Name: 腎臓からの二重否定αβT細胞の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 学ぶマウス腎臓からの二重否定αβT細胞分離法。コラゲナーゼ消化と密度勾配遠心、磁気ビーズによる陽性・陰性選択を用いて高純度のDN T細胞を単離し、腎臓傷害における免疫応答メカニズムを解明する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、NIHのPBS（R 21 AI095484）によってサポートされています。私たちは、CD1dの四量体のために薬価四量体中核施設に感謝します。

1。楽器の調製、培養培地および試薬<ol><li>楽器：無菌条件下で試薬を準備し、層流フードの下で使用しています。 </li><li>ウシ胎児血清5％、炭酸水素塩2.1gを10mlのグルタミン酸、100倍、HEPESを10mg、1mgのピルビン酸ナトリウム及び10mlの100倍のペニシリン/ストレプトマイシンを追加し、RPMI組織培地を1リットル調製する。 注：推奨される組織培養培地、RPMIは、DMEMと交換可能である。 </li><li> 5％のコラゲナーゼ &quot;D&quot;溶液（組織培養培地9mlにコラゲナーゼ5mlの「D」）を調製する。 </li><li>三つの異なる濃度でのパーコール溶液を作る：100％、80％および40％であった。以下の濃度を、1サンプルについて計算される。室温でのソリューションにしてください。 <ol><li>パーコール液（原液から）希釈されていないパーコールの9ミリリットルを追加します。 PBSを10倍の1ミリリットルを加える。 </li><li>パーコール液：パーコール100パーセントの8ミリリットルを追加します。 PBS 1Xの2ミリリットルを追加します。 </li><li>パーコール液：パーコール80パーセントの4ミリリットルを追加します。 PBS 1Xの4ミリリットルを追加。 </li></ol></li><li> （FACS）のバッファを蛍光活性化細胞選別の1リットルを作る。 5ミリリットルの10％BSA（0.1％BSA）1mlの10％アジ化ナトリウム（0.1％）2mlのEDTA剤は、1×PBSで1000 mlに構成し、追加する。 </li></ol>腎臓消化の2。準備<ol><li>必要な制度の承認を取得した、犠牲と放血マウスを標準的な方法で、現在の規制や動物のケアのガイドラインに従うこと。 <ol><li>ペントバルビタール（0.07 mg / kg）をして、マウスを麻酔。 </li><li>放血に進みます。 </li><li>手術台上の仰臥位でマウスを置きます。 </li><li> 70％エタノールで腹部をスプレーしてください。 </li></ol></li><li>ペトリ皿にコラゲナーゼD溶液10mlを加える。 </li><li>各マウスから両方の腎臓を削除し、カプセル化解除。 <ol><li>胸骨からに腹部の皮膚および腹膜を通して正中切開を行うことによってabdomimal空洞を開く恥骨。 </li><li>側に横方向に腸に移動することにより、左の腎臓を公開します。 </li><li>慎重にピンセットで左のカプセルを分離する。 注：カプセルは腎臓の周囲の透明層として表示され、部分的に腎周囲脂肪組織でカバー。 </li><li>外科はさみを使用して椎弓血管を切断することにより、左の腎臓を削除します。 </li><li>右腎に対して同じ手順を繰り返します。 注：右腎より頭蓋正中（小花柄が短い）に近い。 </li></ol></li><li>ペトリ皿に腎臓を置きます。 </li><li>定期的な金属成形ブレードを用いて小片に腎組織（寸法1〜2 mm）をカットします（ 図1）37℃のインキュベーター内で30〜45分間コラゲナーゼ溶液にピースを置きます。 </li></ol>腎臓消化から腎臓単核細胞（KMNC）の3。準備<ol><li>腎臓の細胞懸濁液を得機械的に組織培養培地25ml中にストレーナ（70ミクロン）を用いて再懸濁し、混合組織を破壊することによる消化。 </li><li>細胞懸濁液をペレット化し、4℃で10分間、400×gで遠心する。 </li><li>非常にゆっくりと慎重に、40％パーコール溶液4mlでペレットを再懸濁し、穏やかに転送プラスチックピペットを用いて80％のパーコール溶液4mlに重ねる。これは明らかに、半透明の層によって分離された2つの相をもたらすであろう。一番上の脂質に対応する黄色の層となる。 </li><li>ブレーキオフモードで遠心分離して、室温で30分間、1,500×gで遠心分離する。 </li><li>吸引によって、黄色、厚いトップ層（約1〜2 ml）を外します。 </li><li>トランスファーピペットで2相の界面からのわずかな白っぽい半透明の層を収集します。非常に慎重に組織培養培地2mlを含有する15ミリリットルの円錐管を減らすこの懸濁液を転送し、その後の全量を13mlの培地を加える15ミリリットル。 </li><li> 4℃で10分間400×gで遠心分離</li><li>培地の1ミリリットルのサンプルを懸濁します。 </li><li>血球計数器でパンブルー排除を用いてKMNCの数をカウントし、腎臓あたりのml当たりKMNCの数字として結果を表現しています。 </li><li>上記のように一度洗う。 </li></ol>造血の4。分離KMNCから（CD45 +）細胞（ステップI） <ol><li>ランニング緩衝液90μlの中に10 7に細胞を再懸濁します。 </li><li> CD45マイクロビーズを10μlを加え、4℃で15分間インキュベート</li><li>反応を停止させ、ランニングバッファーの1ミリリットルを追加します。ランニング緩衝液500μlに4℃の再懸濁で10分間400×gで遠心します。 </li><li>磁石で配置することで、磁気カラムを準備し、ランニング緩衝液3mlで洗い流してください。 </li><li>磁気カラムを通して細胞懸濁液をパスし、カラムを通過する非標識細胞を収集します。 </li><li> runnの3ミリリットルで細胞を3回洗浄するバッファをING。その後、流出物を収集します。 </li><li>セパレータとピペットカラムにランニング緩衝液の5ミリリットルから列を削除し、すぐにラベルされた分を洗い流す。この画分は、CD45 +細胞が含まれています。細胞を数える。 </li><li>腎臓への異なるT細胞サブセットの絶対数を計算するには、フローサイトメトリーによって決定さ陽性細胞の割合（ 図2）によってKMNCの総数を乗算する。 </li></ol>ネガティブ選択によりCD45陽性の準備から、DN T細胞の5。アイソレーション（工程II） <ol><li>以下のビオチン化抗体の各々2.5μlの（0.5 mg / mlの、1.25μgの）追加：抗CD4、抗CD8、抗Fc受容体（CD16/32）を、抗MHCクラスII（IA b）は、抗すべての10 7造血細胞のためのCD1d PBS-57四量体。 </li><li>低温室で30分間細胞をインキュベートします。 </li><li> 1ミリリットル抗ビオチンマイクロビーズを追加します。 </li><li>低温室で30分間インキュベートします。 </li><li> Tチューブを配置彼は、磁石と枯渇に進みます。 </li><li>血球計数器を用いて陰性画分中のDN T細胞の総数を決定するために、生存細胞を数える。 </li><li>第一ゲートのCD45 +、第2ゲートTCRαβ+：このゲーティング戦略に従うことによって、フローサイトメトリーで、DN T細胞の純度を確認してください。 CD1dの+細胞を除外します。 DN T細胞（ 図3）を識別するためのプロットCD8 +対CD4 +。 </li><li>純度で決まる割合で合計数を掛けます。 注：90％以上純粋なDN T細胞の集団におけるこのプロトコルの結果を用いて。 </li></ol>

<ol><li>Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+previously+unknown+antigen-specific+regulatory+T+cell+and+its+mechanism+of+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression.</a> Nat Med. 6, 782-789 (2000).</li>
<li>Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+regulatory+function+of+lymphoproliferative+double+negative+T+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo.</a> J Exp Med. 196, 261-267 (2002).</li>
<li>Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+in+vivo+trogocytosis+as+a+mechanism+of+double+negative+regulatory+T+cell-mediated+antigen-specific+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression.</a> J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).</li>
<li>Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-lymphocyte+infusion+induces+transplantation+tolerance+by+activating+systemic+and+graft-infiltrating+double-negative+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells.</a> Blood. 100, 3408-3414 (2002).</li>
<li>Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+in+vitro-generated+DN+T+regulatory+cells+induces+permanent+cardiac+allograft+survival+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice.</a> Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).</li>
<li>Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+graft-versus-host+disease+by+double-negative+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells.</a> J Immunol. 171, 134-141 (2003).</li>
<li>Mohamood, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gld+mutation+of+Fas+ligand+increases+the+frequency+and+up-regulates+cell+survival+genes+in+CD25%2BCD4%2B+TR+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells.</a> Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).</li>
<li>Ascon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+mouse+kidneys+contain+activated+and+CD3%2BCD4-+CD8-+double-negative+T+lymphocytes+with+a+distinct+TCR+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire.</a> J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).</li>
<li>Hamad, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B220%2B+double-negative+T+cells+suppress+polyclonal+T+cell+activation+by+a+Fas-independent+mechanism+that+involves+inhibition+of+IL-2+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production.</a> J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).</li>
<li>Rabb, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+role+of+T+lymphocytes+in+renal+ischemia-reperfusion+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Renal%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice.</a> Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).</li>
<li>Burne, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+CD4%28%2B%29+T+cell+as+a+major+pathogenic+factor+in+ischemic+acute+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure.</a> J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).</li>
<li>Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+T+cell+depletion+in+murine+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury.</a> Transplantation. 74, 759-763 (2002).</li>
<li>Crispin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+double+negative+T+cells+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+produce+IL-17+and+infiltrate+the+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys.</a> J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).</li>
<li>Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+analyses+on+T-cell+subsets+in+lymph+nodes+of+MRL%2FMp-lpr%2Flpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Appl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).</li>
<li>Dowdell, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+FAS+mutations+are+common+in+patients+with+genetically+undefined+autoimmune+lymphoproliferative+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome.</a> Blood. 115, 5164-5169 (2010).</li>
<li>Juvet, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FcRgamma+promotes+T+cell+apoptosis+in+Fas-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice.</a> J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).</li>
<li>Thomson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FcR+gamma+presence+in+TCR+complex+of+double-negative+T+cells+is+critical+for+their+regulatory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function.</a> J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

彼らはそのような自己免疫疾患、癌、移植性、および急性腎障害（AKI）を含む腎臓の原疾患、糸球体腎炎8、13の異なる病態に関与していることから、DN T細胞中の関心が高まっている。したがって、より良好なDN T細胞の病態生理学的機能を理解し、特徴付ける必要がある。しかしながら、現在CD4およびCD8 T細胞と比較して、これらの細胞の機能を理解する上で不足している。主な理由は、二次リンパ器官におけるDN T細胞の不足ひいてはインビトロ分析および養子移入実験のために十分な細胞を得ることが困難である。 DN T細胞は、主に腎臓8などの非リンパ組織に配置されていますが、固形臓器からのそれらの単離のための信頼できる方法がないことは、その機能を調べるための努力を妨げている。したがって、DN T細胞を単離するための我々の新規プロトコル腎臓からのDNはT細胞の機能の研究を促進することが期待される。 DN T細胞は、Fas欠損（lprコマンド）またはFasLの欠損（GLD）マウスにおいて大量にリンパ節に蓄積し、それらは容易にリンパ器官9、14、15から単離することができるが...

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/51192/isolation-of-double-negative-t-cells-from-the-kidney">Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney</a>.
There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:
Samatha Bandapelle
instead of:
Samantha Bandapelle

A correction was made to: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney.

Erratum: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

周辺αβTCR+ CD3 + CD4 - CD8 -ダ ​​ブルネガティブ（DN）T細胞は、明確な表現型を有し、1〜4機能の様々な部分集合に分割される。 DN T細胞は、あまり理解されていますが、ますます異なる疾患モデル4-6の病態生理学的な免疫応答に関与している。 DN T細胞は、ますます様々な免疫および自己免疫応答の調節および同種移植寛容の調節に関与しているユニークな免疫細胞型である。4-6、9彼らは、末梢血および二次リンパ器官（脾臓及びリンパ節ではまれである）。しかし、彼らは正常な腎臓や腸上皮10月12日の主な居住者である。非常に少ないが、定常状態で、そのような腎臓transplに関連した急性腎障害（AKI）のような病理学的条件の下で、腎臓における機能7についてはほとんど知られていないANT。 なぜならalloresponsesを含む免疫応答を調節する上で様々な免疫細胞の複雑な役割のため、各プレイヤーの役割を定義するalloresponsesを理解し、新しい治療法を設計する上で非常に重要です。生理学的および異なる疾患状態の下で腎臓中に存在するDN T細胞の有意な数が指定され、DN T細胞は、移植レシピエントにおける免疫および自己免疫マウスおよびヒトにおける応答、およびalloresponsesの調節に重要な役割を果たしている可能性が高い。まだ散乱証拠かかわら蓄積すると、両方の病原性および免疫抑制機能のDN T細胞を関与しかし、なぜ、どのように特定の有害または抑制機能を発揮し、環境がそれらにどのように影響するかは十分に理解されていない。 により腎臓での少量に、分離する改良された方法が必要である。 Tから、DN T細胞を単離するための標準プロトコルが現在ありません彼は、非リンパ組織。我々のプロトコルは、腎臓からDN T細胞の単離のための新規な方法を記載している;しかしながら、この方法はまた、種々の非リンパ系組織のために使用することができる。

<table><tbody><tr><td>層流フード&nbsp;</td><td>Baker Company, Inc</td><td></td>.<td>または同等の設備&nbsp;</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>または同等の機器&nbsp;</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>電子顕微鏡 Sciences</td><td>63514-11</td><td></td></tr><tr><td>雰囲気制御インキュベーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td></td>ック<td>&nbsp;(37度;5% CO2)</td></tr><tr><td>分析フローサイトメーター</td><td>LSR II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Media Tech</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>GEヘルスケア</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr>ウ<tr><td>シ胎児血清&nbsp;</td><td>Corning Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.1% アジ化ナトリウム (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>バッファーリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Mediatech</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>EDTA バッファー&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1161</td><td></td></tr><tr><td>LSカラム&nbsp;</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD45+ マイクロビーズ</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>6.78E-51</td><td></td></tr><tr><td>ビオチンマイクロビーズ&nbsp;</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>抗CD45(クローン:30-F11)&nbsp;パーCP&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>抗CD45(クローン:30-F11)&nbsp;APC-Cy7</td><td>バイオレジェンド</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>対TCRパシフィックブルー&nbsp;(ABチェーン、クローン:H57-597)</td><td>Invitrogen</td><td>HM3628</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD4 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0043</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD8 FITC</td><td>eBioscience</td><td>8011-0087</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD4 ビオチン化 (GK1.5)</td><td>BD</td><td>553728</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD8 ビオチン化&nbsp;(クローン53-6.7)</td><td>BD</td><td>553029</td><td></td></tr><tr><td>抗 MHC クラス II (I-A b) ビオチン化</td><td>BD</td><td>553609</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS ランニングバッファー - MACS 分離バッファー&nbsp;</td><td>Milteny I Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6Jマウス</td><td>Jackson Labs</td><td>000664</td><td>Kidneys - Lymph Nodes</td></tr><tr><td>Petri Dish&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>356517</td><td></td></tr><tr><td>70&#956;mフィルター&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>プランジャー&nbsp;</td><td></td><td></td><td>または同等の機器&nbsp;</td></tr><tr><td>GeneMate チューブ 50 ml</td><td>Bioexpress</td><td>C-3394-3</td><td>または同等の機器&nbsp;</td></tr><tr><td>GeneMate チューブ 15 ml</td><td>Bioexpress</td><td>C-3394-1</td><td>または同等の機器&nbsp;</td></tr><tr><td>CD1d &#945;-ガルサー四量体</td><td>NHI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

腎臓からの二重否定αβt細胞の分離

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

非リンパ組織から、DN T細胞を単離するための標準的なプロトコルは、さまざまな免疫応答でのますます報告された関与にもかかわらず、現在ありません。 DN T細胞はallotransplants 1-6に免疫および自己免疫応答と寛容の調節に関与しているユニークな免疫細胞型である。 DN T細胞は、しかしながら、末梢血および二次リンパ器官（脾臓およびリンパ節）において稀であるが、正常な腎臓の主要な居住者である。非常に少ない起因周辺での不足への病態生理学的機能7についてはほとんど知られていない。我々は最近、定常状態でおよび虚血再灌流障害時に腎臓8でこの集団の包括的表現型および機能解析を説明した。 DN T細胞機能の分析が大幅に腎臓からのそれらの単離のためのプロトコルを開発することによって強化される。 ここでは、isolatioを可能にする新たなプロトコルを記述マウス腎臓由来の高純度AB CD4 + CD8 + T細胞およびDN T細胞のnである。手短に言えば、我々は、コラゲナーゼを用いて腎組織を消化し、密度勾配によって腎臓単核細胞（KMNC）を単離する。これはKMNCから3％〜70％の造血T細胞を濃縮するために二つのステップが続く。最初のステップは、CD45 +単離キットを使用して、造血細胞の正の選択で構成されています。第二段階において、DN T細胞は負にCD4、CD8、およびMHCクラスIIモノクローナル抗体およびCD1dのα-GalCer類似四量体を用いた非所望の細胞の除去によって単離される。この戦略は、90％以上純粋なDN T細胞の集団をもたらす。 FACS分析に続いて、上述した抗体による表面染色は、純度を確認するために使用される。

野生型C57BL / 6（B6）腎臓は、腎臓あたり約1.5から2.1×10 6の単核細胞が含まれています。約10％未満は、造血CD45 +細胞である。 5％のコラゲナーゼを用いて消化し ​​、続いて、図1に示すように、腎臓単核細胞（KMNC）の調製のために、腎臓を小片に切断する。 これはKMNC層（図2、左パネル）を収集する密度勾配遠心分離を行うことが続く。 KMNCは、セクション4（ステップI）で説明したように、CD45 +磁気マイクロビーズを使用して正の選択を行った。カラムに結合した細胞を、次いで、FACSによって溶出し、CD45 +について分析した。フローサイトメトリー（図2、中パネル）により分析し、これは、約80から95までパーセントのCD45 +細胞の濃縮をもたらす。濃縮された造血CD45 +細胞のう ​​ち、約40〜60％がTCRαβ+（データ示さず）、約3であ...

DNabT細胞は、末梢T細胞の中で稀であり;しかし、彼らは、特定の非リンパ組織に豊富に存在する。非リンパ組織からDN T細胞を単離することの難しさを認識病態生理学的有意性を増加させるにもかかわらず、それらの機能解析を妨げる。我々は、マウスの腎臓からの高度に精製されたDN T細胞の単離のための新規なプロトコルを記載している。

腎臓からの二重否定αβT細胞の分離

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

本手順の目的は、マウスの腎臓から純粋なダブルネガティブT細胞を単離する方法を説明することです。まず、コラゲナーゼ溶液で腎臓を消化します。次に、密度勾配法により単核細胞を分離し、ポジティブセレクションによって造血系CD 45陽性細胞を回収します。最終的に、ダブルネガティブT細胞は陰性選択によって単離することができます。1998年、私たちのチームは、当時の定説に反して、免疫細胞、特にT細胞が急性腎障害を媒介していることを発見しました。腎臓や心臓には研究対象となるこれらの細胞が極めて少なかったため、私たちはこれらをより詳細に研究するための手法を開発しました。正常な腎臓と損傷時の両方において、CD4およびCD8を欠損したダブルネガティブT細胞が高頻度で存在していることが分かり、私たちは驚きました。これらの細胞をより詳細に研究し、そのメカニズムを解明するための詳細かつ改良された手法について、次回のビデオで説明します。私たちは2001年からダブルネガティブT細胞の研究を行っており、最近ではRob博士の研究室と協力し、様々な生物学的免疫応答に使用可能な高純度な細胞集団を得るために、これらの細胞の単離における領域的（regional）な手法を改良しました。この手法は腎臓内の免疫細胞に関する知見を得るために有用ですが、手術を開始する前に、非リンパ組織などの他の系にも適用することが可能です。まず、組織回収用のペトリ皿にcollagenase Dを10 milliliters加えます。次に、安楽死させたマウスの腹部を70%ethanolでスプレーします。次に、胸骨から恥骨にかけて腹壁の皮膚および腹膜を正中切開し、腸管を側方に寄せて左腎臓を露出させます。腎臓を囲む透明な層として現れ、一部が腎周囲脂肪組織で覆われている左被膜を確認し、ピンセットを用いて腎臓から慎重に剥離させます。その後、外科用剪刀で血管茎を切断して組織を取り除き、腎臓をシャーレに移します。右腎臓を摘出した後、通常の金属製シェーピングブレードを用いて、腎臓組織を1〜2 mmの小さな断片に切り分けます。これらの断片をコラゲナーゼ溶液中で37 °Cで30〜45分間消化させます。次に、腎臓単核細胞を単離するため、腎臓スラリーを70 µmのストレーナーで機械的に破砕します。得られた細胞懸濁液を25 mLの組織培養培地で再懸濁します。その後、穏やかに撹拌し、細胞を遠心分離してペレットを4 mLの40% Percoll溶液で再懸濁します。次に、プラスチック転送ピペットを用いて、Percoll細胞溶液を4 mLの80% Percoll溶液の上に静かに重層し、半透明の層によって明確に分離した2相を作成します。ブレーキオフの状態で、室温、1500 ×gで30分間分離させ、その後、脂質を含む厚い黄色の最上層を約1〜2 mL吸引します。新しい移送ピペットを使用して、2相の界面にあるわずかに白濁した半透明の層を回収し、2 mLの組織培養培地を含む15 mLコニカルチューブに入れます。その後、培地を13 mL加えて、全量を15 mLにします。洗浄および細胞計数後、細胞をランニングバッファー90 µLで1×10⁷個に希釈します。次に、細胞を10 µLのCD 45マイクロビーズと共に4 °Cでインキュベートします。15分後、1 mLのランニングバッファーを加えて反応を停止させます。その後、細胞を遠心分離して回収します。ペレットを500 µLの新鮮なランニングバッファーで懸濁させます。次に、カラムをビーズ分離マグネットにセットし、3 mLのランニングバッファーでカラムを洗浄します。その後、細胞懸濁液を磁気カラムに通し、カラムを通過した未標識細胞を回収します。細胞の入ったチューブを3 mLのランニングバッファーで3回洗浄し、その都度流出液を回収した後、磁石からカラムを取り出します。5 mLのランニングバッファーをカラムにピペッティングし、CD 45陽性細胞を含む標識分画を直ちに洗い出します。その後、細胞数をカウントし、造血細胞1 × 10⁷個あたり、それぞれのビオチン化抗体を2.5 µLずつ加え、4 °Cでインキュベートします。30分後、1 mLのアンチビオチンマイクロビーズ中で、4 °Cでさらに30分間細胞をインキュベートします。新しいカラムをマグネットにセットし、先ほど示した方法で細胞をカラムにロードして、今回はネガティブ分画を回収します。最後に、生存細胞数をカウントしてネガティブ分画中のダブルネガティブT細胞の総数を算出し、この数にフローサイトメトリー解析で決定した純度（%）を乗じます。C57BL/6マウスの腎臓には1個あたり約1.5〜2.1×10⁶個の単核細胞が含まれていますが、造血系のCD45陽性細胞は10%未満です。密度勾配遠心法で腎臓単核細胞層を回収した後、CD45陽性磁気ビーズ分離法を用いることで、CD45陽性細胞を約80〜95%までさらに精製できます。濃縮された造血系CD45陽性細胞のうち、約30〜60%がダブルネガティブT細胞です。CD 45陽性細胞から、CD 4陽性、CD 8陽性、MHCクラスII陽性およびテトラマー陽性細胞を除去するネガティブセレクションを行うことで、純度90〜95%の高純度なダブルネガティブT細胞が得られます。本プロトコルを用いることで、マウス1匹あたり最大0.5 × 10⁶個の造血系CD 45陽性磁気標識細胞を回収することが可能です。この手順により、さまざまな組織におけるダブルネガティブT細胞の生物学的機能および作用機序への理解を深めることができます。

isolation-of-double-negative-t-cells-from-the-kidney

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ミルテニーMACのキットを用いてリンパ球の分離は、全体のリンパ組織のホモジネートから細胞を浄化するために信頼性の高い方法です。国内でのみ有効のシステムを使用して精製した細胞は通常、≥96パーセント純粋です。ここで、我々は、CD4 +...

CD4 +ミルテニーMACS精製を使用してマウスのリンパ節からT細胞の分離

このビデオでは、免疫磁気ターゲティングと末梢血単核細胞懸濁液からの分離によってB細胞を精製する方法を説明しています。この方法では、特定の細胞表面タンパク質を標的とする特異的な抗体またはリガンド(磁性粒子に結合)で不要な細胞タイプを標識し、磁気分離によって不均一な細胞懸濁液から枯渇させます。...

ネガティブ免疫磁気選択:末梢血単核細胞からB細胞を精製する方法

このビデオは、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)からのCD4+Vδ1+γδT細胞の低濃度集団の磁気標識ベースの単離のためのプロトコルを示しています。FITC標識抗Vδ1抗体、磁気抗FITCマイクロビーズ、および抗CD4抗体被覆超常磁性ビーズの組み合わせを使用して、CD4+Vδ1+...

ヒト末梢血単核細胞からのCD4+ Vδ1+ γδ T細胞の選択的単離

ここでは、最近示したように、胸腺外αβ T細胞前駆細胞である末梢Vδ1+CD4+ T細胞の希少なT細胞実体の単離とクローニングのための最適化されたプロトコルを提供します。この技術により、ex...

単離と<em&gt;エクスビボ</emVδ1の&gt;文化<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt;γδT細胞、胸腺外αβT細胞前駆

腎臓免疫細胞の分離に信頼性と効率性を備えた技術が、下流のアプリケーションのために必要とされています。これには、少数の腎臓免疫細胞の表面抗体標識が必要です。ここでは、この目標を達成すると思われる腎臓免疫細胞の単離のための簡潔な方法について説明します。...

腎、免疫細胞の信頼性と高効率抽出

ここでは、受信者からの明瞭な細胞のサブセットの抑制能力と受信者ドナーまたは外因性の抗原への免疫の状態、移植、耐性を誘導し、 in vitroとin...

体外と体内の T, B, 骨髄細胞の抑制活性と移植から体液性応答の評価

腎臓血管周囲間質細胞 (kPSCs) の消化酵素と NG2...

ひと腎臓血管周囲間質細胞の新規臨床等級分離法

我々は、セザリー症候群と診断された患者から得られた全血から末梢血単核球を単離し、続いてCD4+...

トランスクリプトームプロファイリングのためのセザリー症候群患者からのヒト末梢血単核球およびCD4+ T細胞の単離

ウイルス感染後、腎臓は比較的多数のCD8+T 細胞を収容し、非粘膜TRM...

フローサイトメトリー解析のためのマウス腎臓レジデントCD8+T 細胞の分離

ここでは、髄質腎細胞タイプの表現を改善し、酵素組織解離による遺伝子発現アーティファクトを回避する凍結マウス腎臓から高品質の核を単離するためのプロトコルを提示します。...

単核RNAシーケンシングのための成体マウス腎臓からの核分離

このプロトコルは、安全かつ耐容性の高いマウスの両側性腎リンパ節摘出術の生存手技を説明しています。...

マウス両側腎リンパ節摘出術

学ぶマウス腎臓からの二重否定αβT細胞分離法。コラゲナーゼ消化と密度勾配遠心、磁気ビーズによる陽性・陰性選択を用いて高純度のDN T細胞を単離し、腎臓傷害における免疫応答メカニズムを解明する。

腎臓からの二重否定αβT細胞の分離

さらに動画を探す