生物物理学研究のための昆虫細胞からの効率的な生産と組換えマウスKindlin-3の精製

以下の実験の全体的な目的は、他の発現宿主では産生できないMiran Kinlin threeを、昆虫細胞培養を用いてミリグラム量で効率的に産生することである。これは、KINLIN three転移ベクターをエンジニアリングされたbao virusバックミッドとともにCOT transectingさせることで、KINLIN three遺伝子を搭載した組換えbao virusを作成することによって達成される。第2ステップとして、後続の手順に十分な量のビリオンを産生させるため、昆虫細胞内でウイルスを増幅させる。

次に、高速液体クロマトグラフィーによる精製を可能にするため、昆虫細胞に感染させて大量のKinlin threeタンパク質を産生させます。SDS-PAGE分析およびサイズ排除クロマトグラフィーに基づき、高純度で機能的なkinlin threeをミリグラム単位で産生できるという結果が得られました。バクテリアでのkinlin three発現などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、バキュロウイルス感染昆虫細胞発現により、組換えタンパク質の収量が10倍に増加することです。

本手順で用いるSf9細胞は、100 µg/mLのペニシリンおよび100 µg/mLのストレプトマイシンを添加したSF 902培地を用い、浮遊状態で培養・維持します。バキュロウイルスの作製には、細胞密度を5 × 10⁵〜1 × 10⁶ cells/mLの範囲になるまで培養してください。トランスフェクションに向けたSf9細胞の準備として、滅菌済みの6ウェル組織培養プレートの1ウェルあたり、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したSF 902培地2 mL中で約1 × 10⁶個の細胞を播種します。Sf9細胞をドラフト内で室温に約20分間放置し、プラスチック製ウェルの底面に接着させて単層を形成させます。組み換えバキュロウイルスの作製は、単層化したSf9培養細胞にプラスミドDNAとBMID DNAを共トランスフェクションすることで行います。

発現ベクターpapine neuron firm T threeは、マウスKINLIN three遺伝子firm T threeを保持しています。P 10 BAOウイルスプロモーターの制御下にあり、バックミッドとの組換えを可能にするために隣接するbaoウイルス配列を有し、後続の精製のためのC末端hiss sixタグをコードしています。各トランスフェクションにつき、1～2 µgの精製MFI T three、0.5 µgの精製B mid、および抗生物質を含まない100 µLのSF 902 SFMを混合します。これを溶液Aとします。別のチューブで、6 µLのcell effect in two reagentを、抗生物質を含まない100 µLのSF 902 SFMで希釈します。

多くのトランスフェクションを行う場合は、液量操作を減らすために、各トランスフェクション反応用のマスターミックスを作成できます。これが溶液Bとなります。溶液Aと溶液Bを、1回のトランスフェクションあたりそれぞれ約200 µLずつ混合し、室温で20分間インキュベートして脂質DNA複合体を形成させます。20分後、脂質DNA複合体を、1回のトランスフェクションあたり800 µLの抗生物質を含まないSF 902 SFMで希釈します。次に、SF9細胞の単層培地を慎重に吸引し、AB溶液と培地の混合液をSF9単層の上に慎重にピペッティングします。

細胞の乾燥を防ぐために加湿環境を整え、トランスフェクションした細胞を27 °Cの加湿インキュベーターで一晩インキュベートします。6ウェルディッシュを、湿らせたペーパータオルと共に蓋付きのプラスチック容器に入れます。翌日、各モノレイヤー培養に抗生物質を含まないSF 900 to SFMをさらに1 mL添加し、細胞を27 °Cでさらに5日間インキュベートします。

5日後、組換えbaoウイルスを培養液から直接回収し、清潔な遠心チューブに移します。1000 Gsで5分間の遠心分離を行い、SF nine細胞の残渣を除去して清澄化します。室温で、得られた上清（P1と表記）に含まれるウイルスを清潔なチューブに移します。P1ウイルスの世代の予想ウイルス力価は1×10⁷ PFU/mLであると想定されます。

必要に応じてプラークアッセイを行うことは可能ですが、P1ウイルスストックは使用まで4°Cの暗所で保存してください。組換えバキュロウイルス増幅に使用するSf9細胞は浮遊状態で、密度を1.4×10⁶ cells/mLとし、培養液量がフラスコ全容量の20分の1になるようにします。例えば、2Lフラスコであれば50mLです。一般的に、バキュロウイルスの最適な増幅およびタンパク質生産のためには、Sf9細胞が均一な大きさで球形である必要があります。

以下の計算式を用いて、感染多重度（MOI）0.1でP1ウイルスストックをSf9細胞培養物に感染させます。P1を感染させた昆虫細胞培養物を、27°Cで100 RPMの振盪条件下で72時間インキュベートします。3日後、1000 ×gで5分間遠心分離して培地から細胞を分離し、ウイルスを回収します。

室温で、清澄化したウイルス濃縮培地を清潔なチューブに移します。このウイルスストックをP2と称し、予想されるウイルス力価は2×10⁸ PFU/mLです。このウイルスストックは使用時まで4°Cの暗所で保存し、得られた細胞ペレットは組換えウイルスの産生を後で確認するため、-20°Cで保存してください。

この手順を開始するには、SF9細胞をSF-902 serum-free mediumを用いて懸濁培養し、十分な量まで増殖させます。培地には100 µg/mLのペニシリンと100 µg/mLのストレプトマイシンを添加してください。総培養液量とフラスコ容量の比率は1:5とする必要があります。

懸濁培養液を27 °Cで100 RPMで振盪しながら、細胞密度が2 × 10⁶ cells/mLに達するまでインキュベートします。Sf9培養液の密度が2 × 10⁶ cells/mLになると、baculovirus感染させる準備が整ったことになります。培養液に最終濃度1%となるよう胎児牛血清を添加し、続いてP2ウイルスストックを添加します。

MOIを1にするため、感染させた培養物を27°Cで100 RPMで振盪しながらインキュベートし、感染から72時間後に、リコンビナントpoly histidineタグ付きlin-3を発現させたSF9細胞を室温で1000 ×gで20分間遠心分離して回収します。得られた細胞ペレットは、使用時まで-20°Cで、または長期保存の場合は-80°Cで保存してください。本手順は、氷上での融解から開始します。

組換えkinlin 3を発現し、vaoウイルスに感染させたSF nineの凍結ペレットを溶解バッファーで懸濁させます。再懸濁した細胞を溶解バッファーとともに5～10分間インキュベートした後、さらに細胞を破砕するため、均一な懸濁液になるまでボルテックスします。サンプルを氷上で超音波処理します。

4°Cで48,000 GSにて1時間遠心分離し、ライセートを清澄化します。得られた上清を、4°Cでライシスバッファーで平衡化した5 mL容量のHisTrapカラムに、1 mL/minの速度でロードします。その後のタンパク質溶出、バッファー交換、およびタンパク質濃縮の手順についてはここでは示しませんが、付属の論文に詳細が記載されています。

バッファー交換後のタンパク質溶液が得られたら、ACTA FPLCを用い、あらかじめ平衡化した5 mL容量のHiTrap Heparin HPカラムに0.5 mL/minの流速で適用します。結合したKINLIN 3は、同一バッファー中の塩化ナトリウム線形勾配（10 mM/mLの速度で増加）を用いて溶出させます。KINLIN 3は約0.6 Mの塩化ナトリウムで溶出することが予想されます。タンパク質を濃縮した後、最終ステップとしてサイズ排除クロマトグラフィーを用いてタンパク質のバッファー交換を行います。精製したタンパク質をSuperdex 200 10/300 GLカラムに適用し、0.5 mL/minの流速でバッファーを流してタンパク質をサイズに基づいて精製します。

カラムから溶出されたタンパク質を分画し、280 nmでの吸光度を用いてモニタリングします。組換えウイルスの作製成功は、SDS-PAGEおよびウェスタンブロット解析により、COT TRANSFECTED Sf9細胞における組換えKinlin 3の存在を確認することで検証しました。これは、抗His6抗体を用いた6つの小規模Sf9培養の代表的なウェスタンブロットの結果に示されています。ウイルスを増幅させ、大規模実験でSf9細胞に感染させた後、各サンプルにおいて75 kDaのHisタグ付きタンパク質に対応する明瞭なバンドが確認されました。組換えKinlin 3は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって部分的に精製されました。

この図のメインのゲル画像は、BAOウイルス感染SF nine細胞で発現させ、ニッケルアフィニティ精製した組換えマウスkinlin threeのSDS-PAGEを示しています。吸着タンパク質は、ゲル画像の上に示されているエルエーション勾配を用いて溶出されました。MWは分子量マーカーを、LYSは全細胞溶解物を、FTはフロースルーを、WIは洗浄1を、WIIは洗浄2を示しています。また、組換えタンパク質上のエンジニアードHisタグの存在を確認するため、溶出画分を用いてウェスタンブロット解析も行いました。

次に、部分精製されたKINLIN threeを、ヘパリンカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、ほぼ均一な状態までさらに精製しました。このパネルは、280 nanometersで観察された溶出プロファイルを青色で示しており、0.05 molarから1.0 molarの塩化ナトリウム濃度範囲の線形塩化ナトリウム勾配（緑色で表示）の下で、単一の対称的なピークが溶出していることがわかります。下のパネルは、分画された溶出液のSDS page分析の結果を示しており、75 kilodaltonのタンパク質であるKinlin threeの存在が証明されています。

最終ステップとして、凝集物を除去し均一性を達成するために、サイズ排除クロマトグラフィーを用いてKINLIN threeの純度を精製しました。この代表的なゲルろ過溶出プロファイルは、Tris HCl pH 7.5、150 mM NaCl、1 mM DTTを含む緩衝液を用い、20 °CでSuperdex 200を用いて精製したKinlin threeのものです。溶出体積に基づくと、KINLIN threeは75 kDaのタンパク質として期待通りに移動しており、主に単量体として存在していることが示唆されます。

次の図は、14.5 mg/mLに高濃度精製したリコンビナントKinlin-3（K3と表記）のSDS-PAGEの結果を示しています。昆虫細胞培養を用いて、高純度でフルレングスのマウスKinlin-3をミリグラム単位で調製することが可能になったため、このタンパク質の詳細な構造研究および生化学的解析が進められます。また、本研究ではThermofluorを用いたサーモシフトアッセイを実施し、Kinlin-3を安定化させる緩衝液を検討しました。

KINLIN threeを、pHと塩化ナトリウム濃度の2次元スクリーニングを含むさまざまな緩衝液で希釈しました。上段のパネルは転移温度の3Dヒストグラムであり、下段のパネルは算出された平均値である50.4 °Cからの転移温度の変化を示しています。バーは、それぞれが対応する温度範囲に応じて色分けされています。

KINLIN threeは、PA 7.0～9.0の範囲において、高濃度の塩化ナトリウム存在下でも安定しており、転移温度は55 °Cで一定であることが観察されました。また、塩化ナトリウム濃度に関わらず、PA 7.0～7.5の範囲において、Kinlin threeの転移温度は約55 °Cであることも観察されました。

このビデオを視聴することで、高度に精製された機能的なリコンビナントkindlingを調製する方法について十分に理解できるはずです。これらは、詳細な生物物理学的特性評価およびさらなる研究に利用されます。同様の手法を調製が困難な他のタンパク質試料にも適用することができ、そのようなケースでの活用を推奨します。