抗核抗体のHE​​p-2細胞を用いたスクリーニング

次の実験の全体的な目標は、間接免疫蛍光アッセイを使用して抗核抗体をスクリーニングすることです。これは、患者血清をhep 2基質スライドでインキュベートすることによって達成されます。非結合の患者血清を洗い流し、結合した自己抗体を特異的フルオレセイン標識コンジュゲートとインキュベートし、非結合試薬を洗い流します。

蛍光顕微鏡で見ると、自己抗体陽性サンプルは、抗原が存在することを示す蛍光パターンで自己抗体が結合した細胞または核の領域に対応するリンゴ緑色の蛍光を示します。最終的に、アルナの存在は結合組織疾患の診断を助けるために使用することができます。間接免疫蛍光法が固相エリザなどの他の方法よりも優れている点は、Hep 2細胞基質に100種類以上の抗原が天然の形態で発現していることです。

これにより、臨床的に重要なほぼすべてのO抗体を同定することができますが、間接免疫蛍光法は非常に特殊な技術であるため、ソリッドフェイス法では不可能です。この方法に不慣れな個人は、スライド処理の手順に習熟するために時間と練習が必要です。顕微鏡の画像を解釈し、関連するパターンを特定することを学ぶことも、習得するのに時間がかかるスキルです。

適切な試薬とツールを使用すれば、結果の一貫性が増し、解釈が容易になります。この手順を実演するのは、免疫蛍光Asay開発研究所の技術者であるCassandra Bryantです。試薬をパッケージから取り出し、各アイテムを室温に戻して、試薬を準備し、方向に応じて患者血清を希釈します インサートスライドはバーコード化されており、自動化システムに簡単に組み込むことができます。

この手順では、手動スライド処理について説明します。ただし、ハイスループットラボでは、バーコードスキャン機能を備えた自動スライド処理装置を選択する場合があります。Inovaの機器は、ワークフローの結果とレポートを制御できる一元化されたインテリジェントネットワークを介して接続されています。

IFAの場合。これにより、処理による患者の確実な識別と、転記および関連するエラーの排除が実現します。ポジティブコントロール1滴とネガティブコントロール1滴を適切なスライドに分注します。

ウェルズピペットで20〜25マイクロリットルの希釈された患者血清を残りのウェルに。一度に 1 つのスライドを処理します。スライドを湿らせたペーパータオルを底に付けた染色容器に入れ、容器を覆い、スライドを30分間インキュベートします。

湿度の高い状態では、基材が乾燥するのを防ぎ、人工的な染色につながる可能性があります。このインキュベーション期間中、患者の血清中の抗核抗体は、各ウェルに固定された細胞の抗原に結合します。インキュベーション期間後、基質の損傷を避けるために、洗浄バッファーの穏やかな流れを使用して血清を洗い流します。.

スライドを少し傾けて、ストリームが基板に直接向けられないようにします。スライドのこの向きは、ウェル間のサンプルのクロスオーバーを防ぐのにも役立ちます。余分な洗浄バッファーを軽くたたき、スライドを洗浄バッファーの入ったコープランドジャーに入れます。

洗浄ステップのインキュベーション時間は約5分です。スライドを洗浄バッファーから取り出し、軽くたたいます。余分な洗浄バッファーを除去するには、各ウェルに蛍光コンジュゲートを1滴塗布します。

NA試験では、IgG FC特異的コンジュゲートの使用が推奨されます。加湿容器でスライドを30分間インキュベートし、必ず染色カバーを交換してください。コンジュゲートは感光性があり、カバーはスライドを光の露出から保護します。

このインキュベーション期間中、コンジュゲートは、細胞抗原に結合した患者の抗核抗体に結合します。このコンジュゲート結合により、インキュベーション後のウェル内に蛍光が存在します。スライドをウォッシュバッファーで洗浄します。

前回と同様に、ペーパータオルの上にカバースリップを置き、カバースリップの下端に連続した線で封入剤を塗布します。各スライドを洗浄バッファーから取り出し、スライドを軽くたたきます。余分な洗浄バッファーを取り除くには、スライドの下端をカバースリップの端に接触させます。

カバースリップ上の封入剤が気泡カバーが滑ることなくスライドの上端に流れるように、最適な封入剤の量を含め、カバースリップ上にスライドを静かに降ろすのは、見抜くまで練習が必要なテクニックです。蛍光顕微鏡を暗室に配置したスライドでは、ウェル全体のスキャンを20倍または25倍の対物レンズで行う必要があります。細胞の分布と蛍光の均一性を評価するには、40 x 対物レンズに切り替えます。

ポジティブとパターンに関する最終的な解釈を行うには、ポジティブコントロールとネガティブコントロールを見てください。ネガティブコントロールは完全に暗く見えない場合がありますが、多くの場合、低レベルの非特異的蛍光を示します。ポジティブコントロールは、核内に明るいアップルグリーンの蛍光を示します。

ポジティブ度は、1プラスから4プラスまでの反応性評価スケールを使用して評価できます。手動による解釈に加えて、スライドは自動蛍光顕微鏡でロードしてスキャンできます。暗い部屋は必要ありません。

適切なスライドタイプを選択してプロジェクトを作成した後、装置は各ウェルの細胞の高解像度デジタル画像を取得して保存します。さらに、Nova viewは蛍光灯の強度を測定し、結果をポジティブまたはネガティブに分類し、ポジティブサンプルのパターン認識を提供します。画像は高解像度のコンピューターモニターでオペレーターに表示され、Nova Viewの最終的な解釈、修正、および確認が可能になります。

確認された結果に対して結果レポートを生成できます。核内の構成タンパク質構造に自己抗体が結合すると、均質なセントロメア、斑点のあるセントロメア、核分子、核ドットの5つの主要な核パターンが生じます。ここに示すように均質なパターンを同定するには、有糸分裂細胞または分裂細胞を同定します。

有糸分裂細胞は固体の均一な蛍光を示し、これはしばしば休止細胞よりも顕著です。休止細胞核は、びまん性染色で均一である必要があります。この特徴的なパターンは、二本鎖DNAに対する自己抗体の結果である可能性が最も高いです。

斑点模様の主な特徴は、中期有糸分裂細胞のコインスロットの外観です。これらの細胞の染色体領域は陰性です。静止している細胞は、核全体に斑点模様を示します。

斑点は、粗いまたは細かいものとして定義できます。コースの斑点は、SMおよびRNPに対する自己抗体の結果です。微細な斑点は、S-S-A-S-B、およびRNAポリメラーゼに対する自己抗体が原因である可能性があります。

DFSパターンは、密集した微細な斑点と呼ばれ、DFS 70に対する自己抗体を示しています。有糸分裂細胞は斑点状の染色を示しますが、静止細胞は核全体に均一に分布した細かい斑点を示します。このような場合、DFS 70 自己抗体は健康な個人と結合組織病の患者に多く見られるため、確認的検査を実施する必要があります。

セントロメアパターンを特定するには、ウェルをスキャンして、有糸分裂細胞または分裂細胞を特定します。分裂する細胞には、互いに密接に関連する多数の目立たない斑点があり、これはしばしば中期バーと呼ばれます。静止細胞は、核全体に分布する約40〜60の個別の斑点を示しています。

セントロメアパターンは、核小体パターンを持つセントロメアタンパク質に対する自己抗体と関連しています。有糸分裂細胞における染色体領域の染色はさまざまです。核小体パターンは、静止細胞核の核質の弱い、斑点のある、または均一な染色とともに、核の均一または斑点のある染色に関連しています。

このパターンは、RNAポリメラーゼ3つのフィブリリンおよびPM SCL抗体に対する自己抗体に関連しています。核ドットパターンは、負の中期、有糸分裂細胞、および静止細胞核内のいくつかの離散的なドットに関連しています。この特徴的なパターンは、多くの場合、SP 100 PMLまたはP 80 colanに対する自己抗体の結果です。

これらの抗体は、原発性胆汁性肝硬変および自己免疫性肝炎に関連しています。示されている画像では、核ドットパターンは、ミトコンドリア抗原に対する自己抗体による細胞質染色を示しています。抗核抗体の検出とパターン認識は、患者の診断を支援するための重要なツールとして機能します。

さまざまなパターンの重要性を理解することで、臨床医や検査室の専門家は適切なフォローアップ検査を行うことができます。抗核抗体のパターンを正しく同定するための最も重要な要素は、高品質の細胞基質を選択し、一貫した優れた技術でスライドを処理することです。スライド読み取りは、従来、暗室で蛍光顕微鏡によって行われ、細胞周期や細胞形態のさまざまなパターンに精通した訓練を受けた技術者によって行われます。

ここ数年で、スライドの自動読み取りのためにデジタルイメージングシステムが開発され、そのような機器はワークフローを自動化し、読み取りと解釈の一貫性を向上させています。さらに、バーコード付きスライドを使用することで、プロセス全体にわたるサンプルのトレーサビリティにより、潜在的な転写エラーが排除され、データの完全性と患者の安全性が向上します。このビデオを見れば、間接免疫蛍光法の各ステップの実行方法と、臨床的に関連する抗核抗体パターンの特定方法について十分に理解できるはずです。