造血前駆細胞の養子移入を使用して、パイエル板におけるマウス形質細胞様樹状細胞の開発を評価

次の手順の全体的な目標は、精製された造血前駆細胞が養子移植時に腸管の毛状パッチに形質細胞様樹状細胞を生じさせる能力を調べることです。これは、樹状細胞増殖因子をコードするプラスミドの流体力学的遺伝子導入を最初に行うことによって達成されます。PIのパッチ形質細胞様樹状細胞障害マウスに3つのリガンドをFLITします。

第2ステップでは、一般的な樹状突起前駆細胞を、磁気ビーズ分離とフローソーティングにより野生型骨髄から単離します。最終ステップでは、前駆細胞を、流体力学的遺伝子導入によって治療されたパイアパッチ形質細胞樹状細胞障害マウスに静脈内注射により養子移植します。最終的に、ドナー造血前駆細胞由来PIのパッチ形質細胞様樹状細胞集団は、フローサイトメトリーによって評価できます。

この方法は、海賊パッチ内に局在する血漿Cy Dendri細胞の発生起源は何かなど、免疫学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。しかし、この方法では、パイアパッチ形質細胞の樹状細胞の起源についての洞察を得ることができます。また、形質細胞様樹状細胞がこれらの組織内のリンパ球集団にどのように影響するかを理解するためにも適用できます。

養子縁組移管の2日前に、ヒートランプの下で5〜10分間、5つのCD 45 2陽性インターフェロンアルファ受容体ノックアウトレシピエントマウスの血管を拡張します。次に、各マウスについて、動物を拘束具に入れ、尾を70%エタノールで消毒します。次に、27ゲージの針を使用して、5マイクログラムの血漿とコーティングflit、3つのリガンドと2ミリリットルの滅菌PBSを各動物の尾静脈に注入します。

対照コホートには、5マイクログラムの空のベクターを注入します。マウスを15〜30分間監視した後、マウスを飼育施設に戻します。実験当日、10匹のコンジェニックCD45 1陽性C57ブラック6マウスから解剖した大腿骨と脛骨を、完全な培地を含む培養皿に入れます。

次に、27ゲージの針を各骨の一方の端に挿入し、完全なメディアを使用して骨髄を骨ごとに3回皿に洗い流します。排出された培地が曇っているように見えることを確認して、骨髄細胞が除去されていることを確認します。培養皿内で培地を3〜5回静かにピペッティングして、シングルセル懸濁液を調製します。

次に、骨髄細胞を40μmのセルストレーナーに通して破片を取り除き、滅菌シリンジプランジャーの端を穏やかに適用して細胞の凝集を破壊します。ストレーナーで、細胞をスピンダウンし、上清を取り除き、室温で5分間、10〜7番目の細胞の4〜6倍あたり2ミリリットルの溶解緩衝液で赤血球をシラミにします。次に、10ミリリットルのファックスバッファーを骨髄細胞に加え、室温でGの500倍で4分間スピンダウンします。

sup natinを穏やかに吸引した後、ペレットを10ミリリットルのファックスバッファーで洗浄します。次に、抗体染色および洗浄後に、抗体を認識する造血系マーカーで細胞を染色します。細胞をヤギ抗ラット磁気マイクロビーズでインキュベートします。

マイクロビーズのインキュベーション中に、max LDカラムをMIDI maxセルセパレーターにロードし、2ミリリットルのファックスバッファーでカラムを事前にすすぎます。次に、15ミリリットルの円錐管をカラムの下に置き、2.5ミリリットルのファックスバッファで8番目のセルに最大5倍の10をカラムにロードします。1回の洗浄につき2ミリリットルのファックスバッファーでカラムを3回洗浄し、カラムを通過して15ミリリットルのチューブに系統陰性細胞を収集します。

逃れたセルを数えます。次に、適切な蛍光標識抗体で細胞を染色した後、サンプルをファックスチューブに移し、目的のマーカープロファイルに基づいて一般的な樹状突起前駆細胞を選別します。ファックス精製した細胞を、5ミリリットルの完全なメディアを含む15ミリリットルのチューブに収集し、ファックス実行の最後に、ソーティングされた細胞の絶対数を記録します。

スピンダウン後、細胞は、マウス1匹当たりの滅菌PBSの総量100マイクロリットル当たりの精製された一般的な樹状細胞前駆細胞の1倍から5分の1に希釈し、細胞懸濁液を27ゲージ針を備えた1つの注射器に吸引する。次いで、養子移しの7〜10日後にちょうど実証されたように、各レシピエントCD45 2陽性インターフェロンα受容体ノックアウトマウスの尾静脈にCD45 1陽性前駆細胞を注入する。総樹状細胞前駆細胞から腸を取り出し、マウスを注入し、組織をPBSに浸したペーパータオルに置きます。

次に、細い鉗子とハサミを使用して、小腸の壁に沿って見えるすべての火葬パッチを収集します。パイアーズパッチは、1匹のマウス内でも構造的に異なることが多いため、すべてのP'Sパッチが識別され、分析されるように注意してください。分離されたP'SパッチをPBSを含むシャーレで鉗子を使用して3回洗浄し、糞便を取り除きます。

次に、1ミリリットルあたり1ミリグラムでP'Sパッチを消化し、50ミリリットルのフラスコにHBSSの10ミリリットルのうち4つをコラゲナーゼし、摂氏37度で激しく攪拌します。1時間後、消化されたPIパッチを40マイクロメートルのセルストレーナーに注ぎ、滅菌シリンジプランジャーを使用して細胞を15ミリリットルの円錐管に押し込みます。ろ過した細胞懸濁液をスピンダウンした後、ペレットをコール溶液あたり37%の6ミリリットルに再懸濁し、15ミリリットルのチューブに移します。

次に、コールあたり70%の溶液を6ミリリットル静かに置き、コールステップごとの勾配を形成します。次に、細胞を室温で800倍Gで20分間分離し、ブレークオフします。次に、界面で単核細胞集団を収集します。

採取した細胞をペレット化した後、50ミリリットルの完全培地で2回洗浄します。次に、適切な抗体で染色して、CD 45 1陽性のPYSパッチを検出します。養子縁組移植されたCD41陽性前駆細胞に由来する形質細胞様樹状細胞。

フローサイトメトリーで細胞を解析します。形質細胞様樹状細胞は、それらのCD11、C陽性、clec、H陽性、PDCA、1陽性B、20陽性、CD11B、陰性の表現型によって同定することができる。最後に、この式を使用して形質細胞様樹状細胞の絶対数を決定します。

これらのドットプロットは、一般的な樹状突起前駆細胞を単離するためのゲーティング戦略を示しています。マウスの骨髄細胞については、先ほど示したように、共通の樹状突起前駆細胞は全骨髄細胞の約0.1%を占め、10の約4〜6倍10〜4倍を占めます。これらのうち、1匹のマウスから単離し、フローサイトメトリーによりPIのパッチ形質細胞様樹状細胞を同定することができます。

最初の前方散乱および側方散乱ゲート戦略が使用され、続いてCD 11 C陽性clec H陽性細胞のゲーティングが行われます。インターフェロンα受容体ノックアウトマウスは、野生型マウスと比較して、pysパッチ形質細胞様樹状細胞の有意な減少を示します。一般的な樹状細胞前駆細胞も従来の樹状細胞に分化します。

形質細胞様樹状細胞とは対照的に、CD11 C陽性clec H陰性従来の樹状細胞は、野生型マウスとノックアウトマウスの両方で同様の量で観察されます。したがって、インターフェロンα受容体ノックアウトマウスは、致死的な照射の影響を受けずにPSパッチ形質細胞様樹状細胞の再構成を調べる機会を提供します。野生型の一般的な樹状突起前駆細胞のインターフェロンα受容体ノックアウトマウスへの養子移行は、ちょうど示されたように、PIのパッチ形質細胞様樹状細胞の増加を刺激します。

さらに、FL3リガンド流体力学的遺伝子導入による前処理は、PIパッチにおける形質細胞様樹状細胞の増殖をさらに増強し、これは、転移した共通の樹状細胞前駆細胞およびおそらく内因性のFL3陽性前駆細胞が、ピルスパッチ形質細胞様樹状細胞を誘導することによりFL3リガンドに応答することを示唆する。どちらの条件も、従来の樹状細胞の発生起源と一致するCD11C陽性clecH陰性従来の樹状細胞産生を刺激します。PYSパッチ形質細胞様樹状細胞は、clec H、PDCA 1およびB 2 20およびLAC CD11を含む伝統的な形質細胞様樹状細胞マーカーを発現 B.In、FL3リガンド流体力学的遺伝子導入および転移した共通樹状細胞前駆細胞の両方を受容するインターフェロンα受容体ノックアウトマウス由来のPYSパッチの分析は、形質細胞様樹状細胞の約70%がドナーCD45 1陽性の共通樹状細胞前駆細胞に由来することを示している。

まとめると、これらのデータは、一般的な樹状突起前駆細胞の養子導入が、in vivoでのFL3リガンド媒介シグナルに応答してPIのパッチ形質細胞様樹状細胞集団を誘導することを示しています。このビデオを見れば、Pars Patch plasmacytoid D細胞を単離し、同定する方法を十分に理解できるはずです。