Name: 4D共焦点顕微鏡を用いたゼブラフィッシュにおける顔面形態形成を分析する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶ 4D共焦点顕微鏡を用いたゼブラフィッシュの顔面形態形成解析法。Danio rerio胚の咽頭弓運動をリアルタイムで観察し、野生型と変異体の形態形成運動の違いを明らかにする技術です。

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我々は彼らの専門家の魚のケアのためのメリッサ·グリフィンとジェナRozackyに感謝します。 PDMのおかげEGN支援、寛大さ、そして忍耐を書くため。この作品は、JKEにNIH / NIDCR R01DE020884によってサポートされていました。

1。畜産および変異対立<ol><li> 21が説明されているようにゼブラフィッシュを上げ、繁殖。 </li><li>本研究で用いたゼブラフィッシュ突然変異対立遺伝子は、16 b1059 Smad5をB1100 22、及びSMOのb577 23 PDGFRAた。これらのゼブラフィッシュの株のソースはZIRCが含まれています。 </li></ol> 2。ソリューションと実装の準備注：全ての溶液及び器具は、事前に行われ、将来の使用のために保存することができる。 <ol><li>以前に21を説明したように胚のメディア（EM）を作る。 </li><li> 4グラム/ LのMS-222（トリカイン）を作る。 450ミリリットルの無菌の水に4gのリン酸二ナトリウムせ（Na 2 HPO 4）に溶解する。この溶液に2グラムのMS-222を追加します。 7.0〜7.2以内のpHを調整する。 500ミリリットルの全容量に滅菌水を追加します。 </li><li>オプション：4グラム/ Lのクローブ油を作る。 50mlコニカルチューブに0.2グラムの純粋な丁子油を秤量する。 50ミリリットルの全容量にEMを追加します。 4℃で保存する</li><li> 3パーセントをするmethylcelluloSE。沸騰さのEM + 0.1のHEPESの50ミリリットルを持参してください。暑さから削除します。溶液が均質になるまで1.5グラムのメチルセルロースで撹拌する。 4℃で保存する</li><li> 0.2％アガロースを作る。 50ミリリットルのEMに0.1グラムアガロースを追加します。電子レンジやホットプレート上で沸騰にEMを持参し、アガロースが溶解していることを確認してください。 4℃のマイクロチューブや店舗での500μlのボリュームに分割量注：必要に応じてボリュームを調整することができる。 </li><li>キャピラリー火かき棒をする。 0.9ミリメートルのキャピ​​ラリ管内のスーパー接着剤の滴を配置します。ラインの約3〜4 mmは、管の端部を越えて延びるようにキャピラリーチューブの内側に6ポンドテストモノフィラメント釣り糸4-5センチの長さを挿入します。 </li><li>試料ごとに2つの橋かけカバースリップをする。スーパーグルー22 X 22から1のカバーガラス24×60から1、カバーガラスの各末端に真ん中の自由を残す。古い日未満の胚のためのシングル（エンドにつき1小さなカバーガラス）を作る、一から四Dは胚について（終了ごとに互いの上に2つの小さなカバーガラス）倍に胚5日またはそれ以上の年齢の古いAYS、またはトリプル（エンドにつき互いの上に3つの小さなカバーガラス）。 </li><li>高真空グリースで10ミリリットルの注射器を埋める。注：真空グリースは、長期間にわたって標本の脱水を防止するためのシール材として機能し、より揮発性のシーラントに比べて毒性の低い可能性を有する。 </li></ol> 3。共焦点顕微鏡用の取り付けゼブラフィッシュ胚（図1を参照してください） <ol><li>麻酔メディアを準備します。完全に液体になるまで20秒間隔で電子レンジで0.2％アガロースの一定量を溶かす。 0.2％アガロースの195μLに0.2％アガロースまたは4グラム/ Lのチョウジ油の5μlを192μLに、MS-222の8μLを混ぜる。 42℃の加熱ブロックに維持する。注意：MS-222への長時間露光が胚ゼブラフィッシュ24で行いチョウジ油よりも強い発達の遅れの原因となる。 </li><li>必要に応じて手動で孵化していないトランスジェニック胚は、直前に分析するために分析されるようにdechorionate。鉗子を用いて、ゆっくりテ胚が解放されるまで営業絨毛膜AR。 </li><li>ゼブラフィッシュ胚を麻酔。胚培地24 mlに、MS-222の4グラム/ Lの株式の1ミリリットルを追加します。代わりに、魚の水24の24ミリリットルに4グラム/ Lのチョウジ油の390μlを加える。注意：クローブ油が作用して、ゆっくりとそうタイムラプス顕微鏡検査前に、少なくとも15〜20分をこの手順を実行します。 </li><li>上向きの橋かけカバースリップの中心領域の周りに真空グリースのビードを配置します。ゆっくりと、そして橋やカバーガラスのエッジの内側に隣接しており、滑らかで連続的なビーズを作り、注射器の外に真空グリースを押してください。 </li><li>木製アプリケーターを用いて架橋したカバースリップの中央に4％のメチルセルロースの輪を広げた。 </li><li>画像化される胚を転送します。胚を麻酔されたときにガラスピペットにそれを作成する。胚がピペット内の液体の底に沈むことができるように垂直にピペットを保持する。アガロース溶液にピペットを移動し、胚がドロップすることができますアガロースに。液体を排出しないでください。 </li><li>試料を配置します。ピペットにいくつかのアガロース溶液および胚を描く。メチルセルロースの上にアガロース溶液の液滴で胚を追放。メチルセルロース上に下向きの胚を押して画像化のために必要に応じて胚を配向させる毛管ポーカーを使用してください。 </li><li>試料を密閉する。 <ol><li>下向きにし、取り付けられた1の上に1橋かけカバーガラスを配置します。ブリッジは、両方のカバーグラスに直接接触し、アガロースドロップシールを作るまでに挟まれたカバーガラスの両側に均等に力を加える。胚が適切に配向していることを確認してください。 </li><li>真空グリースビーズに亀裂や隙間を滑らかにガラスに沿って木製のアプリケーターをこする。エッジから余分なグリースを拭き取ってください。 </li></ol></li></ol> 4。トランスジェニックゼブラフィッシュ胚のタイムラプス共焦点イメージング （このプロトコルは、ツァイスLSM 710共焦点顕微鏡私たちのために最適化されていますZENイメージングソフトウェアをING、他のシステムで使用するために改変することができる。） <ol><li>機器をアクティブにします。共焦点顕微鏡と外部レーザー装置の電源をオンにします。共焦点顕微鏡に接続されたコンピュータの電源を入れます。オープンな共焦点イメージングソフトウェアおよび画像取得コントロールをアクティブにする &quot;スタートシステム」を選択します。 </li><li>加熱されたステージを準備します。共焦点顕微鏡のステージングプラットフォームを下げ、所定の位置からの対物レンズを移動させる。電子加熱段階で​​デフォルトのステージを交換してください。加熱された段階のためのコントローラの電源をオンにし、29.5℃で温度を設定</li><li>視野内の試験片を置きます。ステージ上に搭載試料を配置します。所定の位置に20倍の対物レンズを移動させ、ステージングプラットフォームを上げる。可視光発光体を活性化させ、接眼レンズに目を通す。視野内胚の頭を中央に配置します。 </li><li>実験の設定を定義します。 <ol><li>選択することにより、蛍光チャネルを活性化する検出されるべき蛍光波長チャネルごとにカラールックアップテーブル（LUT）を選択する。必要に応じて、必要なレーザ（RFP用など 561 nm）をオンにするソフトウェアで手動制御を使用しています。各蛍光チャネルに対して、600〜700の間に10.0レーザ強度​​と光電子増倍管電圧（HV又はゲイン）を設定する。 4に平均化し、16ビットのビット深度を設定します。 </li><li> zスタックおよび時系列のモジュールをアクティブにします。 5μm以下のZ分解能のためのピンホールを設定し、提案し、最適な距離に、Z間隔を設定します。 注意：一般的に、5〜Zの解像度は、個々の細胞の解決中に各zスタック画像は、特定の時点で胚の「スナップショット」のために十分迅速に収集することができます。平均値を下げると、画像あたりの時間の量を減少させる。 </li><li>画像間の所望の時間間隔（通常10〜20分）、実験の全体​​の長さを規定する。 </li></ol></li><li>位置設定情報。 <ol><li>ライブモードでカメラの電源を入れます。フォーカスを調整し、必要に応じて蛍光を見るためにレーザー強度を増加させる。必要に応じて、より広い視野のために0.6にデジタルズームを設定します。 </li><li>関心のあるすべての構造が表示され、前方に伸長背側とのための視野に余裕があるように、ステージの位置を決めます。蛍光の上限値と下限値の胚を通じて焦点を当てています。最初と最後のZ-スタックスライス位置、これらの制限を超えて少なくとも100μm以上に設定してください。 </li></ol></li><li>蛍光強度を最適化します。 <ol><li>インジケータを範囲に表示LUTを設定します。蛍光構造が今白く見えるべきであり、視野の残りの部分は、（無検出）青または黒である必要があります。 </li><li>ちょうど飽和場所の下のレベルにHV /ゲインを上げる（赤）の画素が表示されます。必要に応じて、バックグラウンドの大部分が（青色）が検出されないようにオフセットを調整。両方より小さいピンホール径の増加レーザー強度をDEFイメージを改善します。注initionが、レーザー強度は、生体組織を維持するために低く保たなければならない。 HV /ゲインとピンホール径を増加させた（&lt;5μm）を、一般的に増加し、レーザ強度​​よりも好ましい。 </li><li> 4にセットを平均化、タイムリーに画像を収集するのに十分な幅ピンホール径を保管してください。 Z-間隔は常にピンホール径の推奨最適な距離に設定する必要があります。異なる設定で、短いスキャン（平均= 1）を実行し、所望の解像度を実現する最小のレーザー強度を使用しています。 </li></ol></li><li>所望の時間のための実験を​​実施します。その後、加熱された段階から胚を削除して、徐々にカバースリップを分離する。 30ミリメートルペトリ皿に、EMでのカバーガラスや胚を沈める。ガラスピペットを使用すると、静かにカバーガラスの外胚を洗浄し、ペトリ皿からカバースリップを削除します。開発を継続するために28.5℃のインキュベーターに胚を置きます。 </li><li>成長を比較してください。実験の最後に、個々のZsがかかる同様に、実験の開始時に試料に上演されましたが、28.5℃のインキュベーター中で、EMで育ったアガロースマウント兄弟胚のタックイメージ。 </li><li>必要に応じて、咽頭のアーチを測定します。測定値は、いくつかの共焦点ソフトウェアスイートで行うことができる。ここに見出さ測定は、個々のフレームの。LSMファイルをインポートし、Z-投影することによってFiji25を用いて行った。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

タイムラプス共焦点顕微鏡は、開発の分析のための強力なツールです。ここでは、神経堤細胞を標識するトランスジェニックを用いて、重要なシグナル伝達経路のための変異体であるゼブラフィッシュにおける咽頭弓の形態形成を研究する方法の有用性を示す。組織レベルに加え分析では、時間経過の分析はまた、細胞スケール28で解析に適用可能である。多くの広く使用されているゼブラフィッシュの方法はまた、モルホリノのマイクロインジェクションのmRNA、またはトランスジェニック構築物、並びに胚移植の間を含むタイムラプス顕微鏡実験、組み込むことができる。複数の現像組織の分析にのみ蛍光標識組織への能力によって、クロストークなしに異なる蛍光体の所望の数を検出するための共焦点顕微鏡の能力によって制限される。ゼブラフィッシュ胚のクラッチから撮像することができる個人の数厳しく制約されているが、高度な技術同じ期間に、いくつかの胚の自動画像化を可能にする。簡単に早い時点で識別されない突然変異体の経時的解析を実行しようとする場合に特に有用である。 タイムラプス共焦点画像から測定を行う場合には、いくつかの発達遅延...

頭蓋顔面形態形成は、複数の細胞型の協調的相互作用を必要とする複雑な多段階プロセスである。頭蓋顔面骨格の大部分は神経堤細胞に由来し、その多くは、咽頭のアーチ1と呼ばれる一過性の構造に背側神経管から移行する必要があります。多くの組織と同様に、頭蓋顔面骨格の形態形成は、特定の発生時点での胚の静止画像によって理解することができるよりも複雑である。それは時間のかかる実行することであるが、in vivoでのタイムラプス顕微鏡は、発生中の胚の細胞や組織での連続に説明します。タイムラプスシリーズの各画像は他の人に文脈を貸すと、現象が発生する理由推測ではなく、その時点で何が起きているか推測に向けて研究者の動きを支援します。 in vivoイメージングではこのように実験的なアプローチのための強力な説明的なツールです形態形成を誘導する経路を分解。ゼブラフィッシュゼブラフィッシュは、脊椎動物の胚発生の人気遺伝モデルであり、形態形成のin vivoイメージングのために特に適しています。近代的な、遺伝子導入およびゲノム修飾のための便利な方法が急速にゼブラフィッシュ研究者に利用可能なツールの数を進めています。これらのツールは、遺伝子操作し、顕微鏡検査のため、既に堅牢な方法を強化します。ほぼすべての所望の遺伝的文脈で、ほぼすべての組織のin vivoイメージングはファンタジーより現実に近い。 咽頭のアーチの形態形成運動は、神経堤と隣接する上皮、外胚葉と内胚葉の両方の間の相互作用のシグナリングによって案内される。頭蓋顔面骨格要素の形態形成を推進するために必要である上皮で表現多数のシグナル伝達分子があります。これらのシグナル伝達分子の中では、ソニック·ザ·ヘッジホッグ（Shhは）は非常に重要であるFまたは頭蓋顔面の開発2-8。 SHHは、経口外胚葉および咽頭内胚葉2,6,9,10の両方で表される。内胚葉におけるShhの発現は、アーチ10、アーチ10内神経堤のパターニング、および頭蓋顔面骨格の11の成長の形態形成の動きを規制している。 BMPシグナル伝達は、頭蓋顔面の開発12のためにも極めて重要であると咽頭のアーチの形態形成を変更することがあります。 BMPシグナル伝達は、咽頭のアーチ13,14内堤の背/腹パターン形成を調節する。ゼブラフィッシュにおけるSmad5をの破壊は深刻な口蓋欠陥や正中線15に適切に融合するメッケル軟骨の障害が発生します。さらに、変異体はまた、正中線15で融合咽頭弓の要素番目の 2 番目、3番目 、時には4で、腹側軟骨要素の減少との融合を表示。これらの融合が強くBMPシグナル伝達は、これらの咽頭要素の形態形成を指示することを示唆している。 PDGFシグナル伝達は、頭蓋顔面の開発のために必要であるが、咽頭弓の形態形成における未知の役割を持っています。マウスやゼブラフィッシュPDGFRA変異体の両方が深いmidfacial分裂文形成16〜18を持っている。少なくともゼブラフィッシュでこのmidfacial分裂文形成は、適切な神経堤細胞の遊走16の故障が原因です。神経堤細胞は、咽頭のアーチを入力した後PDGFRAを発現し続ける。さらに、PDGFリガンドは、顔の上皮で発現され、咽頭のアーチ16,19,20内で、このようにPDGFシグナル伝達はまた移行後に咽頭弓の形態形成における役割を果たしている可能性があります。しかし、PDGFRA変異体におけるアーチが行われていない咽頭の形態形成の解析を行う。 ここでは、pharyngulのインビボ共焦点顕微鏡法で証明するステージトランスジェニックゼブラフィッシュとは、この期間内に咽頭のアーチの形態形成を説明します。我々はさらに、BMP、PDGF及びShhシグナル伝達経路を破壊する変異によって影響される組織の挙動を示す。

<table><tbody><tr><td>6ポンドテストモノフィラメントライン</td><td>コートランドライン会社</td><td>SLB16</td><td></td></tr>ア<tr><td>ガロースI</td><td>アムレスコ</td><td>0710</td><td></td></tr><tr><td>アルゴン</td><td>レーザーLASOS Lasertechnik GmbH</td><td>LGN 3001</td><td></td></tr>塩化<tr><td>カルシウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>キャピラリーチューブ、100 mm、0.9 mm ID</td><td>FHC</td><td>30-31-0</td><td></td></tr><tr><td>クローブオイル</td><td>ヒルテックカナダ</td><td>HB-102</td><td></td></tr><tr><td>高真空グリース</td><td>ダウ コーニング</td><td>2021846-0807</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp ドライバスインキュベーター</td><td>Fisher Scientific</td><td>2050FS</td><td></td></tr><tr><td>レーザー走査型顕微鏡</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム六水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス、22 x 22-1</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス、24 x 60-1</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>M-11321</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム二塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>M-11624</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>TempController 2000-2</td><td>PeCon GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemical, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

4d共焦点顕微鏡を用いたゼブラフィッシュにおける顔面形態形成を分析する

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

タイムラプスイメージングは​​、形態形成の過程を直接観察を可能にした技術、あるいは形状の生成である。原因遺伝子操作への光学的透明度と従順に、ゼブラフィッシュ胚は生きている胚における形態形成の経時的分析を行うことで人気のモデル生物となっています。ライブゼブラフィッシュ胚の共焦点イメージングは​​、対象となる組織が持続的な導入遺伝子または注入された色素、蛍光マーカーで標識されている必要があります。プロセスは、胚が健全な発展が正常に進行するように麻酔し、所定の位置に保持されることを要求する。画像化のためのパラメータは、三次元成長を考慮して設定する必要があり、開発の迅速なスナップショットを取得している間に個々の細胞の解決の要求のバランスを取る。我々の結果は、蛍光標識されたゼブラフィッシュ胚のインビボイメージングにおける長期を実行し、多様な組織における行動を検出するための能力を実証頭蓋顔面異常を引き起こす頭蓋神経堤。麻酔および取り付けに起因する発達の遅れは最小限であり、胚はプロセスによって無傷である。タイムラプス画像化された胚を液体培地に戻され、その後、画像化や開発の後のポイントで固定することができる。トランスジェニックゼブラフィッシュ系統の増加量および十分に特徴付けられた運命のマッピングや移植技術を用いて、任意の所望の組織を画像化することは可能です。このように、in vivoイメージングの経時は、変異型とマイクロインジェクションされた胚の分析を含めたゼブラフィッシュ遺伝的方法で強力に兼ね備えています。

吻側方向（ 動画1）に移動しながら、野生型胚において、神経堤人口以下、咽頭のアーチは、前方/後方背側/腹軸に沿って細長く。 30時間後に受精（HPF）において、第咽頭弓の前方/後方の長さは、1.8〜1.9倍の背側/腹側の高さの間である。背側/腹側伸びが速く36.5 HPFまで、前方/後方の拡張よりも、着実に進む。ここから、背側/腹側の高さの高原の周りに104程度48 HPFを通して。前方/後方の拡張子は、全体的な前方/後方の長さは48 HPFで1.95倍の背側/腹側の高さにHPF 36.5で1.5倍の背側/腹側の高さの下から増加に伴って、48 HPFまで続く。 その前端で、第咽頭弓が上顎（背側）と下顎口腔外胚葉で区切って（腹側）ドメインを形成している。最初の咽頭弓の上顎ドメインはfを測定し、口腔外胚葉の後方頂点に、その遠位端をROMをこれは、30〜48 HPF間4.6ミクロン/時（R 2 = 0.9374）で、線形回帰で近似率で成長し、48 HPF（ 動画1）で約104ミクロンの長さである。 ...

タイムラプス共焦点イメージングは​​、胚発生を特徴づけるための有用な強力な技術である。ここでは、方法論を記述し、野生型では頭蓋顔面形態形成を特徴づけるとともに、PDGFRA、Smad5を、そしてSMO変異胚。

4D共焦点顕微鏡を用いたゼブラフィッシュにおける顔面形態形成を分析する

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

この手順の全体的な目的は、発生過程にあるゼブラフィッシュの頭部における咽頭弓の動きを観察し、特徴付けることです。まず、トランスジェニックゼブラフィッシュ胚を麻酔剤を含むアクロストゲルに包埋します。次に、アガロースに包埋した胚を、顕微鏡スライド上のメチルセルロースの一滴に固定します。次に、胚を真空グリスを用いて2枚の顕微鏡スライドガラスの間で密封します。最終的に、タイムラプス共焦点顕微鏡を用いて、野生型と変異型ゼブラフィッシュの違い、および鰓弓の形態形成運動を観察します。静止画撮影法に対する本手法の主な利点は、鰓弓の発達をリアルタイムで捉えることができ、形態形成に不可欠な組織運動を直接観察できる点にあります。ブリッジ型カバーガラスを作成するには、24 × 60のカバーガラスの両端に、22 × 22のカバーガラスを瞬間接着剤で接着します。中央部分は開けておいてください。受精後1日未満の胚に対しては、シングル（単独用）を作成してください。胚齢1〜4日の胚にはダブル、胚齢5日以上の胚にはトリプルを使用します。また、各検体につき、ブリッジ付きカバーガラスを2枚使用してください。次に、10 mLシリンジに高真空グリースを満たします。0.2% liquid arosで新鮮な麻酔薬を調製し、42 °Cのヒーティングブロックで保持します。孵化していない形質転換胚の脱被膜を手動で行うには、胚が解放されるまでコリオンの膜をゆっくりと破ります。その後、被膜を除去した胚を、MS 2 22と麻酔薬を含む清潔な培地に移します。ブリッジ付きカバーガラスを準備するには、シリンジから真空グリースをゆっくりと押し出し、ブリッジの内側およびカバーガラスの縁に沿って、滑らかに連続したビーズ状に塗布します。ブリッジとカバーガラスの中央に、4% Methylcelluloseを円状に広げます。胚を麻酔させた後、ガラスピペットで吸い上げます。ピペットを垂直に保持し、胚がピペット内の液体の底に沈むようにします。次に、ピペットをアグロ溶液の中に移動させ、液体を排出せずに胚をアグロ溶液中に落下させます。アグロ溶液と胚を一緒にピペット内に吸い込みます。次に、胚をaro溶液のドロップの中に排出します。メチルセルロースの上に配置し、胚をメチルセルロースに向けて押し下げ、イメージングに最適な方向に向いた状態で固定して標本を密閉します。装着したカバーガラスの上に、下向きにしたブリッジ付きカバーガラスを1枚重ねます。ブリッジが直接接触し、アガロース液が両方のカバーガラスに密着するまで、挟み込んだカバーガラスの両側に均等に圧力をかけます。胚が正しく配置されていることを確認してください。ガラスに沿って木製アプリケーターを擦り、真空グリース塗布層の亀裂や隙間を平滑にします。縁にある余分なグリースを拭き取ります。共焦点顕微鏡および外部レーザー装置を起動します。共焦点顕微鏡に接続されているコンピュータの電源を入れ、「システム起動」と共焦点イメージングソフトウェアを選択します。次に、共焦点顕微鏡のステージプラットフォームを下げ、対物レンズを位置から外します。デフォルトのステージを電子加熱ステージに交換します。加熱ステージのコントローラーの電源を入れ、温度を29.5 °Cに設定します。マウントした検体を加熱ステージ上に配置します。20倍の対物レンズを所定の位置に移動させ、ステージプラットフォームを上昇させます。次に、可視光エミッターを起動し、胚の頭部を視野の中央に配置します。蛍光チャンネルを有効にするには、検出する蛍光波長を選択し、各チャンネルのカラールックアップテーブルを選択します。各蛍光チャンネルについて、レーザー強度を10.0に、光電子増倍管電圧を600から700の間に設定します。背景ノイズを低減し、収集される蛍光情報を増やすために、平均化回数を2回または4回に設定し、ビット深度を16ビットに設定します。ZSスタックおよびタイムシリーズモジュールを有効にします。必要に応じてピンホールを調整してください。時間間隔と実験時間を設定します。カメラをライブモードに切り替えます。フォーカスを調整し、必要に応じてレーザー強度を上げます。蛍光を確認します。必要に応じて、より広い視野を得るためにデジタルズームを0.6に設定してください。関心のあるすべての構造が見え、かつ成長のための視野に余裕があるようにステージを配置します。胚を透過させ、背側および前方から、蛍光の上下限にピントを合わせます。最初のZackスライス位置と最後のZackスライス位置を、これらの制限から少なくとも 100 µm 以上離して設定します。次に、ディスプレイルックアップテーブルをレンジインジケーターに設定し、蛍光構造がグレーの陰影で表示され、それ以外の視野が青または黒になるようにします。必要に応じて、飽和した赤色ピクセルが出現する直前のレベルまで光電子増倍管の電圧を上げてください。蛍光構造が赤く見える場合は、グレーの陰影になるまでレーザー強度またはゲインを下げてください。必要に応じてオフセットを調整し、サンプルの外側が青色になるようにします。画像を適時に収集できる最小の直径に設定してください。Z間隔は、ピンホール径に対して推奨される最適な距離に常に設定してください。設定を確認するために短いスキャンを行い、その際は常に可能な限り低いレーザー強度を使用してください。次に、希望の時間分だけ実験を実施します。終了後、加熱ステージから胚を取り出し、カバーガラスをゆっくりと離し、カバーガラスと胚を30 mmのペトリ皿に浸します。ガラスピペットを使用して、カバーガラスから胚を慎重に洗い流し、カバーガラスをペトリ皿から取り除きます。胚を28.5 °Cのインキュベーターに入れ、さらに発生させます。実験の終了時に、実験開始時の標本と同程度のステージにあり、同様にEMおよび28.5 °Cのインキュベーターで育成した、アガロース固定した兄弟胚の個別のZスタック画像を撮影します。共焦点顕微鏡ソフトウェアまたはその他の画像処理ソフトウェアを使用して、野生型胚の鰓弓を必要に応じて測定します。神経堤細胞の定着後、鰓弓は吻側へと移動しながら、前後の軸および背腹の軸に沿って伸長します。第1鰓弓の前端では、口腔外胚葉によって隔てられた上顎および下顎領域が形成されます。これらの重要な形態形成運動は、smoothened変異体において著しく阻害されます。ここでは、受精後48時間までに、第7鰓弓が前方にある鰓弓と重なるように適切に移動できていません。ゼブラフィッシュのSM five変異体では、多数の頭蓋顔面欠損が見られます。これらの静止共焦点画像において。受精後32時間までに、第2および第3鰓弓の腹側領域における融合が認められます。タイムラプス共焦点顕微鏡を用いて、鰓弓の形態形成を解析します。Smad five変異体では、受精後32時間で第2鰓弓と第3鰓弓の間の融合が最初に現れます。静的解析の結果と一致しています。PDGFファミリーメンバーの発現から、これらが咽頭弓形成に広く関与していることが示唆されますが、後方の咽頭弓の運動は正常に見えます。PDGFR\(\alpha\)変異体では、特に第1咽頭弓の形態形成が阻害されていると考えられます。この手順は、モルフォリノ注入や遺伝的モザイクの作製など、ゼブラフィッシュで一般的に用いられる他の手法にも適用可能です。タイムラプス解析を行うことで、これらの操作による影響を直接的に分析することができます。このビデオを視聴することで、検体の適切な麻酔と固定を行い、共焦点顕微鏡の最適なパラメータを設定し、トランスジェニック・ゼブラフィッシュ胚のin vivoタイムラプスイメージングを実施する方法を十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、我々は共焦点顕微鏡による単一細胞の解像度でのライブゼブラフィッシュの胚で開発脊椎動物の脳を分析するためにする方法を示しています。これは、我々は、単一セルのゼブラフィッシュの胚を注入し、その後、脳の発達をマウントし、イメージする方法が含まれています。...

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

幼虫ゼブラフィッシュにおける脳血管の開発の撮像が記載されている。 3Dイメージングを容易にし、化学的処理を用いて脳血管発達を改変するための技術も提供される。...

イメージングおよび胚ゼブラフィッシュにおける脳血管構造物の3次元再構成

実験データの可視化は、科学界に結果を提示する重要な要素となっています。成長した胚のライブタイムラプス撮影の生成は複雑な発達過程をより良くプレゼンテーションや理解に貢献しています。このプロトコルは、ゼブラフィッシュで楓タンパク質の光変換を経由して細胞標識へのステップバイステップガイドです。...

SOX10中の顔面の開発の可視化：楓トランスジェニックゼブラフィッシュラインタイムラプス共焦点顕微鏡を用いて

頭蓋顔面骨の細胞組織が長いと仮定されず、直接可視化はありませんでした。マルチスペクトル細胞標識および in vivoライブで  イメージングは​​、ゼブラフィッシュ下顎における動的な細胞の挙動の可視化を可能にします。ここでは、詳細プロトコルはZebrabowトランスジェニック魚を操作し、直接細胞のインターカレーションとメッケル軟骨における軟骨細胞の形態学的変化を観察します。...

胚性メッケル軟骨でZebrabowクローン細胞分析によって軟骨細胞のインターカレーションと方向性増殖の可視化

ここでは、正常な発達を乱すことなく、生きたゼブラフィッシュの胚の後部体の発達を長期間のタイムラプスイメージングを可能にする汎用性の高いマウント方法を紹介します。...

ゼブラフィッシュの開発の長期イメージングのための多彩な取り付け方法

長い波長多光子蛍光励起顕微鏡レーザーの高度な光学技術の組み合わせは、Tg (sox10:EGFP) および Tg (foxd3:GFP)...

リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプス イメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化

インビボイメージングは、神経系の発達の根底にある細胞メカニズムを調査するために使用できる強力なツールです。ここでは、開発中のゼブラフィッシュ神経系の中で、多色Brainbow標識細胞をリアルタイムに可視化するために、タイムラプス共焦点顕微鏡を用いる手法について説明する。...

Brainbowとタイムラプス共焦点イメージングを用いた生きているゼブラフィッシュの発達脳の可視化

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ早期眼の開発におけるトトラベリングおよび多次元イメージングのアプローチを記述する。レーザー走査共焦点顕微鏡によるラベリング、埋め込み、4次元(4D)イメージング、および光学カップ形態形成の解剖機構のためのデータセットの取得を最適化するための考慮事項について述べる。...

ゼブラフィッシュオプティクスカップ形態形成の4次元イメージング

ここで説明するプロトコルは、生後5日のゼブラフィッシュ幼虫の頭蓋顔面軟骨を染色および解剖するための簡単で従いやすい手順を示しています。さまざまな発達条件下でのこれらの構造の解剖学的構造、形状、サイズを研究するために使用できます。...

アルシアンブルー染色時のゼブラフィッシュ頭蓋顔面組織の解剖

本研究は、ゼブラフィッシュ幼生の顔面構造変化を測定するために、無料ソフトウェア(tpsDigs2、MorphoJ、PAST)を用いて頭蓋顔面軟骨の形状を定量化するプロトコルを説明しています。...

形状の形態計測解析:ゼブラフィッシュにおける頭蓋顔面形状定量化のための解析ソフトウェアツールボックス

学ぶ 4D共焦点顕微鏡を用いたゼブラフィッシュの顔面形態形成解析法。Danio rerio胚の咽頭弓運動をリアルタイムで観察し、野生型と変異体の形態形成運動の違いを明らかにする技術です。

4D共焦点顕微鏡を用いたゼブラフィッシュにおける顔面形態形成を分析する

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