生物物理学研究のための昆虫細胞からの効率的な生産と組換えマウスKindlin-3の精製

以下の実験の全体的な目標は、他の発現宿主では生産できないミリグラム量のMiran Kinlin 3および昆虫細胞培養を効率的に生産することです。これは、KINLIN three遺伝子を運ぶ組換えバオウイルスを作成するために、KINLIN threeトランスファーベクターと改変されたbaoウイルスをバックミッドに組み合わせたCOTトランセクティングによって達成されます。第2のステップとして、ウイルスは昆虫細胞内で増幅され、将来のステップに十分な量のビリオンが生成されます。

次に、昆虫細胞を感染させてキンリン3タンパク質を大量に生成し、高速液体クロマトグラフィーによる精製を可能にします。SDSページ分析とサイズ排除クロマトグラフィーに基づき、高純度の機能性キンリン3をミリグラム単位で製造できることを示す結果が得られました。この手法は、細菌の3つの発現をキンドリングするなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、黄斑ウイルスに感染した昆虫細胞の発現により、組換えタンパク質の収量が10倍に増加することです。

この手順のためのSF nine細胞は、100マイクログラム/ミリリットルのペニシリンおよび100マイクログラム/ミリリットルのストレプトマイシンを添加したSF 902培地を使用して培養し、懸濁液で維持する。バオウイルス作製のためには、細胞を1ミリリットルあたり6細胞の5倍10〜5倍〜10倍の範囲の密度範囲で培養する必要があります。トランスフェクション用のSFナイン細胞を調製するためには、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したSF902培地の2ミリリットルの無菌6ウェル組織培養プレートのウェルあたり10個から6個の細胞を約1回見、SFナイン細胞をヒュームフード内で室温で約20分間放置し、プラスチックウェルの基部に付着して単層組換えバロウイルスの生成を形成するプラスミド、DNAおよびBMid DNAを単層SF9培養物に転写するコットによる。

発現ベクターパパインニューロン会社T3は、マウスKINLIN3遺伝子会社T3を持っています。P 10 BAOのウイルスのプロモーターの制御の下では背部中央との組換えを可能にする隣接するbaoのウイルス配列を所有し、各トランスフェクションのための下流の浄化のためのC末端のヒス6の札をコードし、精製されたMFI Tの1つから2マイクログラムを、精製されたBの中間の0.5マイクログラムおよび抗生物質なしでSF 902 SFMの100マイクロリットルと3つを作る。これは別のチューブ内の溶液Aであり、抗生物質を含まない100マイクロリットルのSF 902 SFMで2つの試薬で6マイクロリットルの細胞効果を希釈します。

各トランスフェクション反応について、ここでマスターミックスを作成し、多くのトランスフェクションが必要な場合に液体の取り扱いを減らすことができます。トランスフェクションごとにそれぞれ約200マイクロリットルを使用して2つの溶液AとBを混合し、室温で20分間インキュベートして20分後に脂質DNA複合体を形成し、抗生物質を使用せずにSF 902 SFMのトランスフェクションごとに脂質DNA複合体を800マイクロリットルで希釈します。次に、SF nine細胞単層培地を慎重に吸引し、SF nine単層の上にAB溶液と培地混合物を慎重にピペットで移します。

トランスフェクションした細胞を加湿インキュベーターで摂氏27度で一晩インキュベートし、細胞の乾燥を防ぐための加湿環境を作り出します。6ウェルディッシュをプラスチック製のリット容器に入れ、湿らせたペーパータオルと一緒に入れます。翌日、抗生物質なしでSFMにSF900の1ミリリットルを追加します各単層培養に、さらに5日間摂氏27度で細胞をインキュベートします。

5日後、組換えバオウイルスを培地から直接回収し、清潔な遠心チューブに移します。SF 9細胞の破片を1000 Gで5分間遠心分離することにより、透明化します。室温でウイルスを移すと、これは得られたスーパー名で、P oneとして示され、きれいなチューブP 1ウイルス生成は、1ミリリットル当たり10〜7PFUの1倍の期待ウイルス力価を有すると想定することができる。

プラークSAは、必要に応じて行うことができますが、懸濁液中の組換えバロウイルスの増幅に使用されるSF9細胞を使用するまで、暗所で摂氏4度でP 1ウイルスストックを保管し、1ミリリットルあたり6細胞の10倍の密度で、培養物は総フラスコ容量の20分の1を占める必要があります。たとえば、2リットルのフラスコに50ミリリットルを入れます。一般に、最適なvaoウイルスの増幅とタンパク質産生のためには、SFナイン細胞のサイズが均一で球形である必要があります。

以下の式を用いて、SF nine細胞培養物にP oneウイルスストックを感染の多重度またはMOI0.1で感染させます。P oneに感染した昆虫培養物を摂氏27度でインキュベートし、100 RPMで72時間振とうします。3日後、1000Gで5分間遠心分離することにより、培地から細胞を分離することにより、ウイルスを回収します。

室温での移漬では、清澄化されたウイルスは培地をきれいなチューブに濃縮しました。このウイルスストックはP 2と表され、予想されるウイルス力価は1ミリリットルあたり10の8PFUの2倍です。このウイルスストックは、使用するまで暗所で摂氏4度で保存し、得られた細胞ペレットを負摂氏20度で保存して、後で組換えウイルスの産生を確認します。

この手順を開始するには、懸濁液およびSF 902 s fmで十分な量のSF nine細胞培養物を増殖させ、100マイクログラム/ミリリットルのペニシリンおよび100マイクログラム/ミリリットルのストレプトマイシンを添加する。フラスコの総培養量に対する総培養量の比率は1対5である必要があります。

懸濁液培養物を摂氏27度でインキュベートし、100RPMで振とうしながら、細胞密度が10の2倍から10倍/ミリリットルあたり6細胞に達するまでインキュベートします。SF 9の培養物が1ミリリットルあたり6細胞の10の2倍の密度になると、バロウイルス感染の準備ができています。最終濃度の1%のウシ胎児血清で培養物を補い、続いてP 2ウイルスストックを添加します。

感染後72時間で100RPMで振とうしながら27°Cで感染した培養物をインキュベートし、1000GSで室温で20分間遠心分離することにより、感染した培養物を摂氏27度でインキュベートし、組換えポリヒスタミンタグを採取します。得られた細胞ペレットは、使用するまではマイナス20°Cで、長期保存する場合はマイナス80°Cで保存してください。この手順は、氷上での解凍から始まります。

vaoウイルスの凍結ペレットは、組換えキンリン3を発現するSFナインに感染し、レサスはペレットを溶解緩衝液で懸濁した。再懸濁した細胞を溶解バッファーで5〜10分間インキュベートした後、均一な再懸濁液が得られるまでボルテックスし、さらなる細胞破壊を行います。サンプルを氷浴で超音波処理します。

48, 000 GSで4°Cで1時間遠心分離することにより、ライセートを清澄化します。得られたスーパーネームを、摂氏 4 度の溶解バッファーで 1 分あたり 1 ミリリットルの速度で事前に平衡化した 5 ミリリットルの容量のヒストトラップカラムにロードします。タンパク質溶出バッファー交換およびタンパク質濃度のその後のステップについては、ここでは説明しませんが、添付の原稿で詳しく説明します。

バッファー交換タンパク質溶液が得られたら、ACTA FPLCを使用して、0.5ミリリットル/分の速度で、事前に平衡化した5ミリリットルの容量の高トラップヘパリンHPカラムに適用します。結合したKINLIN 3は、ヒスタミンタグの組換えタグ1ミリリットルあたり10ミリモルの割合で増加する同じ緩衝液中の線形塩化ナトリウム勾配を用いて言及されている。KINLIN 3は、タンパク質を濃縮した後、約0.6モルの塩化ナトリウムで溶出することが予想されますが、最終ステップは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用してタンパク質をバッファー交換し、精製したタンパク質をSUEx S 210 30カラムに適用し、0.5ミリリットル/分の速度でカラムにバッファーを適用することにより、サイズに応じてタンパク質を精製することです。

カラムから言及されるタンパク質は、吸収剤を使用して280ナノメートルで分画およびモニターされます。組換えウイルス生成の成功は、SDSページおよびウェスタン解析により、組換えキンリン3およびCOTトランスフェクトSFナイン細胞の存在を評価することにより、抗ヒス6抗体を用いた6つの小規模SFナイン培養物のこの代表的な西洋血液に見られるように、ウイルスが増幅され感染に使用された後、各サンプルにおいて75キロダルトンのヒスタグ付きタンパク質に対応する明確なバンドが見られたことを確認できた大規模実験におけるSFナインセル。組換えKINLIN threeを固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより一部精製した。

この図のメインゲル画像は、BAOウイルスに感染したSF9細胞に発現したタンパク質を吸収したタンパク質を吸収した9つの細胞を、ゲル画像の上に示したole勾配を用いて、ニッケル親和性精製リコンビナントマウスキンリンのSDSページを示したものである。MWは分子量マーカーを示し、LYSは全細胞ライセート、FTはWIを流れる流れ、WIはウォッシュ1、WIIはウォッシュ2です。ウェスタンブロット分析も、溶出画分を使用して行い、組換えタンパク質上の操作された彼のタグの存在を確認しました。

次に、部分的に精製したKINLIN threeを、ヘパリンカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、さらにほぼ均一に精製した。このパネルは、280ナノメートルで観察されたelucianプロファイルを青色で示し、0.05モルから1.0モルの塩化ナトリウム濃度範囲を使用して、緑色で示された線形塩化ナトリウム勾配の下で回避する単一の対称的なピークを示しています。下のパネルは、75キロダルトンのタンパク質Kinlin threeの存在を示す分画溶出のSDSページ分析の結果を示しています。

最終ステップとして、KINLIN 3純度をサイズ排除クロマトグラフィーで研磨し、凝集体を除去して均質性を達成しました。この代表的なゲルろ過elucianプロファイルは、トリスHCL pH 7.5 150ミリモル塩化ナトリウムと20°Cで1ミリモルDTTのSUEx S 200を使用して精製されたキンリン3です。溶出量に基づくと、KINLIN 3は75キロダルトンのタンパク質に対して予想通りに移動し、主にモノマーであることが示唆されます。

次の図は、14.5ミリグラム/ミリリットルでK3と標識された高濃度の精製組換えキンリン3のSDSページからの結果を示しています。ミリグラム量の高純度全長マウスキンリン3および昆虫細胞培養の生産により、タンパク質の広範な構造研究と生化学的分析が可能になります。この研究では、どのバッファーがKINLIN threeを安定させているかを決定するために、サーモフロアベースのサーモシフトアッセイも実施されました。

KINLIN 3は、pHと塩化ナトリウム濃度の2次元スクリーニングを含むさまざまなバッファーに希釈されました。上のパネルは転移温度の3Dヒストグラムで、下のパネルは計算された平均摂氏50.4度からの転移温度の変化を示しています。バーは、対応する温度の範囲に応じて色分けされます。

KINLIN 3は、PA範囲7.0〜9.0の高塩化ナトリウム濃度で安定し、遷移温度は摂氏55度で安定であることが観察されました。また、Kinlin 3の転移温度は、PAの7.0から7.5の範囲内で約55°Cであることが観測されました。塩化ナトリウム濃度に関係なく。

このビデオを見れば、高純度の機能性組換えキンドリングの作り方をよく理解できるはずです。3つは、詳細な生物物理学的特性評価とさらなる調査のためのものです。同様のアプローチは、調製が困難な他のタンパク質サンプルにも使用でき、そのような場合にはその適用をお勧めします。