4D共焦点顕微鏡を用いたゼブラフィッシュにおける顔面形態形成を分析する

この手順の全体的な目標は、発育中のゼブラフィッシュの頭の咽頭弓の動きを観察し、特徴付けることです。これは、まずトランスジェニックゼブラフィッシュの胚を麻酔薬アクロストゲルに埋め込むことによって達成されます。2番目のステップは、アガロース包埋胚をメチルセルロースの滴に顕微鏡スライド上にマウントすることです。

次に、胚を真空グリースで2つの顕微鏡スライドの間に密封します。最終的には、タイムラプス共焦点顕微鏡法を使用して、野生型と変異型ゼブラフィッシュの違い、および咽頭弓の形態形成運動を示します。静的イメージング法に対するこの手法の主な利点は、咽頭弓の発達をリアルタイムで捉えることができるため、研究者が形態形成に重要な組織の動きを直接観察できることです。

ブリッジカバースリップを作成するには、瞬間接着剤で、24 x 60のカバーガラスの両端に22 x 22のカバーガラスを貼り付けます。真ん中を空ける。生後1日未満の胚のシングルを作成します。

生後1〜4日齢の胚の場合は2倍、5日以上の胚の場合は3倍になります。そして、各試験片には、ブリッジ付きのカバースリップを2枚使用します。次に、10ミリリットルのシリンジに高真空グリースを充填します。

0.2%の液体arosで新鮮な麻酔薬を準備し、摂氏42度の加熱ブロックで維持します。手動でデコートするには、孵化していないトランスジェニック胚をゆっくりと引き裂き、胚が解放されるまでコーリアンを開きます。次に、コーティングされた胚をMS 2 22と審美的なものを含む清潔な培地に移します。

ブリッジ付きカバースリップを準備するには、真空グリースをシリンジからゆっくりと押し出し、ブリッジとカバースリップの端に隣接して内側にある滑らかな連続ビードを作ります。ブリッジの中央に4%メチルセルロースの円を広げて、滑りを覆います。胚に麻酔をかけたら、ガラスピペットに引き上げます。

ピペットを垂直に保持して、胚がピペット内の液体の底に沈むようにします。次に、ピペットをアグロ溶液に移し、液体を排出せずに胚をアロスに落下させます。アグロ溶液と胚をピペットに引き込みます。

次に、胚を一滴のaro溶液に排出します。メチルセルロースの上に。胚をメチルセルロース上に下向きに押し込み、必要に応じて胚の向きを合わせ、イメージングして標本を密封します。

取り付けられたカバースリップの上に、ブリッジ付きのカバースリップを1つ下に向けて置きます。ブリッジが直接接触し、アグロスドロップが両方のカバースリップにシールするまで、サンドイッチされたカバースリップの両側に均等な圧力をかけます。胚の向きが正しいことを確認します。

木製のアプリケーターをガラスに沿ってこすり、真空グリースの速度の亀裂や隙間を滑らかにします。端から余分なグリースを拭き取ります。共焦点顕微鏡と外部レーザーデバイスをアクティブにします。

また、共焦点顕微鏡に接続したコンピュータの電源を入れ、スタートシステムと共焦点イメージングソフトウェアを選択します。次に、共焦点顕微鏡のステージングプラットフォームを下げ、対物レンズを位置からずらします。デフォルトのステージを電子加熱ステージに交換します。

加熱ステージのコントローラーの電源を入れ、温度を摂氏29.5度に設定します。マウントされた試験片を加熱されたステージに置きます。20倍対物レンズを所定の位置に移動し、ステージングプラットフォームを持ち上げます。

次に、可視光エミッターをアクティブにし、胚の頭を視野の中央に配置します。蛍光チャンネルを活性化するには、検出する蛍光波長を選択し、各チャンネルのカラールックアップテーブルを選択します。蛍光チャネルごとに、レーザー強度を 10.0 に設定し、光増倍管電圧を 600 から 700 の間に設定します。

バックグラウンドを減らし、収集される蛍光情報を増やすには、平均化を 2 または 4 に設定し、ビット深度を 16 ビットに設定します。ZS スタックモジュールと時系列モジュールをアクティブにします。必要に応じてピンホールを調整します。

実験の時間間隔と長さを設定します。カメラをライブモードにします。ピントを調整し、必要に応じてレーザー強度を上げます。

蛍光を見るため。デジタルズームを0.6に設定すると、より広く表示されます。必要に応じて。

関心のあるすべての構造が見え、視野に成長の余地があるようにステージを配置します。背側および前方に、胚を通じて蛍光の上限と下限に焦点を合わせます。最初と最後のザックスライスの位置を、これらの制限を超えて少なくとも100マイクロメートル以上設定します。

次に、表示ルックアップ テーブルを範囲インジケーターに設定して、蛍光構造が灰色の濃淡で表示され、フィールドの残りの部分が青または黒になるようにします。必要に応じて、写真倍率の電圧を、飽和した赤いピクセルが表示されるレベルのすぐ下まで上げます。蛍光構造が赤く見える場合は、レーザー強度やゲインを下げて、灰色の色合いになります。

必要に応じて、オフセットを調整します。そのため、サンプルの外側の領域は青色です。画像をタイムリーに収集できる最小直径に を設定します。

Z間隔は常にピンホールの直径に推奨される最適な距離に設定し、設定をテストするために短いスキャンを実行し、常に可能な限り低いレーザー強度を使用する必要があります。次に、必要な時間だけ実験を実行します。その後、加熱段階から胚を取り出し、カバースリップをゆっくりと分離し、カバーを沈め、30ミリメートルのペトリ皿に胚を浸します。

ガラスピペットを使用して、カバースリップから胚をやさしく洗い流し、ペトリ皿からカバースリップを取り出します。胚を摂氏28.5度のインキュベーターに入れて、成長を続けます。実験の最後に、実験の開始時に標本と同様にステージングされたが、EMと摂氏28.5度のインキュベーターで育てられたアグロスマウント兄弟胚の個々のZack画像を撮ります。

野生型胚の共焦点ソフトウェアまたはその他のイメージング処理ソフトウェアを使用して、必要に応じて咽頭弓を測定します。神経堤集団に続いて、咽頭弓は吻側方向に移動しながら、前部後部および背側腹側AEに沿って伸びます。その前端では、最初の咽頭弓が上顎と下顎のドメインを形成し、口腔外胚葉によって分離され、主要な形態形成運動は、滑らかにされた変異体で大きく混乱します。

ここでは、7番目の咽頭弓は、受精後48時間までに、より多くの前弓と重なるように移動できなくなります。ゼブラフィッシュSMの5つの変異体は、多数の頭蓋顔面欠損を有する。これらの静的共焦点画像では。

第2弓と第3弓の腹側領域の融合は、受精後32時間までに明らかになります。タイムラプス共焦点顕微鏡を用いて、咽頭弓の形態形成を解析します。Smadでは、5つの突然変異体、2番目と3番目のアーチの間の融合が受精後32時間で最初に現れます。

静解析と一致しています。PDGFファミリーメンバーの発現は、それが咽頭弓に広く関与している可能性があることを示唆していますが、後弓の形態形成運動は正常に見えます。P-D-G-F-R-A変異体では、特に破壊されているように見えるのは最初の咽頭弓の形態形成です。

この手順は、モルフォ注射や遺伝子モザイクの生成など、他の一般的に使用されるゼブラフィッシュの技術に適しています。タイムラプス分析により、これらの操作の結果を直接分析できます。このビデオを見れば、トランスジェニックゼブラフィッシュ胚のタイムラプスin vivoイメージングを行う方法、適切な麻酔と標本の埋込、共焦点顕微鏡の理想的なパラメータの設定方法がよく理解できるはずです。