Name: インテイン媒介人工タンパク質ヒドロゲルの合成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 6 s
Description: 学ぶインテイン媒介による人工タンパク質ヒドロゲルの合成法。細菌宿主で2つのタンパク質ブロックを合成し、親和性クロマトグラフィーで精製後、混合して自己組織化ポリペプチドを形成する。高安定性のスカフォールドとしてタンパク質固定化に応用可能である。

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著者らは、プラスミドKanR-IntRBS-NpuNC-CFNは11の彼の種類のギフト用プラスミドpQE9交流10 ATRP 12、博士トム·ミューア（プリンストン大学）の彼の種類のギフトのためのデビッドTirrell（カリフォルニア工科大学）を承認したいと思いますプラスミドの彼の種類のギフトpJD757 13用プラスミドたpET30-CutA-TIP1 10、博士ジェイD.キースリング（UCバークレー）の彼の種類のギフトのための博士武久松田（テクノロジー、白山、石川県の金沢工業大学） 。この作品は、全米科学財団キャリア、米国空軍YIPとノーマン·ハックマン先進研究プログラムによって部分的にサポートされていました。

1。プラスミド構築注：すべての遺伝子は、製造業者の仕様に従ってのPhusion高忠実度DNAポリメラーゼを使用する標準的なPCR反応条件下で増幅した。クローニングに用いたプライマーは以前に記載されている9。全ての構築物を表1に示す。 <ol><li> CutA-NpuN（N、表1）を生成する。 <ol><li> PCRは、適切なプライマーを用いて、それぞれのプラスミドたpET30-CutA-TIP1 10とKanR-IntRBS-NpuNC-CFNの11からCutAとNpuN遺伝子を増幅。 </li><li>適当な制限酵素でこれらの断片を消化し ​​、順次、T7プロモーターおよびN（図2A）を生成するC-末端タグの間6xHistidineいるpET26Bベクターにこれらのフラグメントを挿入する。 </li></ol></li><li> NpuC-S-CutA（C、表1）を生成する。 <ol><li> PCRはNpuC、CutAとSフラグメンテーションを増幅適切なプライマーを用いて、それぞれプラスミドKanR-IntRBS-NpuNC-CFNの11、たpET30-CutA-TIP1 10とpQE9交流10 ATRP 12からT [AG 3（PEG）] 10。 </li><li>適当な制限酵素でこれらの断片を消化し ​​、順次、T7プロモーターおよびC（図2B）を生成するC-末端との間の6xHistidineいるpET26Bベクターにこれらのフラグメントを挿入する。 </li></ol></li><li> ：NpuC-S-SH3 LIG-CutA（C-SH3のLIG、 表1）を生成する<ol><li> PCRは、フラグメントのSH3 LIG-CutAを生成するのSH3 LIG（PPPALPPKRRR）と柔軟なリンカー（GGGGS）2を含むプライマーを使用してCutAを増幅する。 </li><li>フラグメントSH3 LIG-CutAとCからCutA遺伝子を交換してください。 </li></ol></li><li> SH3-GFP（ 表1）を生成する。 <ol><li>使用してプラスミドpJD757 13からSH3遺伝子を増幅適切なプライマー。 </li><li> GFP遺伝子にこの断片を融合し、T7プロモーター（ 図2C）およびC末端6xHistidineタグとの間にいるpET26Bベクターに挿入します。 </li></ol></li></ol> 2。タンパク質の発現<ol><li>適当な発現プラスミドで化学的にコンピ大腸菌 BL21（DE3）の50μlのを変換します。 </li><li>形質転換後、連続的にこれらの細胞を希釈し、ルリア - ベルターニ（LB）上にプレート/ 50μg/ mlのカナマイシンを含む寒天プレート。 </li><li> 〜15時間、37℃で形質転換された細胞を含むプレートをインキュベートする。 </li><li>インキュベーションの後、50〜100個のコロニーが含まれているプレートをピックアップし、LBブロス5mlに全てのコロニーを懸濁します。 </li><li>転送サスペンションカナマイシン（50μg/ mlの）を含む1LのLBブロスに、250rpmで振盪しながら37℃で細胞を増殖させる。 600ナノメートル（OD 600）での吸光度をモニターする。 OD 600〜0.8までの文化を育てる。 <ol><li> C及びC-SH3 LIGのために、培養（最終濃度1mM）にイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を加えることでタンパク質発現を誘導し、250rpmで振盪しながら4時間37℃で培養物をインキュベートする。 </li><li> NおよびSH3-GFPについては、約5分間、氷水浴中で培養フラスコを浸漬することにより培養物を〜18℃に冷却する。文化（1mMの最終濃度）にIPTGを添加することにより、タンパク質の発現を誘導し、250rpmで振とうしながら14〜18時間、18℃で培養液を、。 </li></ol></li><li>タンパク質発現の後、ペレットを収集するために、4℃で20分間、6,000×gで培養物を遠心分離する。使用するまで-80℃で保存した細胞ペレット。 </li></ol> 3。タンパク質精製<ol><li> Nの精製（変性条件） <ol><li>湿ったペレットを10ミリリットル/ gで、緩衝液A（ 表2）に再懸濁細胞ペレット。 </li><li> Immers氷水浴中でペレット懸濁液を電子と（1秒パルスおよび1分6秒の休止とアンプ10、）超音波処理により細胞を破壊する。 </li><li> 4℃で20分間16,000×gで溶解液を遠心分離</li><li>上清を捨てる。バッファDA（8 M尿素を含有する）及び遠心分離機で4℃で20分間16,000 xgで懸濁液中にペレットを再懸濁</li><li>以前にバッファDAで平衡化した5ミリリットルのNi-ニトリロ三酢酸（NTA）カラムに通して上清を渡します。 </li><li> 45 mMイミダゾールを補ったバッファーDAの30ミリリットルでカラムを洗浄します。 150 mMイミダゾールを補充した緩衝液20mlのDAを使用して精製したタンパク質を溶出させる。 </li><li> 3.1.7.1または3.1.7.2で与えられ、次のいずれかの方法により、&lt;1 mmのタンパク質試料中の尿素濃度を低下させる。 <ol><li> &lt;20 kDaのカットオフを有するチューブを用いて4℃で一晩DPBS緩衝液（ 表2）でタンパク質を透析する。 </li><li>遠心分離器は、30＆＃中のタンパク質を精製した160; 2,800 xgでkDaの限外濾過スピンカラム、4°Cにまで体積1 ml未満である。タンパク質試料を希釈するために列に14ミリリットルのDPBSバッファーを追加します。遠心分離/希釈は3回以上繰り返し繰り返します。 </li></ol></li><li>バッファー交換した後、精製したタンパク質（最終2mM）をにジチオスレイトール（DTT）を追加し、2800×gで30kDaの限外ろ過スピンカラム、4℃を通して遠心分離により〜100 mg / mlのにタンパク質を濃縮</li><li>使用するまで-80℃で濃縮されたタンパク質や店舗を分取。 </li></ol></li><li> CおよびC-SH3 LIGの精製（ネイティブ条件） <ol><li> 10ミリリットル/湿ったペレットのgで1Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを補充した緩衝液Bに再懸濁細胞ペレット（pH6.0）である（ 表2）。標的タンパク質のタンパク質分解を最小にするために、酸性緩衝液を使用する。 </li><li> 3.1.2に記載のように超音波処理により細胞懸濁液を破壊する。遠心分離機のLys4℃で20分間16,000×gで食べたし、上清を保持します。 </li><li>以前にバッファーBで平衡化した5mlのNi-NTAカラムを通して可溶性溶解を渡す</li><li>緩衝液Bで洗浄カラムは、45 mMイミダゾールを補充し、および150 mMイミダゾールを補充した緩衝液Bを20mlの標的タンパク質を溶出させる。 </li><li> Cの場合は、3.2.6に進みます。 C-SH3のLIGについては、3.2.5.3と3.2.5.1ステップで与えられている部分的に分解されたタンパク質を除去するために追加のイオン交換精製工程を行う<ol><li> 3.1.7で説明した手順に従って、&lt;1 mmのLIG C-SH3中のNaCl濃度を低下させる。 </li><li>予めリン酸ナトリウム緩衝液（50mM、pH7.0）で平衡化させた5mlの陰イオン交換ビーズアガロースマトリックスカラムに標的タンパク質をロードする。 </li><li>溶出液は、10mMトリス-HCl pH8.0のbuffeを含有する溶液の勾配を実行して、カラムからタンパク質を標的とする1 M NaClを補充した同じ緩衝液を含有する溶液にrであるドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）に基づいて、最高純度のタンパク質溶出プール試料中にサンプルを採取する。 </li></ol></li><li> 3.1.7に記載のように、DPBSバッファー中に精製されたタンパク質を緩衝液交換。 </li><li>精製されたタンパク質（最終濃度2 mM）をにDTTを追加し、3.1.8で説明したように〜100 mg / mlの30kDaの限外ろ過スピンカラムを使用してタンパク質を濃縮。分量とストアが使用するまで-80℃でタンパク質を濃縮した。 </li></ol></li><li> SH3-GFPの精製<ol><li> 10ミリリットル/湿ったペレットのgの緩衝液Aを使用して再懸濁細胞ペレット。 </li><li> 3.1.2で説明したように超音波処理によりペレットサスペンションを混乱させる。 </li><li>遠心4℃で20分間16,000 xgで溶解物および上清を回収する。 </li><li>以前で平衡化した5mlのNi-NTAカラムを通して上清（可溶性溶解）を渡す緩衝液A </li><li>緩衝液A 30mlで洗浄カラムは、45 mMイミダゾールを補った。緩衝液A 20mlの溶出を用いて精製したタンパク質を150 mMイミダゾールを補充した。 </li><li>緩衝液は、3.1.7で述べたものと同様のアプローチを用いてDPBS緩衝液中に精製されたタンパク質を交換し、〜150mgのタンパク質を濃縮/ mlの3.1.8に記載されるように30kDaの限外濾過スピンカラムを用いて。 </li><li>使用するまで-80℃で精製タンパク質をアリコートし、保存します。 </li></ol></li><li> CutAを含む精製サンプルのSDS-PAGE分析<ol><li> 〜1 mMのNaCl濃度を減少させるために二重蒸留水に各精製タンパク質を希釈する。このNaCl濃度で、CutA三量体タンパク質のほとんどは、SDS-PAGEゲル上で単量体として実行する。 </li><li> 95℃でインキュベートした2×SDSサンプル緩衝液（0.5 Mトリス - 塩酸、pH 6.8、20％グリセロール、10％/ vのSDS、0.1％w / vブロモフェノールブルー、2％β-メルカプトエタノールw）を有する試料を混合5分間。 </li><li> SAMを読み込む12％SDS-PAGEゲル上にples。 〜50分間、200Vの定電圧で電気泳動を行う。 </li><li>標準プロトコル（ 図1C）は、次のクマシーブリリアントブルーR250で染色することにより、ゲル中のタンパク質を観察します。 </li></ol></li></ol> 4。ヒドロゲル形成注：特に断りのない限り、本研究で作成したサンプルのヒドロゲルは、各ヒドロゲルビルディングブロックの1.6 mMのが含まれています。このタンパク質濃度は柔らかく、安定したヒドロゲルが得られる。注意：アジ化ナトリウム（NaN 3を ） は、細菌汚染を防ぐために、w / vの最終濃度0.5％にヒドロゲルに添加される。のNaN 3は、非常に毒性があり、化学物質等安全データシートに示されているように、細心の注意を払って取り扱わなければならない。 <ol><li> 100μlのサンプルヒドロゲル中に1.6 mMの最終濃度を達成するために必要な濃縮タンパク質のそれぞれについて体積を計算する。たとえば、次のように Nの濃度：100 mg / mlの Nの分子量：26.3 kDaの（ 表1を参照してください） 所望の体積：100μlの所望の濃度：1.6 mMの <img alt="" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" width="600" /></li><li> 100μlのハイドロゲル（1.6 mm）を作るために、C言語を混在させる（XμL、容量4.1に従って計算）5％のNaN 3（10μL）で、100のDTT（5μL）とN（YμL、音量に応じて算出4.1）2を10mlのガラスバイアルの内部。 </li><li>最終容量100μlを達成するために、バイアルに（Y）μL - - X（85）と、手動ピペットチップを使用して旋回運動を経由してすべてのコンポーネントを混在させるDPBSバッファーを追加します。注意：ソリューションは、混合時に非常に粘稠になる。 </li><li>気泡を除去するために8,000×gで2分間混合物を遠心分離する。 </li><li>室温で混合物をインキュベートインテイントランス -スプライシング反応が完了に到達させるために一晩温度。逆さにチューブを回して、ハイドロゲル形成を確認してください。ハイドロゲルが形成されるとタンパク質が流れない。 </li><li> 3.4（ 図1C）で説明したように、ステップ4.2の前にし、SDS-PAGEゲル上でステップ4.5の後に採取した試料（0.5μLずつ）チェックして、インテトランススプライシング収量を推定する。 </li></ol> 5。ドッキングタンパク質（DP）とドッキングステーションを経由して、GFPの固定化ペプチド（DSP）の相互作用<ol><li> 50μlのGFP-官能化ヒドロゲル（1.2 mm）を作るために1.7での1:1のモル比で、（4.1に従って計算、XμL）C-SH3のLIGを組み合わせて、SH3-GFP（YμL、4.1に従って計算） mlマイクロ遠心チューブ30分間室温で混合物をインキュベートする。 </li><li> X - - ​​&lt;5％のNaN 3（5μL）、100のDTT（2.5μL）、（42.5の追加同じチューブにEM&gt; Y）μlのDPBS。 N及びC-SH3 LIGの1:1モル比を達成するためにN（yの μlの4.1に従って計算）を添加する。旋回運動によりピペットチップを用いて試料を混合する。 </li><li> 2分間8,000×gで遠心分離し、混合物を暗所で室温で一晩混合物をインキュベートする。インキュベーション中にSH3-GFPフォームをカプセル化ヒドロゲル。 </li></ol> 6。有機溶媒中の酵素反応のための固定化の足場として1.6 mMのハイドロゲルの使用<ol><li>モデル酵素として、HRPを使用してください。 DPBS中のHRP（28 mg / mlのか、0.63ミリモル）のストック溶液を準備します。 </li><li> HRPを捕捉30μlのハイドロゲル（1.6 mm）を作るために、C内の HRP（2μL）、5％のNaN 3（3μL）およびDTT（100 mMと1.5μL）と（XμL、4.1に従って計算）を組み合わせ1.7ミリリットルの遠心管。 </li><li> N（Yを追加する&lt;/ em&gt;の4.1に従って計算μL、）とDPBS（23.5 - X - Y）μL。旋回運動をピペットチップで混ぜる。 </li><li> 2分間8,000×gで遠心分離し、混合物を室温で一晩インキュベートする。 注意：以下の活性アッセイに用いジェンツは非常に有毒である。対応する化学物質等安全データシートにより、特定の安全勧告を使用してください。 </li><li>酵素反応は、N、N-ジメチル-p-フェニレンジアミン（5.8 mM）を、n-ヘプタン14中のフェノール（5.8ミリモル）およびtert-ブチルヒドロペルオキシド（2.9ミリモル）を含有する反応カクテル1mlのヒドロゲルを沈める。手動ヒドロゲルおよび溶媒の接触面積を増加させるためにピペットチップを用いてゲルを破壊する。 </li><li>プレートリーダー（ 図5）で546 nmでの異なる時点で採取した試料の吸光度を測定することにより、HRP生成物、インドフェノール系色素を検出する。 </li> &lt;/ OL&gt;

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</ol>

競合する経済的利益は存在しません。

本研究では、安定性の高いインテイン媒介タンパク質ヒドロゲルの合成を示した。分割の使用は、条件付きインテインつの液相の成分の混合に対応して形成されるヒドロゲルを可能にする。具体的には、分割インテイン共有結合ターンでヒドロゲルに自己アセンブル単位を架橋することにより隣接されるポリペプチドユニットを得、 トランス -スプライシング反応を介して2つの液相のビルディングブロックを連結する。ヒドロゲルの混合により誘導される形成は、クロマトグラフィー精製カラムのゲル媒介詰まりが発生する可能性が単一成分のタンパク質ヒドロゲルの合成における技術的な問題をバイパスします。さらに、余分な化学誘導物質および/または物理的なトリガーを必要とせずに、生理学的条件下でヒドロゲルを形成する。 インテイン媒介ヒドロゲルは、酸性および塩基性の両方のバッファであり、生理学的な温度で高い安定性を保持します。ヒドロゲルはw iを形成することができるより良好な機械的安定性を有する番目は、それぞれの個々のビルディングブロックの0.8mMの（データは図示せず）のような小さな、より高いタンパク質濃度（〜1.6 m...

タンパク質の全く作らヒドロゲルは大幅に組織工学、薬物送達およびbiofabrication 1のように多様な分野を進める可能性を運ぶ。彼らは、生体適合性と非侵襲的に生体活性球状タンパク質の取り込みをサポートするための可能性を含め、従来の合成高分子ヒドロゲルを上回る利点を提供します。 本研究では、分割インテイン媒介タンパク質トランス-スプライシング反応およびタンパク質固定足場（ 図1）としてのその適用を介して形成された新規タンパク質、ヒドロゲルの開発を記載している。このヒドロゲルのためのビルディングブロックは、各々が（INおよびIC）を分割インテインおよび多量体タンパク質の架橋サブユニットのN-またはC-末端断片を含む二つのタンパク質のブロックコポリマーである。のDnaEはインテノストックパンクチ （NPU）から&lt;ホリコシパイロコッカスから2,3インテ分割し、小さなトリマータンパク質（12 kDa）のCutAとして使用された/全角&gt;は架橋タンパク質4,5として使用した。異なる架橋剤は高度に架橋されたタンパク質ネットワーク（ハイドロゲル）の形成を導く、インテイン触媒によるトランス - スプライシング反応を介して接合されている。 NPUのインテインは、その高速な反応速度（T 1/2 = 63秒）、高トランススプライシング利回り（近い80％） の2,3の選ばれた。 CutAタンパク質は、その高い安定性のために、架橋剤として選ばれた。 CutAトリマーは、近い150℃の変性温度を持っているし、できるだけ多くのM 5として塩酸グアニジン4,6を含む溶液中で三量体四次構造を保持する。異なる架橋剤間のサブユニット交換は、物理的なハイドロゲル表面侵食7の主要な原因であることから、CutA非常に強い間、サブユニットの相互作用は、より安定したヒドロゲルにつながるようなサブユニットの交換を阻止する必要があります。これらのビルディングブロックの一つは、水を容易にするために、中間ブロックとして親水性の高いS-ペプチド断片を含むリテンション8。 2ヒドロゲルのビルディングブロックの混合は、両末端に架橋剤と、より長いポリペプチド鎖を生成し、フラグメントインテインINとICの間のトランス-スプライシング反応を開始する。複数のそのような分子単位の架橋剤は、高度に架橋されたヒドロゲル網目構造（ 図1A）を形成し 、互いに相互作用する。特定の「ドッキングステーションペプチド」（DSP）「ドッキングタンパク質」（DP）の安定な固定化を容易にするために、ヒドロゲル構成要素の1つに組み込まれているタグ化標的タンパク質へのヒドロゲル。のみならず、ヒドロゲルアセンブリを媒介するインテイン分割の使用は、タンパク質、ヒドロゲル合成のための追加の柔軟性を提供するだけでなく、標的タンパク質前ヒドロゲル形成にロードされるように、全体ヒドロゲルを通して標的タンパク質の高密度で均一な充填を可能にする。 インテイン媒介タンパク質ハイドロゲルは非常に安定である室温で3ヶ月後のリトル·ツー·検出可能な浸食と、水溶液中のBLE。安定性のpH（6-10）および温度（4-50℃）の広い範囲内に保持し、ヒドロゲルはまた、有機溶媒と適合性である。緑色蛍光タンパク質（GFP）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）：このヒドロゲルは2つの球状タンパク質の固定化のために使用される。後者のタンパク質を捕捉するヒドロゲルを有機溶媒に生体触媒を実行するために使用される。

<table><tbody><tr><td> Phusion High Fidelity DNA ポリメラーゼ </td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td> </td></tr><tr><td> Competent Escherichia coli BL21 (DE3) </td><td>New England BioLabs</td><td>C2527I</td><td> </td></tr><tr><td> Luria Bertani </td><td>VWR</td><td>900003-350</p</td><td> > </td></tr><tr><td> Bacto Agar Media </td><td>VWR</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>カナマイシン硫酸塩</td><td>VWR</td><td></td><td> </td></tr><tr><td> IPTG </td><td>VWR</td><td>EM-5820</td><td> </td></tr><tr><td> イミダゾール </td><td>VWR</td><td>EM-5720</td><td> </td></tr><tr><td> 尿素</td><td>VWR</td><td>EM-9510</td><td> </td></tr><tr><td> ジチオスレイトール(DTT)</td>フィ<td>ッシャー</td><td>BP172-5</td><td> </td></tr><tr><td> プロテアーゼ阻害剤カクテル</td>ロ<td>シュ応用科学</td><td>11836153001</td><td> </td></tr><tr><td> DPBS </td><td>VWR</td><td>82020-066</td><td> </td></tr><tr><td> ブリリアントブルー R</td>ア<td>クロスオーガニックス</td><td>A0297990</td><td> </td></tr><tr><td> アジ化ナトリウム</td><td>フィッシャー</td><td>AC190380050</td><td> 注意、 毒性 </td></tr><tr><td> 西洋わさびペルオキシダーゼ </td><td>Sigma</td><td>P8125-5KU</td><td> </td></tr><tr><td>N,N-ジメチル-<>p-フェニレンジアミン</td><td>フィッシャー</td><td>AC408460250</td><td> 注意 高毒性 </td></tr><tr><td> フェノール</td>フィ<td>ッシャー</td><td>AC149340500</td><td>注意、毒性が高い </td></tr><tr><td>tert-ブチルヒドロペルオキシド</td><td>フィッシャー</td><td>AC180340050</td><td> 注意、毒性が高い </td></tr><tr><td> n-ヘプタン</td><td>アクロスオーガニックス</td><td>120340010</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td> Shaker/Incubator </td><td>Fisher Scientific</td><td>Max Q 6000</td><td> </td></tr><tr><td> Centrifuge </td><td>Sorvall</td><td>RC 6</td><td> </td></tr><tr><td> Sonicator </td><td>QSonica</td><td>Misonix 200</td><td> </td></tr><tr><td> 限外ろ過チューブ </td><td>アミコンウルトラ</td><td>UFC903024</td><td> </td></tr><tr><td> &nbsp;Ni Sepharose High Performance HisTrap カラム </td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5248-01</td><td> </td></tr><tr><td> HiTrap SP セファロースFFイオン交換カラム </td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5156-01</td><td> </td></tr><tr><td> Plate reader </td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax Gemini EM</td><td> </td></tr></tbody></table>

インテイン媒介人工タンパク質ヒドロゲルの合成

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

当社は、分割インテイン触媒によるタンパク質トランススプライシング反応によって媒介性の高い安定なタンパク質ヒドロゲルの合成を提示する。このヒドロゲルのビルディングブロックは、それぞれが分割インテインの架橋剤及び半分となる三量体タンパク質のサブユニットを含む二つのタンパク質のブロックコポリマーである。親水性の高いランダムコイルは、保水性ブロックコポリマーの1つに挿入される。 2タンパク質のブロックコポリマーの混合は両端に架橋剤とペプチドユニットを得インテイントランススプライシング反応をトリガするヒドロゲルに急速に自己集合。このヒドロゲルは、酸性および塩基性の両方の条件下で、50°Cまでの温度で、有機溶媒中で非常に安定である。せん断誘発の破裂後のヒドロゲルは、急速な改革。ヒドロゲルビルディングブロックに「ドッキングステーションペプチド」の組み込みは、「ドッキングタンパク「タグ化標的タンパク質の簡便な取り込みを可能にする。ヒドロゲルは、組織培養増殖培地と互換性のある20 kDaの分子の拡散をサポートし、生​​物活性球状タンパク質の固定化を可能にする。有機溶媒適合性、生体触媒としてインテイン媒介タンパク質ヒドロゲルの適用は、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素をカプセル化し、その活性を確証することによって実証された。

インテイン媒介タンパク質ヒドロゲルを形成するための模式図を図1Aに提示される。ヒドロゲルのビルディングブロックは、タンパク質がCutA-NpuN（N）およびNpuC-S-CutA（C）（ 図1A、表1）コポリマーである。 NpuN / Cノストックパンクチ（NPU）からインテ自然に分割のDnaEのN-/C-fragmentsです。 CutAはパイロコッカスホリコシ 4,5から安定した三量体タンパク質である。 （ 図1Aおよび1C）：連結産物（CutA-S-CutA J） -還元剤DTTの存在下で、精製されたNとCの混合は、第3のタンパク質の形成を誘導する。個別に、ヒドロゲルビルディングブロックNとCは、粘性流体（ 図1B）が存在する。 NとCの混合は、ヒドロゲル15,16（ 図1B）の形成を示す反転後ガラスバイアルの底に保持されている透明の半固体材料を得1</sup...

当社は、分割インテイン媒介タンパク質ヒドロゲルの合成を提示する。このヒドロゲルのビルディングブロックは、それぞれが分割インテインの架橋剤及び半分となる三量体タンパク質のサブユニットを含む二つのタンパク質の共重合体である。二つのタンパク質の共重合体の混合は、ヒドロゲルに自己組織化ペプチドユニットを得インテイントランススプライシング反応をトリガします。このヒドロゲルは、有機溶媒に対応して、高度なpHおよび温度安定性であり、簡単に機能的な球状タンパク質が組み込まれています。

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

本手順の全体的な目的は、タンパク質の固定化のための汎用的なスキャフォールドとして使用可能な、極めて安定したタンパク質ハイドロゲルを合成することである。これは、まず細菌ホスト内で2つのタンパク質ハイドロゲルビルディングブロックを合成することで達成される。各ビルディングブロックには、架橋剤として機能するキメラタンパク質のサブユニットと、NPUスプリットエンの一方が含まれている。次に、これらのタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーによって精製します。精製されたタンパク質ビルディングブロックを混合してトランススプライシング反応を開始させ、架橋剤で挟まれた自己組み立てポリペプチドを再構成し、ハイドロゲルの形成を誘発させます。タンパク質ブロックに適切な結合モチーフを組み込むことで、このハイドロゲルは溶液中で高い安定性を示します。共重合体を用いることで、機能性球状タンパク質をハイドロゲルの構成単位に部位特異的に簡便に組み込むことができ、その結果としてタンパク質を固定化したハイドロゲルが形成されます。固定化された球状タンパク質は、室温で3週間にわたり低い漏出率を示します。最終的に、このタンパク質ハイドロゲルに固定化された酵素は、有機溶媒による変性から保護されます。したがって、本ハイドロゲルは有機合成のためのバイオリアクターとしても利用可能です。表面の架橋、固体足場への固定、多孔質担体への酵素の封入、または酵素間の相互架橋を含む、既存の安定なタンパク質固定化法に対する本手法の主な利点は、タンパク質側鎖への化学的修飾を一切行うことなく、多孔質で高度に水和した環境に標的タンパク質を安定に固定化できる点にあります。また、この技術により、経路内の複数の酵素をあらかじめ決定した三次元的な配置でアセンブリすることが可能となり、酵素間の基質チャネリングを促進できる可能性があります。本手順を開始する前に、組換えDNA技術によるプラスミド構築を行い、それに続くタンパク質発現とE. coli BL21(DE3)を用いた精製により、2つのタンパク質ブロック共重合体NおよびCを作製してください。その後、ウェットペレット1 gあたり10 mLのバッファーAで細胞ペレットを再懸濁します。次に、ペレット懸濁液を氷水バスに浸し、10 amps、1秒間のパルスと6秒間の休止の間隔で1分間、超音波処理して細胞を破砕します。得られた溶解物を 6,000 ×g、4 °C で20分間遠心分離します。チューブを遠心機から取り出し、上清を廃棄した後、ペレットをバッファーDAで再懸濁させ、前回と同様の条件で遠心分離を行います。その後、低圧クロマトグラフィーシステムを用いて、あらかじめバッファーDAで平衡化した 5 mL NTA カラムに上清を通します。次に、45 mMのoleを添加したバッファーDA 30 mLでカラムを洗浄し、150 mMのoleを添加したバッファーDA 20 mLを用いて精製タンパク質を溶出させます。精製したタンパク質を、30 kDaの超濾過スピンカラムを入れた遠心チューブに移します。サンプルを2,800 ×g、4 °Cで、液量が1 mL未満になるまで遠心分離します。完了後、カラムに14 millilitersのDPBSバッファーを加えてタンパク質サンプルを希釈します。バッファー交換後、遠心分離と希釈のステップをさらに3回繰り返します。その後、精製タンパク質にDTTを加え、最終濃度を2 millimolarにします。次に、30 kilodaltonの超濾過スピンカラムを用い、4 degrees Celsiusで2,800 times Gにて約45分から1時間遠心分離を行い、タンパク質を約100 milligrams per milliliterまで濃縮します。100 µLのハイドロゲル混合液を調製するには、100 mg/mLのCストック溶液42 µL、5%アジ化ナトリウム10 µL、100 mM DTT 5 µL、および100 mg/mLのNストック溶液42 µLを混合します。2 mLのガラスバイアルに、最終容量を100 µLにするためDPBSバッファー1 µLを加え、ピペットチップを用いて旋回させるようにしてすべての成分を手動で混合します。混合液を8,000 ×gで2分間遠心分離した後、ENEトランススプライシング反応を完結させるために室温で一晩インキュベートします。その後、チューブを逆さまにしてハイドロゲルの形成を確認し、1.2 mM GFP機能化ハイドロゲルを50 µL調製します。100 mg/mLのCSH3リガンドを含むストック溶液17 µLと、230 mg/mLのSH3GFP溶液9 µLを1:1のモル比で1.7 mL遠心チューブに合わせ、室温で30分間インキュベートします。次に、同チューブに5%アジ化ナトリウム5 µL、100 mM DTT 2.5 µL、およびDPBS 0.5 µLを加えます。その後、Nを16 µL加え、NとCSH3リガンドが1:1のモル比になるようにし、ピペットチップを用いて旋回させるようにしてサンプルを混合します。混合物を8,000 ×gで2分間遠心分離します。完了後、混合物を室温の暗所で一晩インキュベートし、ハイドロゲルを形成させてSH 3G FPを封入します。別のアプリケーションとして、DPBSを用いて0.63 millimolarのホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）ストック溶液を調製します。1.7 milliliterの遠心チューブ内で、100 milligram per milliliterのCストック溶液12 microliters、HRP 2 microliters、5%アジ化ナトリウム3 microliters、および300 millimolar DTT 0.5 microlitersを混合し、1.6 millimolarのハイドロゲルおよびHRPトラップ溶液30 microlitersを作成します。ここに100 milligram per milliliterのN溶液12 microlitersとDPBS 0.5 microlitersを加え、IPEチップを用いて旋回させるようにして混合します。混合物を8,000 ×gで2分間遠心分離した後、室温で一晩インキュベートします。酵素反応させるために、n-ヘプタンに5.8 mMのN,N-ジメチル-p-フェニレンジアミン、5.8 mMのフェノール、および2.9 mMのtert-ブチルヒドロペルオキシドを含む反応カクテル1 mLを加え、そこにハイドロゲルを浸します。ピペットチップを用いてゲルを手動で分断し、ハイドロゲルと溶媒の接触表面積を増大させます。異なる時間で溶媒のサンプルを採取し、プレートリーダーを用いて546 nmにおける光学的吸光度を測定することで、HRP生成物およびインドフェノール系染料を検出します。還元剤であるDTTの存在下で精製したNとCを混合すると、3番目のタンパク質である結合生成物Jの形成が誘導されます。ハイドロゲルのビルディングブロックであるNおよびCは粘性流体として存在し、NとCを混合すると、ガラスバイアルを反転させても底に留まる透明な半固体材料が得られ、これはハイドロゲルの形成を示しています。このene介在性タンパク質ハイドロゲルは高い溶液安定性を示します。DPBSバッファー中、22 °Cで21日間経過後も、架橋されたハイドロゲルスキャフォールドの損失はほとんど認められません。DPBSバッファー中に放出されたタンパク質の総量が、ハイドロゲルからのスプライシングされたeneの理論量をわずかに上回ったことから、ハイドロゲル形成中のトランススプライシング反応の効率は約80%であることが高密度サイトメトリーにより明らかになりました。SDS-PAGEゲル分析の結果、ハイドロゲル周囲のバッファー中には、トランススプライシング産物がごく微量しか存在しないことが示されました。これにより、架橋ハイドロゲル足場が浸食によって失われることは最小限であることが確認されました。ハイドロゲル周囲のバッファーに存在する主なタンパク質は、スプライシングによって除去されたイントロンです。室温の水溶液に3か月以上浸漬させた未攪乱のハイドロゲルにおいて、浸食の視覚的な兆候は見られませんでした。このハイドロゲルは、37 °Cおよび酸性・塩基性両方の緩衝液においても高い安定性を示します。タンパク質の固定化を容易にするため、タンパク質とそのペプチドリガンドを用いて、目的のタンパク質をハイドロゲル足場内にドッキングさせました。我々は、目的タンパク質に融合させるドッキングタンパク質として、アダプタータンパク質CRK由来のSARホモロジー3ドメインであるSH3タンパク質を、またハイドロゲル足場に組み込むドッキングステーションペプチドとしてそのリガンドを選択しました。この相互作用ペアを選択した理由は、分子サイズが比較的小さく、親和性が高いためです。SH3リガンドをNPUCとcut Aの間に挿入し、CSH3リガンドを形成させました。S SH 3タンパク質をモデル標的球状タンパク質であるGFPのC末端に融合させました。プロトコルに記載された手順により、1.2 millimolarのトランススプライシング・ハイドロゲル骨格ビルディングブロックと1.2 millimolarのGFPを含むハイドロゲルが得られます。GFP含有ハイドロゲルは、GFPを含まないハイドロゲルと同様の安定性を示し、21日後の総タンパク質損失は約35%でした。DPBSバッファー中において、エロージョンバッファーに含まれるほとんどのタンパク質は10代（の時間単位）で切断されました。S SH3リガンドを含むハイドロゲルからのSH3GFPの浸出は約3週後に30%であり、ここに示すドッキングステーションペプチドを含むハイドロゲルのように、S SH3リガンドを欠くハイドロゲルからの浸出よりも有意に小さいことが分かりました。S SH3リガンドはGFP蛍光の大部分を保持しています。3週間後、SSH 3リガンドを欠いたハイドロゲルは実質的に非蛍光となります。本研究における固定化GFPの密度は、ハイドロゲルの約33モルパーセントです。複数のドッキングステーションペプチドをハイドロゲルのビルディングブロックに組み込むことで、より高い固定化密度を達成できる可能性があります。次に、有機溶媒中での生物触媒の保持能を実証するため、タンパク質ハイドロゲルにHRP酵素を組み込みました。酵素活性は、N,N-ジメチル-p-フェニレンジアミンとフェノールの、tert-ブチルヒドロペルオキシドによる酸化カップリングを経時的にモニタリングすることで測定しました。ハイドロゲルの水和環境が、結合した酵素を有機溶媒による変性作用から保護するという仮説を立てました。有機溶媒に浸した後、親水性・疎水性界面の面積を増やすため、HRP含有ハイドロゲルを手動で破砕して小さなクラスター状にしました。HRPを組み込んだハイドロゲルは、迅速な酸化反応を効果的に触媒し、比色生成物を生じさせました。生成物の蓄積は直線的な勾配に従っており、酵素の活性化がほとんど、あるいは全くないことを示しています。実験において、まずDPBSに溶解させ、その後に有機溶媒に添加したHRPは変換を触媒することができましたが、反応速度は大幅に低下しました。DPBSに溶解した酵素の変換率が低いのは、DPBSと有機溶媒の間の界面領域が小さく、基質および生成物の拡散速度が制限されるためと考えられます。親水性の高いs断片をハイドロゲルの主鎖に組み込むことで、水がハイドロゲル内部に効果的に保持され、有機溶媒がハイドロゲル内部へ浸入することが妨げられるため、ハイドロゲルは有機溶媒による変性作用に耐えることが可能になります。これらの結果は、ene反応を介したタンパク質ハイドロゲルが、有機溶媒中における酵素反応の効果的なスキャフォールドとなり得ることを示しています。この自己組織化ハイドロゲルの構造的柔軟性と高い安定性により、タンパク質の固定化だけでなく、バイオ燃料電池、注入型薬剤輸送キャリア、組織工学用スキャフォールドなどの他の用途への利用も可能となります。

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Bioengineering

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学ぶインテイン媒介による人工タンパク質ヒドロゲルの合成法。細菌宿主で2つのタンパク質ブロックを合成し、親和性クロマトグラフィーで精製後、混合して自己組織化ポリペプチドを形成する。高安定性のスカフォールドとしてタンパク質固定化に応用可能である。

インテイン媒介人工タンパク質ヒドロゲルの合成

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