PDMS膜上のマイクロパターン細胞を伸ばす

本手順の目的は、ポリジメチルシロキサン（PDMS）の弾性膜上でパターン化された細胞を伸展させることです。これは、まずPDMSシートを作成し、次にPDMS上にマイクロパターンを形成することで達成されます。その後、マイクロパターン化されたPDMSシートを伸展装置に取り付け、その上に培地保持プールを設置します。

次に、細胞をマイクロパターン化されたPDMSシートの表面に播種し、パターンに接着させた後、洗浄して未接着の細胞を除去します。最終ステップとして、細胞を含むPDMSに伸長を加え、細胞をストレッチさせます。最終的に、ビデオ顕微鏡を用いて、細胞ストレッチにおける哺乳類有糸分裂細胞の牽引線維に力を加えることで、細胞の変形が起こることを示します。

この手法は、外力が細胞分裂などの細胞プロセスにどのような影響を与えるかといった、バイオメカニクス分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。私たちは、分裂中の細胞に力を加える方法を検討していた際に、この手法を考案しました。まず、あらかじめ用意されたシートから、約 35 by 20 millimeters の PDMS 片を切り出します。ここでは、特注の PDMS と比べて再現性が高く、破損しにくい市販の薄い PDMS シートを使用しています。

上下のプラスチック保護層を取り除き、ピンセットを用いてPDMSをプラスチック製ペトリ皿に移します。次に、ローテーターを用い、毎分30回の振動で70% ethanolを用いてPDMSを5分間洗浄します。洗浄後、表面に空気を吹き付けて乾燥させます。

次に、PDMSに深紫外線を、紫外線ランプから約5 cmの距離で5分間照射します。その間に、テキストプロトコルに従ってE-D-C-N-H-S溶液を調製します。溶液の反応性は数時間で低下するため、使用直前に調製する必要があります。

PDMSシートをペトリ皿から、光照射していないペトリ皿の蓋へと移します。これにより、PDMSの周囲が非常に疎水的な状態に保たれ、次の工程が容易になります。

E-D-C-N-H-S溶液をPDMS上にピペッティングし、室温で15分間インキュベートします。インキュベーション後、余分なE-D-C-N-H-Sを水で洗浄します。

次に、PLL修飾PEG溶液を添加し、室温で3時間から一晩までインキュベートします。インキュベーション後、PDMS上の過剰なPLL修飾PEGを水で洗浄します。これでPDMSがPLL修飾PEGでパッシベーションまたは機能化され、4°Cで数日間保存することが可能になります。PDMSをパターニングするには、パターニング用の微細構造を有する合成石英フォトマスクの上にPDMSシートを配置します。

PLLグラフトPEGが固定されたPDMS側をフォトマスクのクロム側に向けて配置します。次に、紫外線ランプから約5 cm離れた位置で、フォトマスクを通して7分間照射します。照射後、

マスクとPDMSに水を加え、マスクからPDMSをゆっくりと剥がします。あらかじめパッシベーション処理を施したPDMSをストレッチングデバイスに取り付けます。PDMSの一端をストレッチャーの固定部に取り付けます。もう一端を、PDMSシートを挟み込みすぎないように注意して、ストレッチャーの可動部に固定します。

PDMSを締め付けすぎると、長さが短くなり、同じ伸展距離であっても張力が大きくなるため、破断につながる可能性があります。ネジがしっかりと締められていることを確認してください。そうしないと、伸展開始直後や実験の途中でPDMSシートが滑ってしまうことがあります。次に、PDMSをフィブロネクチン溶液で1時間インキュベートします。

室温では、他の細胞外マトリックスタンパク質を使用することも可能ですが、本プロトコルでは検証されていません。最終ステップとして、PDMSをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄します。次に、厚いPDMSスラブからPDMSを長方形に切り出します。

次に、内側にもう一つの長方形を切り出します。細胞と培地を保持するプールを作成するため、この長方形に切り出したPDMSの下にシリコングリースを塗り、PDMSシートの上に配置して培地保持プールを作成します。グリースを塗ることで、細胞のパターニングを行う際のストレッチ中に、プールがPDMSシート上で滑らかに移動できるようになります。

まず、50%のコンフルエンシーに達した培養フラスコから細胞を剥離させます。細胞を懸濁させた後、200 µLチップで数回ピペッティングして凝集塊を分散させ、個々の細胞がパターンに結合するようにします。次に、細胞懸濁液1 mLをプールに加えます。

細胞の種類に応じて、37 °Cのインキュベーター内で10〜30分間、細胞をパターンに接着させます。細胞がパターンに接着したら、平衡化した培地で緩やかに洗浄し、浮遊細胞を除去します。

吸引ピペットで培地を除去しながら、同時に培地を添加します。未凝着細胞を洗い流すのに十分な流速を維持しつつ、細胞を常に培地に浸漬させておくことが極めて重要です。次に、蒸発を防ぎ、また万が一PDMSが破損した場合の培地漏れを防止するため、プールの上のカバーガラスを設置し、細胞をパターン上で数時間展開させます。

次に、装置を倒立顕微鏡に載せ、イメージングを開始します。オイル浸漬対物レンズは、フォーカスの問題で機能しないため使用しないでください。マイクロパターンの細胞を伸展させるには、ステージのx、y、z軸の位置を調整しながら、マイクロメータネジを回します。

PDMSの広がりとフォーカスの喪失を打ち消すために、ステージ位置を補正する必要があります。このビデオプロトコルで提示する手法では、中期開始時に基板をストレッチさせることで、哺乳類有糸分裂細胞の牽引線維に力を加えることが可能となりました。これらの牽引線維の一部が細胞体から引き離されたことで、有糸分裂細胞の皮質に機械的な力が加わりました。これを実現するために、細胞は楕円形のパターン上に播種されています。

パターニングは、フォトマスクを通じて円形パターンを転写する際に、PDMSを伸展させた状態で行われます。伸展後、基材をさらに引き伸ばすことで、パターンを円形にします。このビデオを視聴することで、マクロパターン上に細胞を播種し、その後基材に伸展力を加える方法について十分に理解できるはずです。