電子フォンフレイ装置を用いたマウス後肢の触覚感度の変化の測定

本手順の全体的な目的は、マウスの後肢における機械的圧力に対する感受性反応の欠如を測定することです。まず、動物をワイヤーメッシュの床の上に置き、準備が整うまで慣らせます。その後、後肢の足底にポリプロピレンチップを当て、徐々に圧力を高めていきます。

適切な行動反応が認められた時点で、刺激を取り除きます。ベースライン値を収集した後、動物に実験的介入を行い、さらに検査を実施します。最終的に、後肢の逃避閾値の変化を治療群間で比較し、特定の治療が圧力に対する触覚感度の変化に及ぼす影響を判定します。

痛みは炎症の主要な構成要素です。さまざまな状況において痛みを測定し、特性を明らかにすることは重要です。この比較的簡便な痛み評価法は、多くの異なる炎症モデルに適用することができます。

手順の実演は、私の研究室のリサーチテクニシャンである Tiana、この研究に学部生として関わった Madison Mack、および現在私の研究室の学部生である Akila Sykes が行います。まず、後肢に容易にアクセスできるよう、試験装置をセットアップすることから始めます。

個別のチャンバーをメッシュフロアの上に設置します。メッシュフロアは、扱いやすい高さの、安定した表面の上に配置してください。次に、電子式Von Frey装置をベンチトップに設置します。

プローブとケーブルがディスプレイユニットに適切に接続されていることを確認し、セットアップモードで装置の電源を入れます。読み取り値をゼロに設定し、付属のテストウェイトをVon Freyプローブのコーン上にそっと置きます。読み取り値を記録し、テスト終了時にもう一度この手順を繰り返してください。2つの値の間に不一致がある場合は、装置の再校正が必要な可能性があります。

検査する組織に適したサイズのポリプロピレンチップを選択します。感度が低く、より硬い後足の組織には、硬いチップが適しています。チップをプローブのコーン部分にゆっくりと装着します。

次に、セットアップモードからオペレーションモードに切り替えます。これにより、プローブが後退した際の最大印加圧が表示されます。後肢の逃避閾値を測定するには、2人の研究者が必要です。

バイアスを軽減するため、装置を操作して測定を行う者と、それらの測定値を記録する者の2名体制で実施します。麻酔装置を操作する研究者は、処置内容および記録された逃避閾値について盲検化されている必要があります。さらに、測定間の整合性を確保するため、すべてのベースライン値および逃避閾値は同一の人物が記録してください。

処置の48時間前に、1回目のベースライン測定を行います。排泄物を回収するため、スタンドの下に吸収材を敷いてください。チップを取り付け、プローブのゼロ点調整を行った後、測定担当者はマウスを個別のチャンバーに入れてください。

チャンバーに穴あき蓋を被せ、その上に重い物を置きます。マウスの脱走を防ぐため、操作を開始する前にマウスをチャンバーに15分間慣らしてください。一般的に、この手法に不慣れな者は、圧力を徐々に増加させる操作や、測定値の内部一貫性を確立することに苦労するため、再現性のある結果を得るには練習が不可欠です。

準備ができたら、両手でプローブをゆっくりと持ち上げ、左右いずれかの後肢の足底を刺激します。侵害受容行動が観察されるまで、徐々に圧力を高めてください。これらの行動は、後肢の後退、後肢の舐め動作、または足でのジャンプによって識別されます。

もう一人の研究者に、観察された行動を誘発した圧力を記録するよう指示してください。測定中は、チャンバーのすぐ外に餌を置いたり、測定前に軽く叩くなどの小さな音を立てたりして、マウスを静止させるように促すと有用です。各個体が1回ずつテストされるまで次のマウスへと進み、この手順をさらに4回繰り返してください。

5つのベースライン値を収集した後、マウスごとの平均値を算出します。24時間後にベースライン測定を繰り返し、これらの値を用いて別の平均値を算出します。すべてのマウスが一貫したベースライン反応を示すことを確認するため、ベースラインの平均逃避閾値が3.5 g未満である個体、またはベースライン閾値の差が2 g以上ある個体は除外してください。

最後に、各群の平均的な撤退ベースラインが可能な限り等しくなるように、マウスを個別の処理群に割り当てます。ここでは、後肢への毒素投与後、撤退閾値を測定しました。生理食塩水を投与したコントロールマウスでは、すべての時点でベースラインと比較してほとんど変化が見られませんでした。

処置後のマウスにおける侵害受容反応の検証点では、6時間後まで明らかに維持されていました。さらに、炎症に特徴的な組織浮腫が、生理食塩水投与群ではなく、毒素投与群の後肢に認められました。毒素によって誘発された触覚感受性の変化に伴い、好中球がほぼ1000倍の規模で浸潤していました。

生理食塩水で処理した後肢の対照群と比較して、生理食塩水で処理した後肢組織の足底マスト細胞は、大部分が完全なままであったか、あるいは軽度の脱顆粒を示しました。対照的に、交配させた後肢では、マスト細胞の15〜20%に中等度から高度の脱顆粒が認められました。この手法は、後肢以外の幅広い組織において、機械的感受性や触覚感受性を評価するために応用することが可能です。

したがって、この手法は炎症および疼痛のさまざまなげっ歯類モデルに組み込むことが可能です。