電動化されたステージを備えたライブスキャンスイープフィールドまたはスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用します。取得設定が最適化されたので、広視野顕微鏡で胚を画像化します。

RNAI Embryosの前に、まず胚をフィルムコントロールすることをお勧めします。スイープフィールドシステム付き。4、88、5、61、100ミリワットレーザーを40%の出力に設定し、スリットを50、露光時間を300ミリ秒に設定します。

これらの設定は、他の顕微鏡では異なることに注意することが重要です。スライドを顕微鏡ステージに置き、低倍率の対物レンズを使用して胚を見つけます。次に、60 x または 100 x オイル浸対物レンズに切り替えます。

集中したら、2分ごとに0.2ミクロンのZスタックを20個、合計10分間収集します。露光時間の調整が必要になる可能性があります。蛍光顕微鏡で胚をライブイメージングし、開口部を閉じ、ザックやタイムポイントの選択を減らす際には、光毒性を考慮する必要があります。

露光時間を短縮することで、可能であれば光毒性を抑えることができます。SWフィールドまたはスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用すると、この問題を解決するのに役立ちます。取得ソフトウェアを使用して、関心のある時間、ポイント、Z面を決定します。

目的の画像を複数のtiffとしてエクスポートします。Image Jのような処理ソフトウェアで関心のある各時点とチャネルに対して目的のZ平面を開き、多くの場合、数面のみにまたがるスタック神経芽細胞を作成します。各時点の Z 平面をスタックし、Z スタック投影を作成します。

これを他のチャネルについても繰り返します。目的の時点の Zack 投影法がすべて完了したら、投影法を開いて時系列を作成します。これは、チャネルごとに個別に行います。

各チャンネルで、必要に応じて明るさとコントラストを調整します。必要に応じて画像を回転させます。次に、関心のある領域を選択し、画像を切り抜きます。

次に、マージされたチャネル機能を使用してマージされた画像を作成します。チャンネルごとに異なる色を選択します。結合した画像をRGBファイルとして保存すると、画像がより鮮明に視覚化されます。

16ビットのTIFF画像を使用し、編集中の反転機能を選択して、各チャンネルのグレースケール画像を作成します。ミクロン単位の対象となるオブジェクトのサイズを決定するには、線を引き、その長さにピクセルのサイズを掛けます。これはイメージングパラメータによって決定されます。次に、計算された長さの割合をミクロン単位で表すスケールバーを作成します。

最終的には、最終的な画像を 8 ビット tiff として保存します。必要に応じて、画像J表皮を使用してtiffをムービーに変換します。C eleganceの形態形成は、表皮細胞の形状変化、遊走、および根底にある増殖性神経芽細胞の助けによる接着の組み合わせによって発生します。

表皮細胞は腹側正中線に移動し、神経芽細胞分裂胚を研究するために細胞の単層を形成し、GFPでタグ付けされた安定共生および神経芽細胞特異的マーカー、およびmチェリーでタグ付けされた母体駆動膜マーカーを腹側囲い込み中に拡大して画像化しました。分裂中の神経芽細胞を可視化 神経芽細胞の核を緑色、周囲の膜を赤色で示し、対照胚のmCherry膜プローブで輪郭を描いた分裂神経芽細胞のタイムラプス画像を広視野顕微鏡で撮影し、対照胚の分裂神経芽細胞をよりよく可視化しました。各チャンネルはグレースケールで保持され、画像はスイープフィールド共焦点顕微鏡対照胚を使用して反転されました。

ハム1GFPとMチェリーpHを発現するCoexを、神経芽細胞が分裂している領域で画像化しました。病気の発現をノックダウンするためにRNAIで処理された同じ胚を、広視野顕微鏡を使用して視覚化しました。対照胚とは異なり、多くの神経芽細胞は分裂中に失速または退行し、掃引野外顕微鏡法を用いて多核になりました。

また、多くの神経芽細胞が分裂中に失速または退行し、多核になることも明らかでした。この手法は、組織形成中の移動細胞の画像化にも使用できます。また、Zacksを使用してイメージングを高速化すると、細胞内ダイナミクスに関するより多くの情報を得ることができます。

さらに、適切な装置を使用すれば、この手法を光遺伝学を行うためのフォトチューナブルプローブの活性化に使用することができます。また、フレットやフレットなどの顕微鏡技術を適用して、タンパク質、タンパク質相互作用、またはタンパク質ダイナミクスの研究を行うことができます。