Name: ライブマクロファージにおけるファゴリソソーム生合成の研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 学ぶファゴソーム成熟とファゴリソソーム生合成の可視化法。蛍光標識デキストランを用いてマクロファージのライソソーム動態をリアルタイムで観察し、免疫細胞機能の理解を深める定量的解析手法です。

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私たちは、原稿の重要な読書のためのファゴソームの生物学研究室のメンバーに感謝。この作品は、ヘルムホルツ若手研究助成（イニシアティブやヘルムホルツ協会のネットワーク化ファンド） と優先プログラムドイツ研究協会（ドイツ学術振興、DFG）のSPP1580グラントによってサポートされています。

<ol><li>Greenberg, S., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and innate immunity.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).</li>
<li>Jutras, I., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).</li>
<li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+adaptive+immunity+by+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of adaptive immunity by the innate immune system.</a> Science. 327, 291-295 (2010).</li>
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<li>Blander, J. M., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+regulation+of+phagosome+maturation+and+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">On regulation of phagosome maturation and antigen presentation.</a> Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+aging+gracefully%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: aging gracefully.</a> Biochem. J. 366, 689-704 (2002).</li>
<li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagosome%3A+compartment+with+a+license+to+kill%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The phagosome: compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8, 311-330 (2007).</li>
<li>Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+mechanisms+of+phagocytes+and+bacterial+evasion+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).</li>
<li>Luzio, J., Pryor, P., Bright, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes%3A+fusion+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes: fusion and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 622-632 (2007).</li>
<li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Endosome maturation.</a> EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).</li>
<li>Luzio, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome-endosome+fusion+and+lysosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis.</a> J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).</li>
<li>Eissenberg, L., Goldman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+lysosomes+with+phagosomes+containing+Histoplasma+capsulatum%3A+use+of+fluoresceinated+dextran%29%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran).</a> Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).</li>
<li>de Souza Carvalho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization%2C+phagolysosomal+biogenesis+and+killing+of+mycobacteria+in+enucleated+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).</li>
<li>Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+and+sequential+delivery+of+fluorescent+lysosomal+probes+into+phagosomes+in+mouse+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages.</a> J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).</li>
<li>Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosomes+Fuse+with+Late+Endosomes+and%2For+Lysosomes+by+Extension+of+Membrane+Protrusions+along+Microtubules%3A+Role+of+Rab7+and+RILP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP.</a> Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).</li>
<li>Huynh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAMP+proteins+are+required+for+fusion+of+lysosomes+with+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes.</a> EMBO J. 26, 313-324 (2007).</li>
<li>Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+mechanism+of+cargo+sorting+during+lysosome-phagosome+fusion+is+controlled+by+Rab34%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).</li>
<li>Snijder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+context+determines+cell-to-cell+variability+in+endocytosis+and+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection.</a> Nature. 461, 520-523 (2009).</li>
<li>Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).</li>
<li>Hemmi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Toll-like+receptor+recognizes+bacterial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA.</a> Nature. 408, 740-745 (2000).</li>
<li>Underhill, D., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors%3A+key+mediators+of+microbe+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors: key mediators of microbe detection.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).</li>
<li>Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+I+and+class+III+phosphoinositide+3-kinases+are+required+for+actin+polymerization+that+propels+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes.</a> J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).</li>
<li>Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+receptor-ligand+interactions+modulate+gene+expression+and+phagosomal+properties+during+both+early+and+late+stages+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis.</a> Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).</li>
<li>Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+phagosome+maturation+as+a+function+of+phagosome%2Flysosome+fusion+and+acquisition+of+hydrolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity.</a> Traffic. 6, 413-420 (2005).</li>
<li>Savina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOX2+controls+phagosomal+pH+to+regulate+antigen+processing+during+crosspresentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells.</a> Cell. 126, 205-218 (2006).</li>
<li>Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+phagosome+maturation+through+the+real-time%2C+spectrofluorometric+measurement+of+hydrolytic+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities.</a> Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).</li>
<li>Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+marches+on+its+phagosome%3A+dynamic+assays+of+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li>
<li>Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+phagosomal+degradation+and+antigen+presentation+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).</li>
<li>Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Responds+to+Chloride+and+pH+as+Synergistic+Cues+to+the+Immune+Status+of+its+Host+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li>
<li>Aziz, M., Yang, W. -L., Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current protocols in immunology. Coliganet, J. E., et al. 14, (2013).</li>
<li>Rogers, L., Foster, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+phagosomal+proteome+and+the+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).</li>
<li>Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+marches+on+its+phagosome%3A+dynamic+assays+of+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li>
<li>Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -M., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+pH%2C+ROS+production%2C+maturation%2C+and+degradation+in+dendritic+cell+phagosomes+using+cytofluorometry-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays.</a> Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

次のセクションでは、提示された方法とその限界の重要なステップを説明します。さらに、我々は、その解決策の一般的な問題のいくつかを接続可能な修飾を導入し、本手法の利点だけでなく、このアプローチに適し補完的な方法を検討していきます。 ビーズ表面へのIgGの結合を含むビーズの調製は、重要であり、unfresh製剤の使用は避けるべきである。それへの追加では、デキストランが新鮮にあらゆる実験の前に凍結ストック（希釈し、滅菌した）から製造されていることも重要である。それはデキストランの負荷が細胞取り込みおよびコンパートメント分布及び蓄積の一貫性を達成するための正確なスケジュールに従うことが重要である。また、のみならず、同じ顕微鏡のセットアップおよびソフトウェア設定を使用するだけでなく、可能な限り一定の周辺条件を維持することが重要である（ 例えば、テmperature、CO ​​2、湿度、ビード付加技術、 等 ）。別の重要な点は、視野や関心のある細胞の選択である、サンプルは代表的なものである細胞を選択するために撮影開始前に未べきである。 <...

マクロファージを含む専門的な食細胞は、免疫系で重要なを果たしている。先天性免疫系における最初の防衛線であることに加えて、それらはまた、それらのシグナル伝達およびロール1-3抗原提示を介して適応免疫の活性化において重要な役割を果たす。専門的な食細胞の機能は多面的ですが、ファゴソームの成熟は、プロの食細胞4,5の殺菌及び抗原処理機能の重要なバックボーンです。受容体を介した貪食や細菌などの貪食ターゲットの取り込み時には、発生期のファゴソームは、相互作用し、エンドサイトーシスネットワークのコンパートメントおよび他のいくつかの細胞小器官6の交流の複雑でよく編成シーケンスを通過します。化合物の性質は、これらの細胞の実体だけでなく、規制と交換し、融合事象のタイミングは、管腔ファゴソーム環境とphagosを決定OMALの膜組成と、このように7、成熟ファゴソーム8の運命。 ファゴソーム成熟の生理的関連性は、から逃げる停止またはファゴソーム成熟9を破壊するために、様々な細胞内病原体によって使用される多様な戦略によって例示される。これらの戦略の最も直接的または間接的にファゴソームの成熟過程の最終的かつ重要な段階を防ぐ：加水分解酵素と成熟ファゴソーム7の抗菌要因の大部分とそれらを賦与後期エンドソーム/リソソームコンパートメントファゴソームの融合、 、8,10。この最終的な重要なステップの分析は、したがって、ファゴソームの成熟の状態について、自然な生理的な状態は、正または負に利用されている特定の実験設定で影響を受けているかの強力な指標を提供してくれることができます。 後期エンドソーム/リソソーム区画sが、一般に種々のステージ特異的マーカー分子の存在により早期エンドサイトーシス区画から、エンドサイトーシス経路の末端区画とみなす定義され、区別される。例えばこのような他の人の間で11リソソーム関連膜タンパク質（ランプ）などの加水分解酵素や膜成分のため。ターミナルエンドサイトーシスは、区画-今後リソソームは、また、食細胞/エンドサイトーシス経路12の最後に消化の最終段階のための主要な場所として機能し、単にと呼ばれる。このように、難消化性プローブは、細胞外環境からのエンドサイトーシスおよびマクロピノによってロードすることができ、それを取り込み、チェイスの定義されたサイクルに従った後13,14を蓄積リソソームへのエンドサイトーシス経路を通って輸送される。 15-17 endocyticprobesなどの有機難消化性高分子デキストランのような蛍光顕微鏡用の蛍光団結合プローブは、一般的に使用されている。 <p clasこの方法ではs = &quot;jove_content&quot;&gt;、我々は、ファゴソーム、リソソーム内腔にコンテンツの配信を分析することによって、ファゴソーム成熟を研究する貪食カーゴとしてIgGをコーティングしたマイクロビーズの使用を記載している。ライブ骨髄由来マクロファージ（BMM）、共焦点レーザー走査顕微鏡でタイムラプスビデオ画像内のリソソームの容易に検出可能なマーカーとして蛍光団結合デキストランプローブを用いて、我々は高とファゴソームへの貨物輸送の動的なプロセスに従う時間分解能。次に、フィジー（又はImageJの）収集タイムラプス撮影データは、オープンソース、無料利用可能な画像解析ソフトウェアを用いて評価することができる方法を説明し、統計的にMicrosoft Excelを用いて解析し、グラフパッドプリズムソフトウェア14,18を用いて提示した。 我々の方法の説明に続いて、類似の実験は、ファゴソーム成熟に対するそれらの影響を調査するために変更された設定および因子を使用して設計することができ、実質的に任意のオト付着性の一次または細胞ラインの貪食細胞の彼女のタイプ、遺伝子ノックアウトやノックダウンを、変異体または融合タンパク質の発現、食細胞 - ターゲット、マイクロビーズコーティング化合物、エンドソーム/リソソームプローブや要因などAを含む機能実験の遺伝的損失とりわけ、サイトカイン、化学阻害剤、またはsiRNAは、この方法の基本的なアプローチを適用することができるすべての変数である。 私たちは、このメソッドは次のようにするという目標や基本的な要件を定義します。 <ul type="disc"><li>この方法の目標：食細胞を生きた高い時間分解能でファゴソームの成熟の、直接的な定量的および定性的観察と分析を可能にする。 </li><li>貪食貨物：適切にコーティングされた微粒子または生物学的標的。ここでは、容易に食作用を媒介するのFc-γ受容体を介して内在化さIgGをコーティングした3μmの球状のポリスチレン微粒子を使用しています。代わりに、任意の微生物またはコーティングされたMIC貪食受容体が細胞上に存在するためにroparticleを使用することができる。 </li><li>食細胞：適切な貪食受容体を発現する接着食細胞。ここでは、豊富のFc-γ受容体を発現するマウス初代BMMSを使用しています。あるいは、樹状細胞（DC）、単球または食作用上皮細胞またはそれらの遺伝的変異体またはノックアウト変異体を使用することができる。 </li><li>リソソーム貨物：蛍光標識したリソソームプローブ。ここで、テキサスレッドコンジュゲート7万キロダルトンのデキストラン（Dex70kD）はリソソームの管カーゴとして使用される。あるいは、そのような酸味や、分解能力などのファゴソームプロパティの細胞区画または細胞小器官、または適切なプローブのいずれかの蛍光検出可能なマーカーは、ファゴソーム成熟の進行を研究するために使用することができた。 </li><li>例えば分子、化学化合物、遺伝子ノックダウン、または変異タンパク質の一過性発現を可能性があり、シグナリング：要因に影響を与える。ここでは、FORGを持っている簡単のためにこのような因子の1使用していますが、変異型タンパク質の発現およびKasmapour ら 18ファゴソームの貪食や状況と移動性に影響を与えると/できるあらゆる要因を参照してくださいノックダウンに影響を与える要因との最近の例または成熟ファゴソームと対話コンパートメントは、潜在的に使用することができる。 </li></ul>

<table><tbody><tr><td>ダルベッコの改変イーグルスミディアム(D-MEM)</td><td>PAA、オーストリア</td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコの改変イーグルスミディアムフェノールレッド(D-MEM)</td><td>PAA、オーストリア</td><td>E15-047</td><td></td></tr>ウ<tr><td>シ胎児血清(FBS)</td><td>PAA、オーストリア</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>PAA、オーストリア</td><td>M11-004</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>PAA、オーストリア</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>PAA, Austria</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>WillCo-dish&reg;ガラス底皿(35 mm&empty;、#1.5)</td><td>WillCo Wells、オランダ</td><td>GWSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>CELLviewTMガラス底皿、35 mm</td><td>Greiner Bio one、ドイツ</td><td>627871</td><td>代替:セグメント化された</td></tr><tr><td>カルボキシル化ラテックス微球</td>として利用可能 <td>Polysciences、USA#</td><td>09850</td><td>さまざまな直径で利用可能で、3 &mu;m</td></tr><tr><td>ポリスチレン微粒子</td><td>Kisker Biotech, ドイツ</td><td>PPs-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>ROTH, ドイツ</td><td>305.1.3</td><td></td></tr><tr><td>マウス全体</td><td>IgG Rockland, USA</td><td>010-0102</td><td></td></tr><tr><td>EDAC 架橋剤</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>E6383-1g</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris</td><td>Sigma-Aldrich,USA</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>1-ml syringeOmnifix -F</td><td>B.Braun、ドイツ</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>26&nbsp;G針 (0.45*25 mm)</td><td>B.Baun, Germany</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA, Austria</td><td>E15-039</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Gibco, USA</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu;Mシリンジマウントフィルター</td><td>ザルトリウス、ドイツ</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr></tbody></table>

ライブマクロファージにおけるファゴリソソーム生合成の研究

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

貪食細胞はそのファゴソーム内侵入する微生物を除去して除去することにより、自然免疫系において主要な役割を果たしている。ファゴソームの成熟は、新生ファゴソームが細胞質内の種々の細胞小器官とコンパートメントよく編成の相互作用を介して抜本的な転換を受けている間、複雑で厳密に調節されたプロセスである。その溶解性と殺菌性とファゴソームを持たせることにより、食細胞の生理機能に必須であるこのプロセスは、リソソームとファゴソームのための成熟の最後と重要な段階であると考えられているファゴリソソームの生合成とファゴソームの融合で絶頂に達する。本稿では、ファゴリソソーム生合成の特徴であるコンテンツ配信を、ファゴソームするリソソームの動的な過程の定性的および定量的分析のための生細胞イメージングベースの方法を説明します。このアプローチは、phagocyのモデルとしてのIgGでコーティングされたマイクロビーズを使用しています管腔リソソーム貨物プローブとしてtosisと蛍光団結合デキストラン分子、タイムラプスイメージング、共焦点レーザー走査顕微鏡を使用してライブマクロファージにおけるリアルタイムにファゴソームにlysosmalコンテンツの動的配信を追跡するために。ここでは、準備手順や他のラボで、この方法の簡単で正確な展開を可能にするためのステップバイステップの実験、詳細に背景を説明します。我々の記載された方法は、単純な堅牢な、そして最も重要なことは、容易に異なるシステムや様々な食細胞タイプ、機能喪失実験を、異なるプローブの使用などの様々な実験設定でファゴソームの相互作用および成熟を研究するために適合させることができるであり、そして貪食粒子。

イメージングのための細胞やビーズの正しい準備が非常に重要です。 図1に、BMMSための私達の最適化されたプロトコルに基づいて播種、プローブのロードと、この方法では、最初の画像化手順の概要を示している。これは、プロトコル·パラメータが使用される細胞およびプローブの種類に応じてテストし、最適化することが不可欠である。 プリロードされた細胞に対するIgG被覆ビーズの添加後に、事前定義された倍率設定を維持しつつ、視野が可能な細胞の最大数の潜在的な取り込みイベントの最大数を提供するように選択することが重要であるプロトコルの。 図2に示すように、このアプローチは、各タイムラプスビデオにおける分析可能なファゴソームより多数を提供することができる。各実験セットのビデオ収量当たりのデータポイントを増加させることに加えて、これは、様々なperipheによって導入された変動を減少させるRAL条件とデータの堅牢性を向上させます。 それが可能ならば、信号関連測定手順（ ...

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

本実験の全体的な目的は、食細胞におけるファゴソームの成熟およびファゴリソソーム形成のリアルタイムな動的プロセスを捉えることです。これは、細胞のリソソーム区画に蛍光標識デキストランを充填することで、リソソーム区画の可視化およびその腔内カーゴのファゴソームへの移行を可能にすることで達成されます。第二のステップとして、食作用のモデルとして機能するマイクロパーティクルを添加します。次に、生細胞イメージングとそれに続くデジタル画像処理を用いて、ファゴソームへのリソソーム物質の輸送を解析します。ファゴソームの成熟過程を定量化するため、ファゴソームへのリソソーム内容物の輸送に基づいた、ファゴソーム成熟過程に対するさまざまな因子の影響を結果として示します。固定細胞におけるマクロファージの成熟評価などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、高い時間分解能を持つ定量的な読み取りが可能なことです。まず、Texas red標識した70 kilodalton DExTストランド（Dex 70 KD）をPBSで20 mg/mLに溶解し、分注して-20 °Cで保存します。次に、Dex 70 KDストック溶液を完全細胞培養用Docos、Modified Eagle's Medium、またはDMEMで約1 mg/mLに希釈します。DExTストランド分注液を超音波洗浄機で5分間ソニケーションします。その後、溶液中の凝集物や不純物を除去するため、マイクロ遠心機を用いて最大回転数で5分間遠心分離します。底部のペレットを避けて、SuperAgentを慎重に新しいチューブに移します。その後、完全細胞培養用DMEMで希釈し、ろ過して最終的な作動濃度を20 µg/mLに調整します。0.22 µmのシリンジ装着フィルターを用いて溶液を滅菌します。次に、骨髄由来マウスマクロファージ2 mLを、DMEMを用いて5 × 10⁴ cells/mLの濃度に調整します。コートしていないガラスボトムディッシュに細胞を播種し、5% CO2緩衝雰囲気下、37 °Cで少なくとも12時間インキュベートします。細胞の接着と接着後の馴化を確実にするため、培地を吸引し、あらかじめ温めておいたDExT strand DMEM 2 mLをガラスボトムディッシュに加えてから、2～8時間インキュベートします。あらかじめ温めておいた完全DMEMで細胞を3回洗浄します。最後の洗浄後に培地を吸引し、完全DMEM 2 mLを加えます。細胞を4〜12時間インキュベートします。次に、あらかじめ温めておいたフェノールレッドフリーの完全DMEMで細胞を洗浄し、イメージング開始の少なくとも30分前に、ろ過済みのフェノールレッドフリー完全DMEMを2 mL添加します。続いて、付属のテキストプロトコルに従って調製した1% IgGコートビーズ懸濁液のアリコートを室温に戻します。溶液を超音波洗浄機で2～3分間ソニケーションします。次に、クラス2バイオセーフティーキャビネット内で、ビーズ懸濁液を1～6 µL、細胞に添加します。ピペットを用いてガラスボトムディッシュ内の懸濁液を静かに混ぜ、密集したビーズの塊を分散させます。次に、サンプルを顕微鏡にセットし、関心領域にピントを合わせます。タイムラプスイメージングを行う前に、7秒から20秒に1フレームを撮影できるよう、スキャン速度、倍率、解像度などの設定を最適化してください。使用するイメージングシステムおよびプローブに基づいて励起・蛍光波長の設定を調整し、過度な光退色を防ぐように設定を最適化します。その後、タイムラプスビデオを撮影し、顕微鏡のネイティブファイル形式で保存してください。JPGやPNGなどの圧縮形式でのビデオ書き出しは避けてください。次に、ツールメニューが再構成され、無料のネイティブプラグインが追加された画像処理パッケージを含むFijiおよびImage Jディストリビューションを起動します。ダウンロードしてください。Fijiでファイルを開き、評価対象のビデオを選択します。その後、付属のテキストプロトコルに詳述されているオプション、フィルター、および測定パラメータを設定します。次に、完全に形成された新生ビーズファゴソームが形成され、F酸性カップが閉じたフレームを確認しながら画像をスキャンします。楕円選択ツールを使用して、内部に取り込まれたビーズ上の円形関心領域（ROI）を選択します。選択範囲がビーズの外縁にぴったりと合うようにしてください。次に、「analyze」に移動し、「measure」をクリックして測定を実行します。結果は、「results」というタイトルの別ウィンドウに表示されます。次の関心フレームにおいて、ビーズが移動している場合はROIの位置を調整し、測定を繰り返します。測定結果は「results」ウィンドウのリストに追加されます。解析した各フレームは、ラベル列の値に基づいて特定できます。関連するすべてのフレームの測定が完了した後、int den列の値をスプレッドシートアプリケーションにコピーしてください。int den列は、選択領域の強度を示しています。これらの手法を用いて、DExTストランドプローブを導入した骨髄由来マクロファージの鮮明な画像をキャプチャしました。この画像はタイムゼロ、すなわちここで示されているIgGコードビーズの細胞内取り込みが完了した直後のものです。ここに表示されている画像は、視認性を高めるために擬似カラー処理されており、取り込み後0分から85分までのファゴソームを描写しています。測定されたファゴソームのROIは点線で囲まれており、デキストランがファゴソームへ輸送され蓄積している箇所を矢印で示しています。これらの画像からグラフを作成したところ、時間の経過とともに信号がファゴソームに関連する明確な時間的傾向が示されました。このグラフは、ここに示した2つの細胞から得られた10個のファゴソームの平均値を表しています。解析する食細胞（ファゴソーム）ごとに絶対的な信号強度は異なることが多いですが、時間的な傾向は通常非常に似ています。Dex 70 KDのファゴソームへの輸送では、食作用から35～40分以内にプラトーに達しました。このビデオを視聴することで、タイムラプス共焦点顕微鏡を用いてファゴソームの成熟を評価する方法について、十分に理解できたはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

このビデオは、ガラス底皿の表面に付着したIgGオプソン化赤血球(RBC)のマクロファージ媒介性食作用におけるファゴソームの形成と閉鎖をリアルタイムで可視化するための高解像度の全反射蛍光(TIRF)顕微鏡法を示しています。マクロファージはRBCの周囲に偽足を伸ばし、ファゴソーム内に飲み込み、ガラス表面から分離します。...

TIRF顕微鏡法によるファゴソームの形成と閉鎖の可視化

我々は、のライブセルビデオ顕微鏡のための方法を説明します...

真菌病原体の食作用の生細胞ビデオ顕微鏡

全反射蛍光顕微鏡を用いて、生きたマクロファージにおける前例のない高分解能のファゴソーム形成とクロージャを3次元で可視化するための実験設定について説明します。これにより、食細胞カップの基部、伸びる偽足、および食細胞の正確な部位を監視できます。...

「ファゴソーム閉鎖アッセイ」全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）を用いて、三次元的にファゴソーム形成を可視化します

ヒト免疫不全ウイルス(HIV)1型に感染した、または感染していない生細胞の細胞中心に向かって移動するファゴソームの速度を測定する方法を、蛍光感染細胞を特定するためのスピニングディスク共焦点蛍光顕微鏡とファゴソームを検出するための明視野顕微鏡を用いて説明します。...

HIV-1に感染したライブ初代ヒトマクロファージで測定ファゴソームの移行と速度

ここでは、真菌、カンジダ・アルビカンス、およびザイモサンやIgGコーティングビーズを含む0.5μmを超える微粒子などの病原体の食作用中の初期のカスケードを視覚化し、定量化するための顕微鏡ベースの技術について説明します。...

食作用の初期段階の可視化

蛍光に分類された髄鞘の残骸と細胞内脂質液滴染色を使用してプライマリ...

体外骨髄由来マクロファージによって髄鞘の残骸の貪食

簡単で迅速なサルモネラの分離法をご紹介-ビオチンとストレプトアビジン菌をコーティングすることによりマクロファージからファゴゾームを含みます。...

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

ここでイメージの単一食イベントに回転ディスク共焦点顕微鏡を用いたマウス腹腔マクロファージの方法について述べる。他の貪食細胞に、プロトコルを拡張できます。...

マウスのマクロファージによる貪食のコマ撮りの 3 D イメージング

リーシュマニア感染における貪食作用に関連するメカニズムは、ほとんど解明されていないままである。ここでは、リーシュマニアと宿主細胞との相互作用の間に起こる初期事象を評価する方法について説明する。...

共焦点顕微鏡を用いた リーシュマニア の貪食作用の調査

本研究では、哺乳類細胞におけるGodanti...

哺乳類細胞におけるGodanti Bhasmaによって引き起こされる食作用の連続的な細胞イベントの探索

学ぶファゴソーム成熟とファゴリソソーム生合成の可視化法。蛍光標識デキストランを用いてマクロファージのライソソーム動態をリアルタイムで観察し、免疫細胞機能の理解を深める定量的解析手法です。

ライブマクロファージにおけるファゴリソソーム生合成の研究

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