Name: PDMS膜上のマイクロパターン細胞を伸ばす (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 学ぼう、PDMS弾性膜上のマイクロパターン細胞を一方向に伸ばす手法。ビデオ顕微鏡で観察し、分裂期哺乳類細胞の力学的応答を解析します。組織工学や再生医療への応用が期待されます。

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この作品は、キュリー研究所、パリ、フランスで設立されました。機械式ストレッチャはダミアンCuvelier（キュリー研究所）によって設計され、GREM（メカニック-grem.com）によって製造されている。 PDMS上のパターニングはアマルAzioune（ボルドーII大学）によって開発されました。

1。 PDMSの不動態化<ol><li>あらかじめ作られたシート（材料の表に示すように、たとえば、GelPak、）からのX 20ミリメートルのPDMSが約35ミリメートルの部分をカット。 </li><li>プラスチックの上部と下部の保護層を除去（必要な場合）、ペトリ皿（処理した培養を細胞ではない）は、プラスチックに、PDMSを配置するためにピンセットを使用しています。 </li><li> /分30振動で回転装置上で5分間、70％エタノールで、PDMSを洗ってください。 </li><li>その上に空気を流すことにより、表面を乾燥させます。 </li><li>約5cmのUVバルブからの距離で5分間、深紫外（λ= 180 nm）をして点灯（ランプリファレンスのための材料のシートを参照してください。パラメータは、異なるランプに異なります）。 </li><li>各PDMSピース用EDC / NHS溶液200μlを準備し（溶液の反応性が時間のうちに崩壊するので、これは使用直前に調製しなければならない）。 pH6.0の0.05MのMES + 0.5 M NaCl緩衝液の1ミリリットルの場合は、スルホ-NHSの11.5 mgおよびEDCを19.2ミリグラムを追加します。 </li><li>転送照らされていないペトリ皿の蓋にペトリ皿からのPDMSシート。これはPDMSの周囲が非常に疎水性であることを確認して、次のステップを容易にするであろう。 </li><li> EDC / NHS溶液を添加し、室温で15分間インキュベートする。 </li><li>水とEDC / NHSを洗浄します。 </li><li> PLL-gの PEG-溶液（10mMのHEPES pHが8.6で0.5 mg / ml）を添加し、室温で一晩に3時間のインキュベート。 </li><li>水でPLL-G-PEGを洗浄します。 （PLL-gの -PEGで官能化された）不動態化されたPDMSは、4℃で数日間保存することができる</li></ol> 2。 PDMSのパターン化<ol><li> PDMSシートを取り、パターニング微小特徴を有する合成石英フォトマスクの上に置き（ 図1を参照）。フォトマスクのクロム側にPLL-G-PEGをもつPDMS側に配置します。 </li><li>約5cmのUVバルブから距離を置いて、フォトマスクを介して7分間点灯します。</li><li>マスク+ PDMS上に水を加え、徐々にマスクオフPDMSを剥離。 </li><li>室温で1時間、pH8.6のHEPESで緩衝液中に50 mg / mlのフィブロネクチン溶液でインキュベートする。それは、他のECMタンパク質を使用することが可能であるが、これらはこのプロトコルで試験されていない。 </li><li> PBSですすいでください。 </li></ol> 3。デバイスの取り付け<ol><li>ストレッチングデバイスに以前に不動態化されたPDMSをマウント（トラブルシューティングのための議論を参照）。 <ol><li>ストレッチャの固定部分にPDMSの1側を接続してください。 </li><li> PDMSシートのあまりをクランプすることなく、ストレッチャの可動部分に反対側を固定します。 </li></ol></li><li>厚手のPDMS刺しにPDMSの長方形（22ミリメートルX 19ミリメートル）をカットします（ 図2を参照）細胞および培地を保持し、プール（またはフレーム）を持つために内部に別の四角形を切った。 </li><li>この下にシリコーングリースを追加し、プールをPDMSおよびMEDを作成するために、PDMSシートの上部に配置しますイウムは、プールを保持。グリースは、延伸時のPDMSシート上のプールの滑空が可能になります。 </li></ol> 4。細胞のパターニング<ol><li>ベルセンと50％の集密度の培養フラスコから細胞を剥離。 </li><li>細胞を計数し、200,000細胞/ mlの濃度で再懸濁します。 </li><li> （詳細は、説明を参照）、プール内の細胞懸濁液の1ミリリットルを追加します。 </li><li>細胞が10〜30分間のパターンに結合する（細胞型に応じて、RPE-1細胞を20分間、10分間およびHeLa細胞がかかります）にしよう。 </li><li>静かに平衡化した培地（培養器内の媒質を平衡化）で浮遊細胞を洗い流す。 </li><li> （RPE-1は、少なくとも2時間が必要になります。HeLa細胞を3時間が必要になります）、細胞がパターンにはいくつかの時間のために普及してみよう。 </li><li> PDMSの改場合の蒸発とメディア漏れを回避するために、プールの上にカバースリップを追加します。 </li><li>倒立顕微鏡上のデバイスを入れて撮影開始。油浸OBの使用を避けるそれが原因で問題が焦点に動作しませんようにjectives。 </li></ol> 5。ストレッチング<ol><li> x軸、y軸、z軸（主にX）で​​のステージ位置を補正しながらマイクロメータネジを回します。ステージ位置は、PDMSの拡大、焦点の損失を打ち消すために補正する必要がある。 （議論では段落「ストレッチ中に」を参照してください）​​。 </li></ol>

<ol><li>Vogel, V., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+force+and+geometry+sensing+regulate+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Local force and geometry sensing regulate cell functions.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 265-275 (2006).</li>
<li>Terenna, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+mechanisms+redirecting+cell+polarity+and+cell+shape+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical mechanisms redirecting cell polarity and cell shape in fission yeast.</a> Curr. Biol. 18 (22), 1748-1753 (2008).</li>
<li>Guillot, C., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+epithelial+tissue+homeostasis+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanics of epithelial tissue homeostasis and morphogenesis.</a> Science. 340 (6137), 1185-1189 (2013).</li>
<li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+morphogenesis+by+Fat%2FDachsous%2FFour-jointed+planar+cell+polarity+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway.</a> Science. 336 (6082), 724-727 (2012).</li>
<li>Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+cell+mechanics%2C+cell-cell+interactions%2C+and+proliferation+on+epithelial+packing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Curr. Biol. 17, 2095-2104 (2007).</li>
<li>Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+and+anisotropy+of+cortical+forces+orienting+Drosophila+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis.</a> Nat. Cell Biol. 10, 1401-1410 (2008).</li>
<li>Mitrossilis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-cell+response+to+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Real-time single-cell response to stiffness.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (38), 16518-16523 (2010).</li>
<li>Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchison, T., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+stimulation+and+constrained+cell+migration+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 12, 1783-1790 (2007).</li>
<li>Fink, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+forces+control+mitotic+spindle+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">External forces control mitotic spindle positioning.</a> Nat. Cell. Biol. 13 (7), 771-778 (2011).</li>
<li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).</li>
<li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+micropatterns%3A+A+direct+printing+protocol+using+deep+Uvs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep Uvs.</a> Methods Cell Biol. 97, 133-146 (2010).</li>
<li>Azioune, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+method+for+high-throughput+surface+patterning+of+deformable+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Robust method for high-throughput surface patterning of deformable substrates.</a> Langmuir. 27 (12), 7349-7352 (2011).</li>
<li>Carpi, N., Piel, M., Azioun, A., Cuvelier, D., Fink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+on+silicon+elastomer+%28PDMS%29+with+deep+UVs%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Exch%22%5BJournal%5D)">Micropatterning on silicon elastomer (PDMS) with deep UVs.</a> Protoc. Exch. , (2011).</li>
<li>Sinha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+respond+to+mechanical+stress+by+rapid+disassembly+of+caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cells respond to mechanical stress by rapid disassembly of caveolae.</a> Cell. 144 (3), 402-413 (2011).</li>
</ol>

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

この技術は、多数回使用されていますし、徹底的にテストされていますが、失敗した実験につながることができ、いくつかの重要なステップがあります。 PDMSについて： この作業では、GelPak、市販の薄いPDMSシートを用いた。別の方法として、PDMSシートは、PDMSミックスから直接鋳造することができる。それは、より再現性があり、カスタムメイドのPDMSに比べて壊れにくくなるので、我々はGelPakの使用をお勧めします。 デバイスについて： このプロトコルで使用される引き伸ばしデバイスは、 &quot;家で&quot;デザインされましたが、1もFlexCellのような市販のストレッチャーに微細加工技術を適用することができます。カスタムメイドオプションは、より汎用性とかなり安いです。 デバイスをマウント。 PDMSの取り付けは...

高等生物の組織を構成する細胞は、機械的緊張にさらされ、外部環境からか、周囲の細胞の1,2のいずれかから来る力を伸ばす。細胞は、に適応し、組織の完全性を維持するためにこれらの力に耐えなければならない。そのような力は、開発中に3,4の組織形態形成のためにも重要である。培養細胞に対する機械的な力を適用すると、組織内で何が起こるか模倣する方法ですが、細胞形状および細胞変形5,6の定量的かつ独立したコントロール機能を備えています。このために、いくつかの技術が使用されてもよい。一つは、AFMまたはその誘導体7,8を使用して、たとえば、細胞（全細胞またはその一部）に押したり、細胞が上に成長している基板を伸ばすことができます。 このホワイトペーパーで説明する方法は、細胞でメッキ面基板をストレッチする方法を示しています。この技術は、元々m個に作用する力の役割を評価するために開発されたitotic、哺乳動物細胞9。有糸分裂細胞は、引込みファイバを介して基板への接続を維持し、膜を延伸は今度は紡錘体の回転を引き起こし、これらの繊維に力を発揮した。接着マイクロパターンを組み合わせて、延伸の関心が力と個々の細胞の形状の独立した制御を達成することである。一軸延伸が適用されている間、それは、完全に等方性の丸い形状に卵形細胞を伸ばすために、例えば、可能である。細胞が微細にplattedされていない場合、ほとんどの細胞は一軸延伸軸と一致長軸を有する、細胞伸長における結果を延伸する。それは長い軸調整や細胞に適用し、ストレッチの効果の影響を分離することが、その後は難しい。 デバイスは、長い時間経過蛍光顕微鏡法を含む任意の生細胞イメージングのために適しており、薬物は、実験中に添加することができる。深いUVの用微細法10ら Aziouneに詳細に記載した。PDMS上11パターニングがAzioune らに記載された。12プロトコルを伸ばし存在カルピらのビデオ版です。13

<table><tbody><tr><td>GelPak</td><td>GelPak</td><td>PF-60-X4</td><td>異なる厚さ/粘着性が利用可能です。1つの選択肢は、PDMS&nbsp;自分。</td></tr><tr><td>シリコングリース</td><td>GEベイヤーシリコーンバイ</td><td>シロンペーストこれは</td><td>生体適合性です</td></tr><tr><td>ストレッチデバイス</td><td>GREM m&eacute;カニーク</td><td>ストレッチャー 2011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EDC (N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N&prime;-エチルカルボジイミド塩酸塩)</td><td>Sigma</td><td>3450</td><td>-20°Cで6ヶ月間安定;C</td></tr><tr><td>NHS (N-ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩)</td><td>Sigma</td><td>56485</td><td>湿気から保護する</td></tr><tr><td>Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)</td><td>SurfaceSolutions (チューリッヒ)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>合成石英フォトマスク</td><td>凸版印刷</td><td></td> ウシ血漿Sigma F1141から石英フィブロネクチン<td>中の標準バイナリフォトマスクを採取</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pdms膜上のマイクロパターン細胞を伸ばす

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

機械的力は、細胞に作用するおよび/または組織は、多くのプロセスにおいて重要な役割を果たしている。私たちは、イメージングと互換性ポリジメチルシロキサン（PDMS）膜上で平板培養した細胞を伸ばすためのデバイスを開発した。この手法は、再現性があり、汎用性があります。 PDMS膜は、特定の形状に細胞または組織を閉じ込めるために微細化することができる。最初のステップは、ディープUV技術とPDMS膜上に微細パターンを印刷することである。 PDMS膜は、次いで、機械的なストレッチャーに取り付けられている。室は、ストレッチの際に滑走できるように生体適合性グリース膜の上にバインドされています。細胞は播種し、微細パターン上の数時間広めるために許可されています。サンプルは、マイクロメータねじを用いて複数回延伸·未延伸することができる。それは、その全容（約30％）にストレッチを適用する分もかかります。ここで紹介するテクニックはために必要な電動式の装置が含まれていません迅速および/またはコンピュータ制御された延伸繰り返し延伸サイクルをpplyingが、これは実現することができる。細胞または組織の延伸は、細胞力、機械的なストレスや組織形態形成に対する細胞応答に関連した質問の対象となることができます。このビデオプレゼンテーションでは、一見シンプルなこのタイプの実験を行うときに発生する可能性のある一般的な問題を回避する方法を紹介します。

<html>このビデオプロトコルで提示技術は、有糸分裂、哺乳動物細胞の収縮繊維に力を加えることを可能にした。実際に、細胞分裂の間、有糸分裂の段階では、哺乳動物細胞は、球体の形状をとると、基板に取り付けられた膜で囲まれた細いアクチンケーブルを残すように後退させる。これらのケーブル（後退繊維）、除算に入る前にセル形状のメモリである。 PDMS薄膜上にフォトマスクを通してUV深い有する微細パターンを作製する（ 図1）は、細胞接着の幾何学的な制御を可能にした。中期の開始時に、基板を延伸して、これらの引込み繊維の一部は、有糸分裂細胞の皮質（ 図3）上に塗布機械的な力をもたらす離れる細胞体から引っ張った。これらの力は、スピンドル軸9の方向を支配することが示された。 <html> 「FO：SRC = &quot;6インチ：&quot;コンテンツ幅= FO &quot;グレ1 / files/ftp_upload/51193/5119...

この原稿は、単方向ストレッチを使用して接着細胞または組織に力を適用したり、解放する手法を提示します。

PDMS膜上のマイクロパターン細胞を伸ばす

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

本手順の目的は、ポリジメチルシロキサン（PDMS）の弾性膜上でパターン化された細胞を伸展させることです。これは、まずPDMSシートを作成し、次にPDMS上にマイクロパターンを形成することで達成されます。その後、マイクロパターン化されたPDMSシートを伸展装置に取り付け、その上に培地保持プールを設置します。次に、細胞をマイクロパターン化されたPDMSシートの表面に播種し、パターンに接着させた後、洗浄して未接着の細胞を除去します。最終ステップとして、細胞を含むPDMSに伸長を加え、細胞をストレッチさせます。最終的に、ビデオ顕微鏡を用いて、細胞ストレッチにおける哺乳類有糸分裂細胞の牽引線維に力を加えることで、細胞の変形が起こることを示します。この手法は、外力が細胞分裂などの細胞プロセスにどのような影響を与えるかといった、バイオメカニクス分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。私たちは、分裂中の細胞に力を加える方法を検討していた際に、この手法を考案しました。まず、あらかじめ用意されたシートから、約 35 by 20 millimeters の PDMS 片を切り出します。ここでは、特注の PDMS と比べて再現性が高く、破損しにくい市販の薄い PDMS シートを使用しています。上下のプラスチック保護層を取り除き、ピンセットを用いてPDMSをプラスチック製ペトリ皿に移します。次に、ローテーターを用い、毎分30回の振動で70% ethanolを用いてPDMSを5分間洗浄します。洗浄後、表面に空気を吹き付けて乾燥させます。次に、PDMSに深紫外線を、紫外線ランプから約5 cmの距離で5分間照射します。その間に、テキストプロトコルに従ってE-D-C-N-H-S溶液を調製します。溶液の反応性は数時間で低下するため、使用直前に調製する必要があります。PDMSシートをペトリ皿から、光照射していないペトリ皿の蓋へと移します。これにより、PDMSの周囲が非常に疎水的な状態に保たれ、次の工程が容易になります。E-D-C-N-H-S溶液をPDMS上にピペッティングし、室温で15分間インキュベートします。インキュベーション後、余分なE-D-C-N-H-Sを水で洗浄します。次に、PLL修飾PEG溶液を添加し、室温で3時間から一晩までインキュベートします。インキュベーション後、PDMS上の過剰なPLL修飾PEGを水で洗浄します。これでPDMSがPLL修飾PEGでパッシベーションまたは機能化され、4°Cで数日間保存することが可能になります。PDMSをパターニングするには、パターニング用の微細構造を有する合成石英フォトマスクの上にPDMSシートを配置します。PLLグラフトPEGが固定されたPDMS側をフォトマスクのクロム側に向けて配置します。次に、紫外線ランプから約5 cm離れた位置で、フォトマスクを通して7分間照射します。照射後、マスクとPDMSに水を加え、マスクからPDMSをゆっくりと剥がします。あらかじめパッシベーション処理を施したPDMSをストレッチングデバイスに取り付けます。PDMSの一端をストレッチャーの固定部に取り付けます。もう一端を、PDMSシートを挟み込みすぎないように注意して、ストレッチャーの可動部に固定します。PDMSを締め付けすぎると、長さが短くなり、同じ伸展距離であっても張力が大きくなるため、破断につながる可能性があります。ネジがしっかりと締められていることを確認してください。そうしないと、伸展開始直後や実験の途中でPDMSシートが滑ってしまうことがあります。次に、PDMSをフィブロネクチン溶液で1時間インキュベートします。室温では、他の細胞外マトリックスタンパク質を使用することも可能ですが、本プロトコルでは検証されていません。最終ステップとして、PDMSをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄します。次に、厚いPDMSスラブからPDMSを長方形に切り出します。次に、内側にもう一つの長方形を切り出します。細胞と培地を保持するプールを作成するため、この長方形に切り出したPDMSの下にシリコングリースを塗り、PDMSシートの上に配置して培地保持プールを作成します。グリースを塗ることで、細胞のパターニングを行う際のストレッチ中に、プールがPDMSシート上で滑らかに移動できるようになります。まず、50%のコンフルエンシーに達した培養フラスコから細胞を剥離させます。細胞を懸濁させた後、200 µLチップで数回ピペッティングして凝集塊を分散させ、個々の細胞がパターンに結合するようにします。次に、細胞懸濁液1 mLをプールに加えます。細胞の種類に応じて、37 °Cのインキュベーター内で10〜30分間、細胞をパターンに接着させます。細胞がパターンに接着したら、平衡化した培地で緩やかに洗浄し、浮遊細胞を除去します。吸引ピペットで培地を除去しながら、同時に培地を添加します。未凝着細胞を洗い流すのに十分な流速を維持しつつ、細胞を常に培地に浸漬させておくことが極めて重要です。次に、蒸発を防ぎ、また万が一PDMSが破損した場合の培地漏れを防止するため、プールの上のカバーガラスを設置し、細胞をパターン上で数時間展開させます。次に、装置を倒立顕微鏡に載せ、イメージングを開始します。オイル浸漬対物レンズは、フォーカスの問題で機能しないため使用しないでください。マイクロパターンの細胞を伸展させるには、ステージのx、y、z軸の位置を調整しながら、マイクロメータネジを回します。PDMSの広がりとフォーカスの喪失を打ち消すために、ステージ位置を補正する必要があります。このビデオプロトコルで提示する手法では、中期開始時に基板をストレッチさせることで、哺乳類有糸分裂細胞の牽引線維に力を加えることが可能となりました。これらの牽引線維の一部が細胞体から引き離されたことで、有糸分裂細胞の皮質に機械的な力が加わりました。これを実現するために、細胞は楕円形のパターン上に播種されています。パターニングは、フォトマスクを通じて円形パターンを転写する際に、PDMSを伸展させた状態で行われます。伸展後、基材をさらに引き伸ばすことで、パターンを円形にします。このビデオを視聴することで、マクロパターン上に細胞を播種し、その後基材に伸展力を加える方法について十分に理解できるはずです。

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