蛍光標識株の共同栽培による細菌細胞集団における種内競争のモニタリング

この方法では、蛍光標識されたバチルス・スーティリスの共培養を使用して、細菌細胞集団の急速なクローン増殖と、細菌細胞集団の有益な変異と有害な変異の排除を経時的に監視します。まず、競合実験用の細菌の予備培養物を準備します。蛍光標識された菌株を等量混合し、異なる栄養条件下で細菌を共培養します。

次に、異なる時点でサンプルを採取し、適切に希釈して、寒天プレート上で細胞を増殖させます。次に、実体蛍光顕微鏡で生存株を視覚化し、カウントします。最終的には、結果によって、カウントされたコロニーの総数に対する生存細菌の割合を決定できます。

菌株の標識に異なる抗生物質再カセットを使用して種内競争を監視するのとは異なります。この方法では、蛍光標識された競合他社の菌株はほぼ完全に等張性であり、同じAGAプレートで醸造することができます。私の研究室の博士課程の学生であるロレーナがプレゼントを行い、4ミリリットルのLB培地にマイナス80°Cの1マイクロリットルのバクテリアを接種し、クライオストックを行い、28°Cと220RPMで一晩でプレカルチャーを成長させ、0.1ミリリットルの培養物を0.9ミリリットルのLB培地に希釈します1.5ミリリットルの獣医で。 光学濃度を決定します。

次に、競争実験用の混合細胞集団を得るために、20ミリリットルのCGLCおよびCGLCを含む100ミリリットルの振とうフラスコを接種します。1対1の比率で最小培地を、10ミリリットルの培養物を15ミリリットルのプラスチックチューブに移します。重力の4, 000倍で10分間遠心分離によって細胞を収穫し、上清を捨てます。

次に、細胞を0.5ミリリットルの新鮮なLB培地に再懸濁し、細胞を滅菌1.5ミリリットルの反応カップに移し、0.5ミリリットルの50%滅菌グリセロールを添加します。懸濁液を厳密なボルテックスで混合し、サンプルをマイナス80°Cの冷凍庫に保管します。次に、シェイクフラスコに残っている細菌を培養します。

植物相の力サンプル0.1ミリリットルの光退色を防ぐために、シェイクフラスコを暗闇に保管し、7時間および24時間の成長測定後に培養物0.1ミリリットルを測定し、サンプルの1〜10希釈の光学密度に注意し、サンプルのクライオストックをマイナス80°Cで保存します。すべてのサンプルを採取した後、クライオストックを解凍し、各ひずみプレートについて0.9%生理食塩水で細胞を希釈します。0.1ミリリットルの10〜5分の1をSP培地寒天培地プレート上に陰性5希釈し、滅菌ガラスピペットを用いて細胞を分配する。

プレートを暗闇の中で摂氏37度で一晩インキュベートし、単一のコロニーが黒いペンで現れるまで。寒天プレートの底部を4つの部分に分割して、実体蛍光顕微鏡で生存者をカウントしながら、向きを良くします。次に、プレートを逆さまにして顕微鏡の下に置き、冷光源を使用してコロニーに焦点を合わせます。

コロニーにピントが合ったら、CFP Flora fourの適切なフィルターセットに切り替えます。CFP標識株の生存細胞を視覚化するには、ペンでコロニーを標識することにより、この株の生存者を数えます。そして、番号をメモします。

エタノールでラベルをはがします。次に、YFPフィルターセットに切り替えます。YFP標識株の生存細胞を可視化する。

ペンでコロニーにラベルを付けて、生存者を再度数えます。そして、番号をメモします。CFPフィルターセットとYFPフィルターセットで撮影した1つのスポットからの写真を開きます。

コントラストと明るさを最適化して、メディアからのバックグラウンド蛍光を低減します。写真の1つに移動し、すべてを選択します。画像をコピーして、他の画像に貼り付けます。

レイヤーメニューでオプション明るい色を選択して、画像をマージします。この実験では、2つのBCI株からなる細胞集団をFluor CFPおよびYFPで標識し、寒天プレートに適切な希釈をプレーティングすることにより、異なる窒素源が増殖に及ぼす影響を評価しました。細胞集団の経時的なクローン組成は、黄色と青色の蛍光コロニーを数えるだけで正確に決定できます。

グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素活性は、外因性グルタミン酸の利用可能性に応じて、otusの適応度に強く影響します。外因性グルタミン酸がない場合、高レベルのGDH活性は、酵素ロックGと善玉Bが同化作用に必要なグルタミン酸を分解するため、細菌にとって不利です。対照的に、外因性グルタミン酸が利用可能な場合、Gに加えてグルコースグルタミン酸が炭素源として使用されるため、2つの機能的gdhの合成は細菌にとって有利です。

同様の結果は、ダイスイッチの実験でも得られました。ここでも、高レベルのGDH活性を備えた細菌は、グルタミン酸を欠く増殖培地でGDH活性が低下した細胞と競合しました。対照的に、1つの活性GDHのみを合成する細菌は、培養物から排除されました。

培地にグルタミン酸を添加すると、混合細胞集団の初期組成は経時的にほぼ一定に保たれたことが明らかでした。Fluorを一緒に取ったものに関係なく。Flora Forceの使用は、競合他社の強みが生成された後、細菌細胞集団における種内競争を監視するための強力なツールです。

この手法は、適切に実行すれば5日で実行できます。