Name: 蛍光標識株の共同栽培による細菌細胞集団における種内競争のモニタリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: 学ぶ Bacillus subtilis の蛍光標識株を用いた細菌細胞集団における種内競争の可視化手法。栄養条件の違いによる変異生存率の定量化と進化動態の解析に応用可能です。

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著者の研究室での作業は、ドイツ・フォルシュングスゲミンシャフト(http://www.dfg.de によってサポートされました。CO 1139/1-1)、フォンズ・デア・ケミッシェン・インダストリー(http://www.vci.de/fonds)、ゲッティンゲン分子生物学センター(GZMB)。著者たちは、ヨルグ・シュテルケに対する有益なコメントと原稿の批判的な読み取りを認めたいと考えています。

寒天プレート、培養メディア、クライオストック、プレカルチャーの製造
<ol><li>成長培地と必要な試薬を準備します(材料および試薬の表を参照)。</li>
	<li>B.サチリス株をストリーク(例えば.BP40(rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)および BP52(rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) は、それぞれ1つと2つのアクティブなGDHを発現します)2 SPミディアガルプレートの競技実験で使用される単一コロニーを得る。プレートを一晩37°Cでインキュベートする。</li>
	<li>単一コロニーを取り、4 ml LB液体培地を含む滅菌培養管を接種する。28°Cおよび220のrpmで一晩細菌を成長させる。</li>
	<li>細胞がライスまたは胞子を避けるために28°Cで一晩培養を成長させます。</li>
	<li>標準分光光度計を用いて、波長600nm(OD600)で培養液の光学濃度を測定します。</li>
	<li>培養物が2.0のOD600 に達した場合、1.5ml反応チューブ中の無菌50%グリセロール溶液の0.75mlと培養物の0.75mlを混合する。最終OD600 は、約108 細胞/mlを含む凍結ストックを得るために1.0でなければなりません。</li>
	<li>チューブは-80°Cで保管してください。</li>
	<li>フルオロフォア遺伝子をコードする cfp および yfp で標識された各株の3つの前培養を行う。-80°Cのクライオストックから1μl細胞で前培養(4ml LB液体培地を含む無菌培養チューブ)を接種する。培養物を28°Cおよび220rpmで一晩インキュベートする。</li>
</ol>2. 細菌の共同栽培、サンプル採取、試料保存
<ol><li>100 ml の C-Glc および CE-Glc の最小限の培地 (試薬と材料の表を参照) を準備し、各培地の 20 ml を滅菌 100 ml の振るフラスコに移します。</li>
	<li>一晩栽培したプレカルチャーの0.1mlを取り、1.5mlキュベットで0.9ml LB培地で希釈し、OD600を決定する。</li>
	<li>競技実験では、1.0~1.5の間に類似のOD600 を有する異なる株の前培養を行う。</li>
	<li>混合細胞集団を得るために、適切なOD600 を有した培養前培養の細胞を、20mlC-GlcおよびCE-Glc最小培地中の0.05のOD600 に希釈し、100mlの揺れフラスコで補充した。競技実験では、2つの株を1:1の比率で混合する必要があります。</li>
	<li>フラスコから10mlのサンプルを取り、15mlのプラスチックチューブに移し、標準的なテーブル上部遠心分離機で4,000 x gで10分間遠心分離して細胞を収穫し、上清を捨てます。</li>
	<li>0.5 ml新鮮なLB培地で細胞を再懸濁し、細胞を無菌1.5 ml反応カップに移します。0.5 mlの50%無菌グリセロールを加え、厳密なボルテックスで懸濁液を混合し、さらに処理するまで-80°Cの冷凍庫に保存します。</li>
	<li>37°Cおよび220rpmで最大24時間、振るフラスコに残された細胞をインキュベートする。蛍光色素の写真の漂白を防ぐために、暗闇の中で揺れるフラスコを保ちます。</li>
	<li>7時間および24時間の成長の後に0.1 mlのさらなるサンプルを取る。サンプルの1:10希釈液(C-GlcまたはCE-Glc最小媒体)のOD600 を測定して注意してください。</li>
	<li>各培養物から適切な量の細胞を取り出し、OD600 が1.0の凍結ストックを作ります。さらに処理するまで-80°Cでサンプルを保管してください。</li>
</ol>3. 定量分析のためのサンプル処理、めっき、インキュベーション
<ol><li>すべてのサンプルを採取した後、凍結ストックを解凍し、細胞を0.9%の生理食塩水(試薬および材料の表を参照)で10-3まで希釈した。</li>
	<li>SP培地寒天プレート上の10-3 希釈液の0.1mlをプレートし、滅菌ガラスピペットを使用して細胞を分配する。</li>
	<li>単一のコロニーが出現するまで、暗闇の中で37°Cで一晩プレートをインキュベートします。</li>
</ol>4. 定量分析のための立体蛍光顕微鏡による被爆者数
<ol><li>ステレオ蛍光顕微鏡の下で生存者を数えながら、より良い方向のために4つの部分に黒いペンで寒天プレートの底を分割します。</li>
	<li>プレートを顕微鏡の下に逆さまに置き、冷たい光源を使用してコロニーを焦点にします。</li>
	<li>コロニーが焦点を合わせられたら、CFP用に適切なフィルタセットに切り替えて 、cfp標識株の生存細胞を視覚化します。ペンでコロニーにラベルを付けることによって、この株の生存者を数え、数をメモします。</li>
	<li>エタノールでラベルを取り除き、YFPフィルタセットに切り替えて 、yfpラベル付き歪みの生存細胞を可視化します。ペンでコロニーにラベルを付けることによって、再び生存者を数え、番号をメモします。</li>
</ol>5. 半定量分析のためのサンプル処理と顕微鏡
<ol><li>例示的な図では、SP寒天プレート上のステップ3.1から10-4 希釈液(約100細胞)の10μlをスポットする( 図3を参照)。</li>
	<li>単一のコロニーが出現するまで、暗闇の中で37°Cで一晩プレートをインキュベートします。</li>
	<li>顕微鏡の下に蓋をせずにペトリ皿を置き、冷たい光源を使用してスポットを焦点にします。</li>
	<li>例示の図のためのスポットの写真を撮ります。冷たい光源でコロニーの写真を撮るための適切な露出時間を選択してください。</li>
	<li>プレートを動かさずに、CFPフィルタセットに変更し、露光時間を調整して写真を撮ります。YFP フィルタセットでも同じ操作を行い、画像を保存してさらに解析を行います。</li>
</ol>6. データ分析
<ol><li>定量的データ分析には、Excel などのソフトウェアを使用します。カウントされたコロニーに基づいて、100%に設定されたコロニーの総数に対する黄色と青のコロニーの割合を計算します。</li>
	<li>計算された数値を使用して、積み上げバー図を作成します ( 図 4 および図 5を参照)。Adobe Photoshop などの画像処理プログラムを使用して、さまざまな場所から撮影した写真のマージされた画像を作成します。あるいは、自由に入手可能なソフトウェアImageJは <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">、http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> からダウンロード可能な画像処理に使用することができる。</li>
	<li>CFP フィルタ セットと YFP フィルタ セットで撮影した 1 つの場所から画像を開きます。メディアから任意のバックグラウンド蛍光を低減するためにコントラストと明るさを最適化します。</li>
	<li>いずれかの画像に移動し、すべてを選択します。図をコピーして、他の図に貼り付けます。</li>
	<li>「カラードッジ」機能を使用して画像をマージするか、チャンネルタブを使用して蛍光画像をオーバーレイします。異なる媒体および異なる時点からのコロニーの結合された写真は、液体培養中の異なる株の成長を表す。</li>
</ol>7. 具体的なヒント:色素スイッチ実験とcfpとyfpで標識された同種株の共同栽培
B.サブティリスにおける2つのフルオロフォアコード遺伝子のどちらかの発現は、適性および細菌の増殖速度に影響を与える可能性がある。したがって、栽培中の細胞集団からの1つの競合株の排除が単にフルオロフォアの悪影響によるものであることを排除するために、以下の実験を行うことを推奨する。
<ol><li>実験全体を繰り返し、逆に標識された株を共同栽培する(例えば、以前の cfp標識株は yfp 遺伝子で標識され、 その逆も同様である)。逆であるが、得られた結果は、一方の株が他の株よりも選択的な成長優位性を有するという以前の観察と同等であるべきである。</li>
	<li>実験全体を繰り返し、yfpおよびcfpでラベル付けされた同等体性株(例えばBP40(rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)およびBP41(rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp))を共同栽培する。時間の経過に伴う細胞集団の組成に従うことによって、細菌の適合性に対する2つのフルオロフォアのどちらかの負の効果を推定する。</li>
</ol>

<ol><li>Buescher, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+network+reorganization+during+dynamic+adaptations+of+Bacillus+subtilis+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global network reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism.</a> Science. 335, 1099-1103 (2012).</li>
<li>Gunka, K., Stannek, L., Care, R. A., Commichau, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection-driven+accumulation+of+suppressor+mutants+in+Bacillus+subtilis%3A+the+apparent+high+mutation+frequency+of+the+cryptic+gudB+gene+and+the+rapid+clonal+expansion+of+gudB%2B+suppressors+are+due+to+growth+under+selection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Selection-driven accumulation of suppressor mutants in Bacillus subtilis: the apparent high mutation frequency of the cryptic gudB gene and the rapid clonal expansion of gudB+ suppressors are due to growth under selection.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Al Mamum, A. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity+and+function+of+a+large+gene+network+underlying+mutagenic+repair+of+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identity and function of a large gene network underlying mutagenic repair of DNA breaks.</a> Science. 338, 1344-1348 (2012).</li>
<li>Koeppel, A. F., Wertheim, J. O., Barone, L., Gentile, N., Krizanc, D., Cohan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speedy+speciation+in+a+bacterial+microcosm%3A+new+species+can+arise+as+frequently+as+adaptations+within+a+species%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Speedy speciation in a bacterial microcosm: new species can arise as frequently as adaptations within a species.</a> ISME J. 7, 1080-1091 (2013).</li>
<li>Maughan, H., Nicholson, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+fitness+and+alteration+of+metabolic+pathways+during+Bacillus+subtilis+evolution+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Increased fitness and alteration of metabolic pathways during Bacillus subtilis evolution in the laboratory.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 4105-4118 (2011).</li>
<li>Burkholder, P. R., Giles, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+biochemical+mutations+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Bot%22%5BJournal%5D)">Induced biochemical mutations in Bacillus subtilis.</a> Am. J. Bot. 34, 345-348 (1947).</li>
<li>McLoon, A. L., Guttenplan, S. B., Kearns, D. B., Kolter, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+domestication+of+a+biofilm-forming+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tracing the domestication of a biofilm-forming bacterium.</a> J. Bacteriol. 193, 2027-2034 (2011).</li>
<li>Zeigler, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+of+168%2C+W23%2C+and+other+Bacillus+subtilis+legacy+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The origins of 168, W23, and other Bacillus subtilis legacy strains.</a> J. Bacteriol. 190, 6983-6995 (2008).</li>
<li>Gunka, K., Tholen, S., Gerwig, J., Herzberg, C., Stülke, J., Commichau, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-frequency+mutation+in+Bacillus+subtilis%3A+requirements+for+the+decryptification+of+the+gudB+glutamate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A high-frequency mutation in Bacillus subtilis: requirements for the decryptification of the gudB glutamate dehydrogenase.</a> 194, 1036-1044 (2012).</li>
<li>Commichau, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Bacillus+subtilis+mutants+with+carbon+source-independent+glutamate+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Bacillus subtilis mutants with carbon source-independent glutamate biosynthesis.</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 12, 106-113 (2007).</li>
<li>Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+suppressors+and+recovery+of+repressed+biochemical+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetic suppressors and recovery of repressed biochemical memory.</a> J. Biol. Chem. 284, 12585-12592 (2009).</li>
<li>Gunka, K., Commichau, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+glutamate+homeostasis+in+Bacillus+subtilis%3A+a+complex+interplay+between+ammonium+assimilation%2C+glutamate+biosynthesis+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Control of glutamate homeostasis in Bacillus subtilis: a complex interplay between ammonium assimilation, glutamate biosynthesis and degradation.</a> Mol. Microbiol. 85, 213-224 (2012).</li>
<li>Yan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+the+glutamate+pool+concentrations+in+enteric+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Protection of the glutamate pool concentrations in enteric bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9475-9480 (2007).</li>
<li>Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+and+regulation+of+Bacillus+subtilis+glutamate+dehydrogenase+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Role and regulation of Bacillus subtilis glutamate dehydrogenase genes.</a> J. Bacteriol. 180, 6298-6305 (1998).</li>
<li>Commichau, F. M., Herzberg, C., Tripal, P., Valerius, O., Stülke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+protein-protein+interaction+governs+glutamate+biosynthesis+in+Bacillus+subtilis%3A+the+glutamate+dehydrogenase+RocG+moonlights+in+controlling+the+transcription+factor+GltC%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A regulatory protein-protein interaction governs glutamate biosynthesis in Bacillus subtilis: the glutamate dehydrogenase RocG moonlights in controlling the transcription factor GltC.</a> Mol. Microbiol. 65, 642-654 (2007).</li>
<li>Gordo, I., Perfeito, L., Sousa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+effects+of+mutations+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fitness effects of mutations in bacteria.</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 21, 20-35 (2011).</li>
<li>Rabatinová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B4+subunit+of+RNA+polymerase+is+required+for+rapid+changes+in+gene+expression+and+competitive+fitness+of+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The δ subunit of RNA polymerase is required for rapid changes in gene expression and competitive fitness of the cell.</a> J. Bacteriol. 195, 2603-2611 (2013).</li>
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<li>García-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (15), (2012).</li>
</ol>

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

細菌の競争力のある適合性を分析するためにいくつかの方法が開発されています16.多くの場合、細菌は異なる抗生物質耐性カセット17で標識された。我々のアプローチと同様に、抗生物質耐性カセットを用いた細胞の標識は、定義された成長条件下での共培養中の細菌の競争力の適合性の評価を可能にする。さらに、この方法は、染色体17上の特定の軌跡において互いに異なる細胞の競争力を決定するために使用することができる。しかし, 競争力のあるフィットネスを監視する抗生物質耐性カセットを使用していくつかの欠点があります。.抵抗性遺伝子の発現は主に不等強度のプロモーターによって駆動されるため、抗生物質に対する耐性を与える酵素はおそらく異なるレベルで産生される。したがって、このアプローチでは弱いフィットネス効果が検出できない場合があります。我々のアプローチでは、両方のフルオロフォア遺伝子が同じ選択マーカーと統合され、その発現は同じプロモーター2によって駆動される。抗生物質耐性カセットで競争力のあるフィットネスを監視するもう一つの欠点は、コロニーカウントに適切な抗生物質を補った2種類の...

土壌細菌は、通常、柔軟な規制ネットワークと広範な代謝能力に恵まれています。両方の特徴は、細胞が与えられた生態学的ニッチ1で利用可能である栄養素のために彼らの仲間や他の微生物と競合するために、それらの同化および同化経路を調整することを可能にする。しかし、細菌が環境に適応できない場合、他のメカニズムは種の生存を説明する可能性があります。確かに、多くの細菌が急速に増殖し、集団が高い細胞密度に達することができるように、亜集団は自発的に細胞に選択的な成長の利点を提供し、したがって、その適性を高める有益な突然変異を蓄積している可能性があります。さらに、突然変異ホットスポットおよびストレス誘発適応性変異発生は、不適合細菌2,3の進化を促進することができる。したがって、連続選択下での突然変異および増殖の蓄積は、同一属4,5内であっても、巨大な微生物多様性の起源である。自然界と同様に、細菌ゲノムの形成は、選択下の連続栽培のために実験室でも起こる。これは、基礎研究および産業界で世界的に使用されているグラム陽性細菌B.サブティリスの家畜化によって例示される。1940年代にB.サチリスをDNA損傷X線で処理し、その後、特定の成長条件6で培養した。それらの家畜化中に細菌に蓄積された突然変異は、多くの成長特性の喪失を占める、すなわちB.サブチリス実験室株168は、複雑なコロニー7,8を形成する能力を失った。
今日では、最もよく研究されたモデル細菌 大腸菌 と B.サブティリスのために、特定の科学的な質問に対処するためにゲノムを遺伝的に操作するための様々な強力なツールが利用可能です。時には、目的の遺伝子の不活性化は、重篤な成長欠陥を引き起こし、その後、標準的な成長培地9ではっきりと見える。対照的に、弱い成長欠陥を引き起こし、ひずみの適性にわずかに影響を与える突然変異はしばしば無視される。しかしながら、いずれの場合も、数世代にわたって変異株の培養および経架を長時間化すると、通常は親株2,9の表現型を回復したサプレッサー変異体の蓄積をもたらす。サプレッサー変異体の特徴付けと、親突然変異株の成長欠陥を回復した突然変異の同定は、重要かつしばしば新しい細胞プロセス10,11の解明を可能にする非常に有用なアプローチである。
我々はB.サチリス12におけるグルタミン酸恒常性の制御に興味を持っている。大腸菌と同様に、B.サチリスは、サプレッサー突然変異体の蓄積によるグルタミン酸恒常性(すなわちグルタミン酸分解2のブロック)の摂動に応答する。自発的突然変異によって獲得されたこれらのサプレッサー変異体におけるゲノム変化は、グルタミン酸恒常性9,13を迅速に回復させることが示された。したがって、細菌の家畜化中の特定の成長条件に対するB.サチリスの適応が酵素合成および進化した酵素活性においてミラーリングされ、グルタミン酸代謝12に関与していることは驚くべきことではない。家畜化過程中の成長培地における外因性グルタミン酸の欠如が、実験室株1682,14における暗号性グルタミン酸脱水素酵素(GDH)gudB CR遺伝子の出現および固定化の原動力であったことが示唆されている。この仮説は、実験室株におけるGDH活性の減少量が外因性グルタミン酸が不足しているときに選択的増殖の利点を細菌に提供するという我々の観察によって支持される2。また、B.サチリス株の培養は、GDH GudBを合成し、外因性グルタミン酸がない場合には、gudB遺伝子2を不活性化したサプレッサー変異体の蓄積をもたらす。明らかに、同化活性GDHの存在は、他の方法で使用できる内因的に産生されたグルタミン酸がアンモニウムおよび2-オキソグルタル酸に分解されるため、細胞にとって不利である(図1)。対照的に、グルタミン酸が培地によって提供される場合、高レベルGDH活性を有するB.サチリス株は、1つの機能GDHのみを合成する株に対して選択的な増殖性を有する。高レベルのGDH活性により、細菌は培地2によって提供される他の炭素源に加えて、第2の炭素源としてグルタミン酸を利用することを可能にする(図1を参照)。したがって、GDH活性は、外因性グルタミン酸の入手可能性に応じて、細菌の適性に強く影響を及ぼす。
ここでは、染色体上の単一の遺伝子座で異なる2つの B.サチリス 株間の種内競争を監視し、可視化するための非常に例示的な方法を提示する(図2)。この2株を、フルオロフォアYFPおよびCFPをコードする yfp および cfp 遺伝子で標識し、異なる栄養条件下で共栽培した。時間をかけてサンプリングし、寒天プレートに適切な希釈液をめっきすることにより、各培養物の生存者は、一般的なステレオ蛍光顕微鏡を使用して容易に監視することができます。この論文に記載されている手順は、細胞集団における有益および有害な突然変異の急速なクローン拡張および除去を、時間の経過とともに容易に行い、視覚化するのに適している。

<table><tbody><tr><td>(NH<サブ>4</サブ>)<サブ>2</サブ>SO<サブ>4</サブ>&nbsp;</td><td>Roth, Germany</td><td>3746</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Difco, USA</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Feic Citrate (CAF)</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>9714</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>Roth, Germany</td><td>5239</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Applichem, Germany</td><td>A3617</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Roth, Germany</td><td>4043</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4&bull;3H2O</td><td>Roth,</td><td>Germany 6878</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Applichem, Germany</td><td>A3582</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth, Germany</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Roth, Germany</td><td>6751</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull;7H2O&nbsp;</td><td>ドイツ、ロート</td><td>P027</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&nbsp;</td><td>ロス、ドイツ</td><td>T881</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4&bull;4H2O</td><td>Merck Millipore,</td><td>Germany 102786</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth, ドイツ</td><td>9265</td><td></td></tr><tr><td>Nutrient broth</td><td>Roth, ドイツ</td><td>X929</td><td></td></tr><tr><td>Potassium glutamate</td><td>Applichem, ドイツ</td><td>A3712</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Roth, ドイツ</td><td>8952</td><td></td></tr><tr><td>Tryptophan</td><td>Applichem, ドイツ</td><td>A3445</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>Roth, Germany</td><td>2363</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Reaction tubes</td><td>Sarstedt, Germany</td><td>72,690,001</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml Reaction tubes</td><td>Sarstedt, Germany</td><td>72,691</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Plastic tubes with screw cap</td><td>Sarstedt, Germany</td><td>62,554,001</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ</td><td>Sarstedt, Germany</td><td>82.1473</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml ポリスチレンキュベット</td><td>ザルシュテット、ドイツ</td><td>67,742</td><td></td></tr><tr><td>15 ml ガラス製培養チューブ&nbsp;</td><td>ブランド、ドイツ</td><td>7790 22</td><td></td></tr><tr><td>100 ml アルミキャップ付きシェイクフラスコ</td><td>ブランド、ドイツ</td><td>928 24</td><td></td></tr><tr><td>滅菌 10 ml ガラスピペット</td><td>ブランド、ドイツ</td><td>278 23</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター (28 および 37 &deg;C)</td><td>ニューブランズウィック</td><td>M1282-0012</td><td></td></tr><tr><td>標準ピペットセット(2-20 &mu;L、10-100 &MU;l、100-1,000 &mu;l)</td><td>エッペンドルフ、ドイツ</td><td>4910 000.034、4910 000.042、</td><td></td></tr><tr><td>1.5および2 ml反応チューブ用卓上遠心分離機</td><td>Thermo Scientific、Heraeus Fresco 21、ドイツ</td><td>75002425</td><td></td></tr><tr><td>15 mlプラスチックチューブ用卓上遠心分離機</td><td>Heraeus Biofuge Primo R、ドイツ</td><td>75005440</td><td></td></tr><tr><td>標準分光光度計</td><td>Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro、ドイツ</td><td>80-2112-21</td><td></td></tr><tr><td>実体蛍光顕微鏡&nbsp;</td><td>Zeiss SteREO Lumar V12、ドイツ</td><td>495008-0009-000冷凍</td><td></td></tr><tr><td>庫(-20および-80&deg;C)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵庫(4°C;C)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>Zirbus、LTA 2x3x4、ドイツ</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>pHメーターpH</td><td>メーター766、Calimatic、Knick、ドイツ</td><td>766</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Vortex 3、IKA、ドイツ</td><td>3340000</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>CP2202S、ザルトリウス、ドイツ</td><td></td>黒ペン(油性マーカー)に<td></td>置き換えられ</tr>ました<tr><td>Staedler、ドイツ</td><td>317-9</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パワーポイントプログラム</td><td>マイクロソフト、米国</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Office Excelプログラム</td><td>マイクロソフト、米国</td><td>-</td><td>データ処理用プログラム</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS5</td><td>Adobe、米国</td><td>CS6に置き換えられ、画像</td><td>処理用コンピュータプログラム</td></tr>をダウンロード <tr><td>コンピュータ</td><td>PCまたはMac-ZEN</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>pro 2011 実体蛍光顕微鏡</td><td>用ソフトウェアツァイス、ドイツ</td><td>410135 1002 110</td><td>AxioCam MRc Rev. Zeiss</td></tr><tr><td colspan="4">Specific solution recipes</td></tr><tr><td colspan="4">SP Medium</strong</td></tr><tr><td>>8 g 栄養ブロス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.25 mg MgSO4&bull;7H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 g KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 g 寒天 固体 SP 培地</td><td></td><td></td>用 <td>必要に応じて</td></tr>、<tr><td>H2O</td><td></td><td></td><td>オートクレーブで 1 L を 121 °C で 20 分間追加します。C</td></tr><tr><td>1 ml CaCl2 (0.5 M)、ろ過</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml MnCl2 (10 mM)、ろ過</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml のクエン酸アンモニウム (CAF、2.2 mg/ml)、ろ過</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr> <td colspan="4">LB Medium</td></tr><tr><td>10 g トリプトン</td><td></td><td></td><td></td></tr>で滅菌<tr><td>5 gの酵母抽出物</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 g、NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 g、固体LB培地</td><td></td><td></td>用、<td>必要に応じて</td></tr>、<tr><td>H2O</td><td></td><td></td><td>オートクレーブを含む1 Lを121°Cで20分間追加します。C</td></tr><tr><td colspan="4">C-Glc Minimal Medium</td></tr><tr><td>200 ml 5 x C塩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml L-トリプトファン (5 mg/ml)、濾過</td><td></td><td></td><td></td>による滅菌</tr><tr><td>10 ml クエン酸アンモニウム (CAF, 2.2 mg/ml)、濾過</td><td></td><td></td><td></td>による滅菌</tr><tr><td>10 ml III' 塩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 ml グルコース (20%)</td><td></td><td></td><td>121°Cで20分間オートクレーブ滅菌。C</td></tr>は<tr><td>滅菌H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">CE-Glc Minimal Medium</td></tr><tr><td>200 ml 5 x C塩10</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ml L-トリプトファン(5 mg / ml)、ろ過</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mlクエン酸アンモニウム(CAF、2.2 mg / ml)、ろ過</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml IIIで滅菌&rsquo;</td><td></td><td></td><td></td>塩</tr><tr><td>20 ml グルタミン酸 (40%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 ml グルコース (20%)、121 °C で 20 分間オートクレーブ滅菌。C</td><td></td><td></td><td></td></tr>は<tr><td>、滅菌H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 x C塩で1Lを追加します&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 g KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>80 g K2HPO4&bull;3H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16.5 g (NH4)2SO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>add 1 L with sterile H2O</td><td></td><td></td><td>オートクレーブで 121 °C で 20 分間;C</td></tr><tr><td>III' 塩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.232 g MnSO4&bull;4H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12.3 g MgSO4&bull;7H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr>に<tr><td>1Lを滅菌H2O、オートクレーブで121°Cで20分間追加します。C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40%グルタミン酸溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 g L-グルタミン酸</td><td></td><td></td><td></td>は</tr><tr><td>、約80 gのKOH</td><td></td><td></td><td></td>を加えてpHを7.0に調整</tr>し、<tr><td>滅菌H2O</td><td></td><td></td><td>オートクレーブで0.5 Lを121°Cで20分間追加します。C</td></tr><tr><td colspan="4">0.9%生理食塩水(NaCl)溶液1L</td></tr><tr><td>を滅菌H2O</td><td></td><td></td><td>オートクレーブで121°Cで20分間追加します。C</td></tr><tr><td>50% グリセロール溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>295 ml グリセロール (87%)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>0.5 L を滅菌 H2O</td><td></td><td></td><td>オートクレーブで 121 °C で 20 分間加えます。C</td></tr><tr><td colspan="4">Bacteria (すべての菌株はBacillus subtilis株168)</td></tr><tr><td>Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-yfp)&nbsp;</td><td>実験室株コレクション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-cfp)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-cfp)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-yfp)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

蛍光標識株の共同栽培による細菌細胞集団における種内競争のモニタリング

Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains

細菌などの多くの微生物は非常に急速に増殖し、集団は高い細胞密度に達する可能性があります。集団の細胞の小さい分数は、常に細胞にとって有害または有益な突然変異を蓄積している。突然変異の適性効果がサブ人口に強力な選択的成長優位性を提供するならば、この亜集団の個体は急速に競争し、さらには彼らの直近の仲間を完全に排除するかもしれない。したがって、有益な突然変異を獲得した細胞の小さな遺伝的変化および選択主導的蓄積は、細胞集団の遺伝子型の完全なシフトにつながる可能性がある。ここでは、グラム陽性モデル 細菌サブティリスの蛍光標識体の共培養によって、時間の経過とともに細菌細胞集団における有益および有害な突然変異の迅速なクローン拡張および消失を監視する手順を提示する。この方法は、細菌細胞集団における個体間の種内競争を表示する方法が容易かつ非常に例示的である。

ここで説明した方法は、フルオロフォアCFPおよびYFPをコードするcfp遺伝子およびyfp遺伝子で標識されたB.サチリス株からなる細胞集団における種内競争を可視化するために、それぞれうまく適用された。図3に示すように、この方法は、非常に例示的な方法で種内競争を視覚化するために使用することができる。小さな領域にサンプルを見つけることによって、細胞集団のクローン組成が一目で見えるようにした。定量的分析には適していないが、このアプローチは、異なる成長パラメータ(すなわち、窒素源)が最初に両方の株を等量で含んでいた細胞集団の発達に及ぼす影響を概算するのに有用である(図3)。また、小規模アプローチでは、同じ成長条件下で栽培された異なるB.サチリス株の適性を単一の寒天プレートを用いて試験することができる。定量分析では、寒天プレートの表面全体にサンプルを伝播することをお勧めします。これにより、コロニーのオーバーレイが防止され、単一細胞から出現したコロニーの識別と数が明確になります。寒天板に適切な...

細菌は、その生涯の間に有害または有益な突然変異のいずれかを蓄積することができます。細胞の集団では、有益な突然変異を蓄積した個体は、急速に仲間を上回る可能性があります。ここでは、蛍光標識された個体を用いて、時間の経過とともに細菌細胞集団における種内競争を可視化する簡単な手順を提示する。

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a ...

本手法では、蛍光標識したbacillus sutilisを共培養することにより、細菌細胞集団における有益な変異および有害な変異の急速なクローン増殖と排除を経時的にモニタリングします。まず、競合実験に用いる細菌の前培養を行います。蛍光標識した各株を等量ずつ混合し、異なる栄養条件下で細菌を共培養します。次に、異なる時間時点でサンプルを回収し、適切に希釈して、アガールプレート上で細胞を増殖させます。続いて、ステレオ蛍光顕微鏡を用いて生存株を可視化し、カウントします。最終的に、カウントした全コロニー数に対する生存細菌の割合を算出できます。菌株の標識に異なる抗生物質耐性カセットを用いて種内競争をモニタリングする方法とは異なり、本手法では、蛍光標識された競合菌株がほぼ等張であり、同一のAGAプレート上での培養が可能です。本手順は、私の研究室の博士課程学生であるLorenaが実演します。-80 °Cのクライオストックから1 µLの細菌を4 mLのLB培地に接種し、28 °C、220 RPMで一晩前培養します。0.1 mLの培養液を1.5 mLのマイクロチューブ内の0.9 mLのLB培地に希釈し、光学密度を測定します。次に、競合実験用の混合細胞集団を得るために、CGLCおよびCGLC最小培地を1:1の比率で20 mL含む100 mLシェーカーフラスコに接種し、培養液10 mLを15 mLプラスチックチューブに移します。4,000 ×gで10分間遠心分離して細胞を回収し、上清を捨てます。次に、細胞を0.5 mLの新鮮なLB培地で再懸濁し、滅菌済みの1.5 mL反応カップに移して、0.5 mLの50%滅菌グリセロールを加えます。懸濁液を激しくボルテックスして混合し、サンプルを-80 °Cのフリーザーで保存します。続いて、シェーカーフラスコ内の残りの細菌を培養します。フローラフォースサンプルの光退色を防ぐため、三角フラスコを暗所に保存します。培養開始から7時間後および24時間後に、培養液を0.1 mL分取します。サンプルの10倍希釈液の光学密度を測定し、記録します。サンプルのクライオストックを作成し、-80 °Cで保存します。すべてのサンプルを回収した後、クライオストックを融解し、各菌株の細胞を0.9%生理食塩水で希釈します。10⁻⁵希釈液を0.1 mLずつSP培地アガープレートに分注し、滅菌ガラスピペットを用いて細胞を分散させます。プレートを37 °Cの暗所で、単一コロニーが出現するまで一晩インキュベートします。黒いペンを用いて、アガープレートの底面を4等分に区切り、ステレオ蛍光顕微鏡で生存数をカウントする際の目安とします。次に、プレートを顕微鏡下で逆さまに置き、冷光光源を用いてコロニーに焦点を合わせます。コロニーにピントが合ったら、CFP Flora 4に適したフィルターセットに切り替えます。CFPでラベル付けされた株の生存細胞を視覚化し、これらのコロニーにペンで印を付けて生存数をカウントします。そして、その数を記録してください。エタノールを用いてラベルを除去します。次に、YFP標識株の生存細胞を可視化するため、YFPフィルターセットに切り替えます。ペンでコロニーに印を付けながら、生存数を再度カウントします。そして、その数を記録してください。同一箇所でCFPフィルターセットおよびYFPフィルターセットを用いて撮影した画像を開きます。培地からのバックグラウンド蛍光を低減させるため、コントラストと明るさを最適化します。いずれかの画像に移動し、「すべて選択」します。その画像をコピーし、もう一方の画像に貼り付けます。レイヤーメニューから「明るい色」オプションを選択して、画像を合成します。この実験では、2つのBCI株からなる細胞集団を蛍光タンパク質CFPおよびYFPで標識し、適切な希釈液を寒天プレートに塗布することで、異なる窒素源が増殖に及ぼす影響を評価しました。黄色と青色の蛍光コロニーを数えるだけで、細胞集団のクローナル組成の経時的変化を正確に決定できます。グルタミン酸脱水素酵素（GDH）の酵素活性は、外来性グルタミン酸の利用可能性に応じて、菌株の適応度に強く影響します。外来性グルタミン酸が存在しない場合、高レベルのGDH活性は細菌にとって不利に働きます。なぜなら、これらの酵素が同化作用に必要なグルタミン酸を分解してしまうためです。対照的に、外来性グルタミン酸が利用可能な場合は、2つの機能的なgdhの合成が細菌にとって有利となります。これは、グルコースに加えてグルタミン酸が炭素源として利用されるためです。ダイスイッチ実験においても同様の結果が得られました。ここでも、グルタミン酸を欠く増殖培地において、高レベルのGDH活性を持つ細菌は、GDH活性が低下した細胞に競り負けました。対照的に、1つの活性GDHのみを合成する細菌は、培養液中から排除されました。培地にグルタメートを添加したところ、混合細胞集団の初期組成は時間経過とともにほぼ一定に維持されました。Fluorを併用した場合に関わらず、Flora Forceの使用は、競合種の強度が生成された後、細菌細胞集団における種内競争をモニタリングするための強力なツールとなります。この手法は、適切に実施すれば5日間で完了することができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

出典:Speare、L.、et al。Vibrio fischeri分離株間の競合的相互作用を定量化するための共同培養法J. Vis.

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我々は競争によって媒介される細菌を監視するための定性分析を記述...

T6SS媒介細菌競争を監視するには、Visualアッセイ

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進化のシナリオで品揃え（空間的分離）の役割は、空間分布の調整を可能にする制御された実験室での単純な微生物系を用いて調べることができます。創始細胞密度を変更することにより、様々な品揃えのレベルは、 枯草菌のコロニーバイオフィルム内の蛍光標識された菌株を使用して可視化することができます。...

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細菌は、細菌間の競争に従事するための多様なメカニズムをコードします。ここでは、細菌単離物間の競合相互作用を特徴付け、それらが混合集団の空間構造にどのように影響するかを特徴付ける培養ベースのプロトコルを提示する。...

ビブリオ・フィシェリ・アイシス間の競争的相互作用を定量化するためのコインキュベーション・アッセイ

この生菌細胞イメージングプロトコルは、時間の経過とともに単一細胞レベルで複数の細菌種間の相互作用を可視化することを可能にする。タイムラプスイメージングは、個々の細胞の運動性および生存率を含む多種細菌群集における種間相互作用を尋問するために、単一培養または共培養における各細菌種の観察を可能にする。...

単細胞間細菌相互作用の運動的可視化

この原稿は、単細胞蛍光顕微鏡を用いて、コカルチャーにおける細菌の競合を可視化し定量する方法を説明する。...

単細胞蛍光イメージングによる細菌間競争の定量化

滴タイトルセルのカプセル化

自己複製能と身体のあらゆる細胞タイプに分化するヒト胚性幹細胞の能力には、両方の医療アプリケーション用の開発や病気の根本的な問題に対処するための研究ツールとして有望視されて保持することを示唆している。ここでは、内部細胞塊のimmunosurgicalの分離による胚からのヒト胚性幹細胞の派生のための簡潔な、ステップバイステップのプロトコルを提供しています。...

免疫手術でヒト胚性幹細胞の導出

学ぶ Bacillus subtilis の蛍光標識株を用いた細菌細胞集団における種内競争の可視化手法。栄養条件の違いによる変異生存率の定量化と進化動態の解析に応用可能です。

蛍光標識株の共同栽培による細菌細胞集団における種内競争のモニタリング

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