抗核抗体のHE​​p-2細胞を用いたスクリーニング

本実験の全体的な目的は、間接免疫蛍光法を用いて抗核抗体をスクリーニングすることです。これは、患者血清をHEp-2基質スライドと共にインキュベートすることで行われます。結合しなかった患者血清を洗浄し、結合した自己抗体を特異的なフルオレセイン標識コンジュゲートでインキュベートした後、未結合の試薬を洗浄します。

蛍光顕微鏡で観察すると、自己抗体陽性サンプルでは、自己抗体が結合した細胞または核の領域に、抗原の存在を示す特有の蛍光パターンに沿ったアップルグリーン蛍光が認められます。最終的に、抗核抗体（ANA）の存在は、結合組織疾患の診断の補助として利用されます。固相ELISAなどの他の手法と比較した間接蛍光抗体法の主な利点は、Hep-2細胞基質に、天然の構成で発現している100種類以上の抗原が含まれていることです。

これにより、ほぼすべての臨床的に重要なO抗体の特定が可能になります。間接免疫蛍光法は非常に専門的な技術であるため、固相法ではこのような特定は不可能です。この手法に不慣れな人は、スライド処理の手順に習熟するまでに時間と練習が必要です。また、顕微鏡画像を解釈し、関連するパターンを識別できるようになることも、習得に時間を要するスキルです。

適切な試薬と器具を使用することで、結果の再現性が高まり、解釈が容易になります。本手順の実演は、免疫蛍光アッセイ開発研究室のテクノロジストであるCassandra Bryantが行います。試薬をパッケージから取り出し、各項目を室温に戻します。説明書の指示に従って試薬を調製し、患者血清を希釈します。スライドにはバーコードが付いており、自動化システムに容易に組み込むことができます。

この手順では、手動でのスライド処理について説明します。ただし、ハイスループットの研究室では、バーコードスキャン機能を備えた自動スライド処理装置を選択する場合もあります。Inovaの機器は、ワークフローの結果とレポートの管理を可能にする集中管理型のインテリジェントネットワークを介して接続されています。

IFA用です。これにより、処理中における患者の正確な識別が可能となり、転記および関連するエラーを排除できます。陽性コントロールを1滴、陰性コントロールを1滴、それぞれ適切なスライド上に分注します。

残りのウェルに、希釈した患者血清を20から25 µLずつピペットで分注します。スライドは1枚ずつ処理してください。底に湿らせたペーパータオルを敷いた染色容器にスライドを入れ、容器に蓋をして30分間インキュベートします。

加湿条件下に置くことで基質の乾燥を防ぎ、アーティファクトによる染色の発生を回避します。このインキュベーション期間中に、患者血清中の抗核抗体が、各ウェルに固定された細胞の抗原に結合します。インキュベーション後、基質へのダメージを避けるため、洗浄バッファーを穏やかに流して血清を洗い流してください。

ストリームが基質に直接当たらないよう、スライドをわずかに傾けます。スライドをこのように配置することで、ウェル間でのサンプルの混入を防ぐことができます。余分な洗浄バッファーを軽く叩いて取り除き、洗浄バッファーを入れたコップランド瓶にスライドを入れます。

洗浄ステップのインキュベーション時間は約5分間としてください。スライドを洗浄バッファーから取り出し、軽く叩きます。余分な洗浄バッファーを取り除くため、各ウェルに蛍光コンジュゲートを1滴ずつ滴下します。

NA試験では、IgG FC特異的コンジュゲートの使用が推奨されます。加湿容器内でスライドを30分間インキュベートし、必ず染色のカバーを戻してください。コンジュゲートは光に敏感であるため、カバーによってスライドを光曝露から保護します。

このインキュベーション期間中に、コンジュゲートが細胞抗原に結合している患者の抗核抗体に結合します。このコンジュゲートの結合により、インキュベーション後のウェルに蛍光が現れます。スライドを洗浄バッファーで洗浄してください。

前と同様に、カバーガラスをペーパータオルの上に置き、カバーガラスの下端に封入剤を連続した線状に塗布します。各スライドを洗浄バッファーから取り出し、スライドを軽く叩きます。余分な洗浄バッファーを除去するため、スライドの下端をカバーガラスの端に接触させます。

カバーガラス上の封入剤が、気泡が入ることなくスライドの上端まで流れるように、スライドをゆっくりとカバーガラスの上に下ろします。最適な量の封入剤を使用し、気泡なく封入するには習熟が必要です。暗室に設置された蛍光顕微鏡を用いて、20xまたは25xの対物レンズでウェル全体をスキャンしてください。細胞の分布と蛍光の均一性を評価するには、40xの対物レンズに切り替えます。

陽性および陰性の判定とパターンの最終的な解釈を行うには、陽性コントロールと陰性コントロールを確認してください。陰性コントロールは完全に暗くは見えない場合がありますが、多くの場合、低レベルの非特異的蛍光を示します。陽性コントロールでは、核に明るいアップルグリーンの蛍光が認められます。

陽性度は、1プラスから4プラスまでの反応性グレード尺度を用いて判定できます。手動による判定に加えて、自動蛍光顕微鏡にスライドをロードしてスキャンすることも可能です。暗室は必要ありません。

適切なスライドタイプを選択してプロジェクトを作成した後、装置は各ウェルの細胞の高解像度デジタル画像を撮影し、保存します。さらに、Nova viewが蛍光強度を測定して結果を陽性または陰性に分類し、陽性サンプルに対してパターン認識を行います。オペレーターは高解像度のコンピューターモニターで画像を確認し、Nova Viewによる判定の最終的な解釈、修正、および確認を行います。

確定した結果に基づいて結果報告書を作成できます。核内の構成タンパク質構造に対する自己抗体の結合により、均質型、斑点型、セントロメア型、核小体型、核ドット型の5つの主要な核パターンが現れます。ここに示すような均質型パターンを同定するには、有糸分裂細胞または分裂細胞を確認してください。

分裂期の細胞は、休止期の細胞よりも顕著であることが多い、均一で濃厚な蛍光を示します。休止期の細胞核は、びまん性の染色を伴い均一であるはずです。この特徴的なパターンは、二本鎖DNAに対する自己抗体によるものである可能性が最も高いと考えられます。

スペックルパターンの主要な特徴は、分裂期中期の細胞がコインスロットのような外観を呈することです。これらの細胞の染色体領域は陰性となります。静止期細胞では、核全体にスペックルパターンが見られます。

斑点状（スペックリング）パターンは、粗大または微細に定義されます。粗大斑点状は、SMおよびRNPに対する自己抗体によって生じます。微細斑点状は、RNAポリメラーゼだけでなく、S-S-AおよびS-S-Bに対する自己抗体によって生じることがあります。

DFSパターンは「緻密で細かい斑点状（dense, fine speckled）」と呼ばれ、DFS 70に対する自己抗体の存在を示します。分裂期細胞では斑点状の染色が見られ、静止期細胞では核全体に均一に分布した細かい斑点が見られます。DFS 70自己抗体は、結合組織病の患者よりも健康な個人に多く見られるため、これらのケースでは確認試験を実施する必要があります。

セントロメアのパターンを同定するために、ウェルをスキャンして有糸分裂期または分裂中の細胞を同定します。分裂中の細胞では、多数の独立した斑点が互いに密接に結合しており、これはしばしば中期バーと呼ばれます。静止期の細胞では、核全体に分布する約40〜60個の独立した斑点が観察されます。

セントロメアパターンは、核小体パターンとともにセントロメアタンパク質に対する自己抗体に関連しています。分裂期細胞における染色体領域の染まり方は多様です。核小体パターンは、核の均質または斑状の染色に加え、休止期細胞核の核質の弱く斑状または均質な染色に伴って認められます。

このパターンは、RNAポリメラーゼIII、フィブリリン、およびPM-SCLに対する自己抗体と関連しています。核ドットパターンは、メタフェーズ（中期）の有糸分裂細胞が陰性であり、休止期細胞の核に少数の離散的なドットが見られることが特徴です。この特徴的なパターンは、多くの場合、SP100、PML、またはP80 colanに対する自己抗体によって生じます。

これらの抗体は、原発性胆汁性肝硬変および自己免疫性肝炎に関連しています。提示された画像では、ミトコンドリア抗原に対する自己抗体により、核ドットパターンが細胞質染色を示しています。抗核抗体の検出とパターンの認識は、患者の診断を補助するための重要なツールとなります。

さまざまなパターンの意義を理解することで、臨床医や検査担当者は適切な追試を行うことが可能になります。抗核抗体パターンの正確な同定において最も重要な要因は、高品質の細胞基質を選択することと、一貫した優れた技術でスライドを処理することです。スライドの読影は、従来、暗室での蛍光顕微鏡を用いて行われ、細胞周期および細胞形態の文脈におけるさまざまなパターンに精通した訓練を受けた臨床検査技師によって実施されます。

ここ数年で、スライドの自動読影を目的としたデジタルイメージングシステムが開発されており、こうした装置はワークフローを自動化し、読影および判定の整合性を向上させています。さらに、バーコード付きスライドを使用することで、プロセス全体を通じたサンプルのトレーサビリティが可能となり、潜在的な転記ミスが排除され、データの完全性と患者の安全性が向上します。このビデオを視聴することで、間接免疫蛍光法の各ステップの実施方法と、臨床的に重要な抗核抗体パターンの識別方法について十分に理解できるはずです。