ライブマクロファージにおけるファゴリソソーム生合成の研究

次の実験の全体的な目標は、食細胞におけるファゴソームの成熟とファゴリソソーム生合成のリアルタイムの動的プロセスを捉えることです。これは、細胞のリソソームコンパートメントに蛍光標識デックスストランドをロードして、リソソームコンパートメントの可視化とその管腔カーゴのファゴソームへの移動を可能にすることによって達成されます。第2のステップとして、食作用モデルとして機能する微粒子が追加されます。

次に、ファゴソームへのリソソーム物質の送達を、ライブ販売イメージングとその後のデジタル画像処理を使用して分析します。ファゴソームの成熟過程を定量化するために、結果は、ファゴソームへのリソソーム含量の送達に基づくファゴソーム成熟の過程に対するさまざまな要因の影響を示しています。既存の方法のこの技術の主な利点は、固定細胞におけるマクロファージ成熟の評価など、高い時間分解能での量的読み出しであり、20ミリグラム/ミリリットルでPBS中の70キロダルトンDExTストランドまたはデックス70KDをテキサスレッドとラベル付けし、マイナス20°Cでアリコートを保存することから始めます。

次に、完全細胞培養Docos、改変イーグルス培地、またはDMEM中のDex 70 KDストックを1ミリリットルあたり約1ミリグラムに希釈します。DExTストランドアリコートを超音波水浴で5分間超音波処理します。次に、マイクロ遠心分離機で溶液を最高速度で5分間遠心分離し、溶液から凝集物や汚染物質を取り除きます。

SuperAgentを新しいチューブに慎重に移動させ、下部のペレットを避けます。次に、溶液を最終使用濃度である20マイクログラム/ミリリットルまで希釈し、完全細胞培養を行います。DMEMとフィルター。

0.22マイクロメートルのシリンジに取り付けられたフィルターで溶液を滅菌します。次に、骨髄由来マウスマクロファージの2ミリリットルを1ミリリットルあたり10の5倍から第4の細胞の濃度まで観察する。コーティングされていないガラス底皿のDMEMで、5%二酸化炭素緩衝雰囲気中で細胞を摂氏37度で少なくとも12時間インキュベー

付着と接着後の順応を確実にするために、培地を吸引し、戦前のDExTストランドDMEMを2ミリリットルガラス底皿に加え、インキュベーション後2〜8時間細胞をインキュベートします。プレウォームコンプリートDMEMで細胞を3回洗浄します。最終すすぎ後に培地を吸引し、2ミリリットルの完全DMEMを追加します。

細胞を4〜12時間インキュベートします。次に、予温したフェノールレッドフリーの完全DMEMで細胞をすすぎ、イメージング開始の少なくとも30分前に2ミリリットルの完全ろ過フェノールレッドフリーDMEMを添加します。次に、添付のテキストプロトコルに記載されているように調製した1%IgGコーティングビート懸濁液のアリコートを室温に持ち込みます。

超音波水浴中で溶液を2〜3分間超音波処理します。次に、クラス2のバイオセーフティキャビネットの下に、1〜6マイクロリットルのビーズ懸濁液を細胞に加えます。ピペットを使用してビーズの密集した雲を拡散させ、ガラス底皿の懸濁液を穏やかに混合します。

次に、サンプルを顕微鏡に持って行き、関心領域に焦点を合わせます。タイムラプス撮影前。スキャン、速度倍率、解像度などの設定を最適化して、7〜20秒ごとに1フレームをキャプチャできるようにします。

使用するイメージングシステムやプローブに応じて励起発光の設定を調整し、過剰な光退色を防ぐための設定を最適化してください。次に、タイムラプスビデオをキャプチャし、顕微鏡のネイティブファイル形式で保存します。JPGやPNGなどの圧縮形式でビデオをエクスポートすることは避けてください。

次に、再編成されたツールメニューと無料で利用できる追加のネイティブプラグインを備えた画像処理パッケージを含むFijiとImageJディストリビューションを起動します。ダウンロード。フィジーでファイルを開き、評価するビデオを選択します。次に、オプション、フィルタ、および測定パラメータを、付属のテキストプロトコルに詳述されているように設定します。

次に、完全に形成された新生ビーズファゴソームが形成され、F酸性カップが閉じられているフレームに注目して、画像をスキャンします。楕円選択ツールを使用して、内部化されたビード上の円形の関心領域またはROIを選択します。選択がビードの外縁にしっかりと収まっていることを確認してください。

次に、[分析]に移動し、[測定]をクリックして測定を実行します。結果は、resultsというタイトルの別のウィンドウに表示されます。次の対象フレームで、ビーズが移動した場合に備えてROIの位置を調整し、測定を繰り返すと、結果ウィンドウのリストに追加されます。

分析された各フレームは、ラベル列の値に基づいて識別できます。関連するすべてのフレームの測定が完了したら、int den列からスプレッドシートアプリケーションに値をコピーします。int den列は、選択した領域の強度を示します。

これらの方法を使用して、DExT鎖プローブをロードした骨髄由来マクロファージの鮮明な画像を取得しました。この画像は、ここで指摘されているIgGコードビーズの取り込みを細胞が完了したちょうどその時点であるタイムゼロのものです。ここに示されている画像は、視認性を高めるために疑似色付けされており、取り込み後0分から85分後のファゴソームを示しています。

測定されたファゴソーム、ROIは破線で概説され、ファゴソーム内のデキストラン送達および蓄積のインスタンスは矢印で示されています。次に、これらの画像からグラフを生成し、時間の経過に伴うファゴソームとのシグナル関連の明確な時間的傾向を示しています。このグラフは、ここに示されている2つの細胞からの平均10個のファゴソームを表しています。

絶対的なシグナル強度は、分析された各ファゴソーム間でしばしば異なりますが、時間的傾向は通常非常に類似しています。Dex 70 KDをファゴソームに送達すると、食作用後35〜40分以内にプラトーに達しました。このビデオを見れば、タイムラプス共焦点顕微鏡を使用してファゴソームの成熟を評価する方法について十分に理解できるはずです。