HIV-1感染CD4の生得センシングを評価 +使用して形質細胞様樹状細胞によるT細胞エクスビボ共培養系。

次の手順の全体的な目標は、形質細胞様樹状細胞、またはPDCによるHIV V1、感染CD4陽性T細胞の自然センシングを評価することです。これは、まずCDの4つの陽性T細胞をH HIV V細胞に感染させることによって達成されます。第2ステップでは、感染したT細胞をPDCと共培養します。

18〜22時間後、共培養物から上清を回収し、PDCタイプ1インターフェロン産生を定量化します。最終的に、1型インターフェロンの産生は、ヒトの血液の感受性を評価するために使用でき、CD4陽性のT細胞H HIV 1感染に対するPDCを単離します。この方法は、形質細胞様溶解細胞によるHIV1感染CD4T細胞の認識など、病原体の認識における初期の自然免疫応答を支配するウイルスおよび宿主因子の研究に役立つ可能性があります。

これらのプロトコルがタイプ1のインターフェロンを測定することを目的としているが、それらは容易に干渉ガンマ、TNFアルファ、または一次CDの感染のために感染したT細胞の認識時にPCによって放出される他の生理活性分子を検出するために変更することができます 一次CDの4つの陽性T細胞は、ヒト末梢血を活性化することから始まり、分離されたCDの4つの陽性T細胞をPHALで48時間。細胞を完全な培地に保持し、感染前の少なくとも3日間、組換えIL 2を補充します。次に、バイオセーフティレベル3の実験室で、感染の2日後に、さまざまな感染の多様性を使用してT細胞をHIV Oneウイルスに感染させます。

細胞培養物のGFP、BST 2、およびCD 4の発現を評価します。バイオセーフティレベル2の施設での共培養実験には、GFP陽性率が20〜50%の培養物のみを使用してください。次に、採血から30分以内に密度勾配遠心分離により、ヒト末梢血サンプルから単核細胞を単離します。

次に、適切な抗体で細胞を染色し、目的の細胞系譜が生理学的比率で単離されたことを確認します。細胞を冷たく保つために迅速に働きます。PDCネガティブセレクションキットを使用して、メーカーの推奨に従って分離PBMC内のPDCを濃縮します。

次に、インフルエンザサイトメトリーにより、I LT 7やBDCA 2などのPDC特異的表面マーカーの濃縮度と相対量を確認します。濃縮されたサンプルは、少なくとも40%PDCsを含有すべきであり、現在、96ウェルU底板内のウェル当たり30マイクロリットルの感染T細胞とセンシング細胞の220マイクロリットルを共培養するセンシング細胞または標的細胞のみを含むコントロールウェルを含み、これらのウェルを完全な培地で250マイクロリットルの最終容量に調整する。既知のToll様受容体アゴニストに対するPDC応答を評価するには、TLR 7またはTLR 9アゴニストを適切なウェルに添加し、プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で18〜22時間インキュベートします。

共培養の終了時に、細胞を96ウェルVボトムプレートに移し、プレートを400Gおよび室温で5分間遠心分離します。次に、上清を96ウェルの平らな底板に移します。Resusは、細胞ペレットを2%パラフォームアルデヒドに懸濁し、サイズと粒状化を使用してフローサイトメトリーで分析し、前方散布図とサイド散布図で細胞を区別します。

hcblインターフェロンアルファベータレポーター細胞を使用して生理活性タイプ1インターフェロンを測定するには、最初にレポーター細胞を96ウェルの平底プレートにウェルあたり50,000細胞の密度でプレートし、最終容積は180マイクロリットルにします。次に、収穫したばかりの共培養上清20マイクロリットルを各ウェルに二重に添加し、内部標準コントロールのセットを含め、プレートを摂氏37度および5%二酸化炭素で18〜22時間インキュベートして、レポーター細胞から放出されるアルカリホスファターゼのレベルを180マイクロリットルの量子青色溶液で新しい平底プレートの各ウェルに決定します。次に、誘導されたHEC PLUインターフェロンアルファベータ細胞の上清を20マイクロリットルを各ウェルに加え、標準的なインターフェロンコントロールウェルで色が発達するまでプレートを摂氏37度でインキュベー

クォンタムブルー溶液は、酵素の存在下でピンクからパープルブルーに変化します。最後に、分光光度計を使用して、620〜655ナノメートルで分泌されるアルカリホスファターゼのレベルを評価し、インターフェロン標準曲線の線形部分からの外挿によりタイプ1インターフェロンの濃度を決定します。初代細胞の可変性により、これらの代表的なドットプロットに示すように、CD 14陽性骨髄系細胞とCD 3陽性T細胞の正常な比率が観察されることが重要です。

さらに、新たに単離されたPBMC培養物では、それらの高い前方散乱およびCD 3レベルによって同定される活性化T細胞の数が少ないのみが望ましい。最も重要なのは、PDCの相対的な割合を決定する必要がありますが、この割合は0.2〜1.2%の範囲で変動する可能性がありますこの範囲の両極端では、異常なセンシング表現型も観察されます。ネガティブセレクションを使用してPDCを濃縮すると、多くの場合、異なるドナーからのこれら2つの代表的なドットプロットに見られるように、50〜95%のPDC純度が得られます。

実験全体のプロトタイプの例を次のいくつかの図に示します。この代表的な研究では。MTの4細胞をPおよびl 4.3 GFP、IRIS NF野生型、またはデルタVPUに感染させ、共培養時に30%の感染を達成した。

前述のように、野生型ウイルスによる感染のみが、表面のBST 2の大幅なダウンレギュレーションをもたらしました。それらのサイズおよび粒度の差により、MT 4細胞は、既知のTLR 7またはTLR 9アゴニストの存在下でのpbmcのみの共培養後、またはHIV 1感染細胞と接触したpbmcがかなりの量の1型インターフェロンを放出した後、フローサイトメトリーによってp BMCsと容易に区別することができる。ここで提示した例では、模擬感染したMT細胞または感染したMT4細胞単独のPbmc共培養では、pbmc単独ではインターフェロンが検出されなかったが、pbmcによるHIV1感染MT4細胞の自然感知は、VPUの存在下で有意に減少することがわかった。

この手順を試みるときは、すべての汚染源を防ぐことを覚えておくことが重要です。常にエンドトキシンフリーの溶液を使用してください。マイコプラズマの汚染がないか定期的にチェックし、制御された細菌感染でさえPBMによって感知されるため、抗生物質を使用せずに細胞を培養することを忘れないでください。

PCは非常に壊れやすい細胞であることを忘れないでください。寿命は限られており、手順がタイムリーに行われないと、応答性に影響を与える可能性があります。