Name: 電子フォンフレイ装置を用いたマウス後肢の触覚感度の変化の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-19T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 学ぶ 電子フォンフレイ装置を用いたマウス後肢の機械的痛覚閾値測定法。炎症モデルにおける触覚感度変化を正確に評価し、神経科学および疼痛研究の再現性向上に貢献します。

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NIH R15 NS067536-01A1 (DCへ)とマカレスター大学ウォレス研究基金(DCへ)がこれらの研究を支援しました。マカレスター大学図書館は、この記事のオープンアクセス出版を支援しました。また、Chatterjea研究室の現役および過去のメンバーにもご支援いただき、誠にありがとうございます。

マカレスター大学の動物施設管理および使用委員会(IACUC)は、すべてのプロトコルを承認しました。これらの実験には、8〜12週齢の男性のND4スイスマウスが使用されました。
1. Bothrops jararaca 毒の調製と注射
<ol>
	<li>注意:B.jararaca毒は有毒です。粉末の取り扱いや溶液の調製時には、手袋、マスク、目の保護具を着用してください。</li>
	<li>45 μg/kg B. jararaca 毒 (以前の用量反応実験で決定されたレジメン) または 0.9% 生理食塩水ビヒクル (10 μl) を、29 G x 1/2 の針が入った 3/10 ml インスリン注射器を使用して、両後足に足底内注射で投与します。注:実験デザインに応じて、治療液と制御液を各後肢に別々に注入して、各被験者の内部制御を提供することができます。</li>
</ol>
2. 電子フォンフレイ装置のセットアップと操作
<ol>
	<li>電子フォンフレイユニットをプローブスタンドに置きます。プローブとケーブルがディスプレイユニットに適切に接続されていることを確認し、機器の電源を入れます。セットアップモードで読み出しをゼロ(0.00 g)に設定し、付属のテストウェイト(5.00 g)をフォンフレイプローブのコーンにそっと置きます。</li>
	<li>読み出したものを実験ノートに記録し、試験セッションの終了時にこの手順を繰り返します。試験セッションの前後で試験分銅の読み取り値に0.20 gを超える不一致がある場合、または試験分銅の適用後に読み取り値に変動がある場合は、装置の再校正(メーカーによる)が必要になる場合があります。</li>
	<li>マウスの後肢の離脱閾値を評価するには、プローブに付属のものの中から適切なポリプロピレンチップを使用します。チップの選択は、プローブする組織によって異なります。硬い先端は、感度が低く、丈夫な後足組織に適していますが、肛門性器隆起(Chatterjea、未発表)などのより柔らかい領域には、セミフレキシブルチップが適している可能性があります。剛性のある先端をプローブのコーンにそっと取り付けます。</li>
	<li>最大印加圧力を記録するには、動作モードをセットアップから操作に切り替えて、最大印加圧力がディスプレイに記録されるようにします。このモードでは、プローブが引っ込められたときに、最大印加圧力の読み出しがディスプレイ画面に保存されます。</li>
</ol>
3. 後足離脱閾値評価の一般的な考慮事項
<ol>
	<li>理想的には、EvF装置を使用して後肢離脱閾値(機械的感度)を測定するには、2人の研究者が必要です-1人は装置を操作して測定を実行し、もう1人は記録された測定値を書き起こしてマウスを処理します。</li>
	<li>バイアスを減らすために、装置を操作する研究者は、治療と記録された離脱しきい値を知らされていない必要があります。さらに、測定値間の一貫性を確保するために、同じ個人がすべてのベースラインおよび実験の離脱閾値を評価する必要があります。</li>
	<li>すべての測定は、静かで温度管理された部屋で、14日目の同じ時間に行ってください。</li>
	<li>測定値を記録する実験者は、メッシュのフロアスタンドにセットされたマルチユニットポリメチルメタクリレート(PMMA)ハウジングの個々のチャンバーに各マウスを配置する必要があります。穴あきPMMA蓋でチャンバーを覆い、マウスが逃げるのを防ぐために、上に重いものを置きます。スタンドの下に吸収材を置き、排泄物を吸着・回収します。マウスをチャンバー内で 15 分間順応させてから、ベースラインまたは実験的離脱閾値評価 6,7,10 を行います。 </li>
	<li>マウスの後足は、メッシュの床の開口部から簡単にアクセスできる必要があります。したがって、メッシュの床スタンドをブレーキ付きのカートの快適な高さに配置するか、すべての側面からアクセス可能な安定したベンチトップに置きます。</li>
	<li>測定中、マウスは、測定チャンバのすぐ外側に置かれた食物ペレット15、または測定前に、または測定中ではなく、チャンバの床の金網に沿ってペンをタッピングまたは実行することによって生じる非常にわずかなノイズに気を散らさなければならない場合がある。これにより、マウスが静止するようになり、実験者がより簡単に測定を開始できます。</li>
</ol>
4. ベースライン後肢離脱閾値評価
<ol>
	<li>ベースライン測定の最初のセットは、治療を投与する48時間前に実行する必要があります。.リジッドチップを取り付けるときにプローブをゼロにします。両手を使って、プローブをゆっくりと上げて、左または右の後足の中央(フットパッド領域)を刺激します(両方の足が同じ治療を受けた場合)。</li>
	<li>後足の引っ込み、後足の舐め、または4本足のジャンプなどの定義された侵害受容反応行動が観察されるまで、圧力を徐々に上げます6,10。観察された行動を引き起こした圧力を書き写すように他の研究者に指示します。</li>
	<li>隣接するチャンバーに位置するマウスの離脱閾値を測定します。各マウスの引き出ししきい値を一度評価するまで続けます。さらに4回繰り返して、各マウスが前に説明した10のように5倍に測定されるようにします。</li>
	<li>各マウスについて、5 つの測定値の中央値を計算し、各値が中央値からどれだけ逸脱しているかを計算します。最も逸脱が少ない3つの値を選択し、それらを平均化して、前に説明した10のベースライン引き出ししきい値を取得します。このデモンストレーションでは、5 つの値のうち 3 つを使用して測定が標準化されています。具体的な測定回数は実験デザインによって異なりますが、ベースラインを評価するためには、すべてのマウスに同じ回数突くようにすることが重要です。</li>
	<li>24 時間後にベースライン測定を繰り返します。マウスごとに5回の測定を行い、中央値に最も近い3回を平均して、ベースラインの離脱閾値を取得します。</li>
	<li>マウスの平均ベースライン離脱閾値を計算するには、治療の48時間前と24時間前に測定したベースライン離脱閾値を平均します。ベースラインの平均離脱閾値が3.50 g未満の場合、または2つのベースライン閾値の差が2.00 g以上異なる場合は、マウスを実験から除外します。これらの基準により、実験に参加したすべてのマウスが一貫したベースライン反応を示し、治療後に低い閾値を観察できる十分に高いベースライン離脱閾値が得られるようになります。</li>
	<li>注:除外閾値は、プローブする組織、研究する動物の系統、および使用するチップの種類によって異なります。例えば、3.5gはND4後足組織の有用なベンチマークであることがわかっていますが、肛門性器隆起のようなより柔らかい領域には、より低い排除閾値が必要であることがわかりました(Chatterjea、未発表)。</li>
	<li>マウスを治療群に割り付けて、治療が実施される前に実験群の平均離脱ベースラインができるだけ類似するようにします。</li>
</ol>
注:ベースライン測定は、実験の48時間前に実行できます。ただし、治療開始前に定期的に少なくとも 2 セットのベースライン測定を完了する必要があります。
5. 実験的後足離脱閾値評価
<ol>
	<li>実験のデザインによって決定された適切な時点での治療後の後肢離脱閾値 (機械的感度) を評価します。測定が完了したら、すぐにマウスをケージに戻して、餌と水を手に入れます。</li>
	<li>上記の手順に従ってください。特に感度を複数の時点で評価する場合は、(治療された)後足組織を過剰に刺激する可能性を減らすために、5回ではなく3回の測定を行います。3つの測定値のうち2つが2.00 g以上異なる場合は、4番目の測定値を採取します。</li>
	<li>3 つの測定値の平均を計算して、各マウスの実験離脱閾値を取得します。4 回の測定を行ったマウスについて、中央値からの逸脱が最も少ない 3 つのマウスの平均を計算して、実験的な離脱閾値を取得します。</li>
	<li>特定の時点での各マウスのデルタ離脱閾値を取得するには、実験的な離脱閾値からベースラインを差し引きます。すべてのマウスとすべての実験時点について繰り返します9.</li>
	<li>収集したデータに対して適切な統計分析を実行します。ここでは、JMP 9.0(SAS、ノースカロライナ州ケーリー)を使用して、一元配置ANOVAとTukey HSDの事後分析を実施しました。</li>
</ol>

<ol><li>Meetoo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+diseases%3A+the+silent+global+epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Nurs%22%5BJournal%5D)">Chronic diseases: the silent global epidemic.</a> Br J Nurs. (21), 17-21 (2008).</li>
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</ol>

著者らには、開示すべき競合する金銭的利益はありません。

離脱反応の変化の測定は、痛みと炎症のげっ歯類モデルにおける触覚感度の変化を評価するために使用される重要なツールです。ここでは、この評価を実行するための電子フォン・フレイ装置の有用性を示します。この技術にはいくつかの利点があります:i)かなり近い複数の時点で複数のマウスに加えられた圧力に対する離脱反応を迅速に評価できる、ii)単一のチップを使用して組織の小さな領域に連続的かつ特定の圧力を加えることができる、iii)離脱反応を得るために加えられた正確な圧力を正確に測定できる、 iv) 堅牢なベースラインカットオフ、除外基準、および内部統制を簡単に実装して、行動評価が可能な限り正確かつ客観的であることを保証できます。
EvFアッセイの最良の結果を保証するための重要なステップは、機器の事前校正と一貫した測定方法です。プロトコルのセクションで詳しく説明されているように、機器は慎重に取り扱い、使用前および使用中に適切な校正を確保する必要があります。測定を行う前に、最適な機械機能を確保するために、試験重量の測定値を確認する必要があります。測定値が大幅に変動する場合、または試験重量の測定値が正確でない場合は、直ちに製造元に連絡して装置を校正する必要があります。これを念頭に置いて、機器の校正の予期しない必要性のために時間に敏感な実験を損なわないように、可能であればバックアップの電子フォンフレイ装置を用意することをお勧めします。さらに、十分に訓練された 1 人の研究者は、治療グループを知らせずに、特定の研究または一連の実験についてすべてのベースラインおよび実験測定を行う必要があります。マウスは、静かな部屋で評価し、一定の温度に保持し、少なくとも15分間EvFチャンバーに順応させるが、ストレスや不快感による行動の変化を最小限に抑えるために、必要以上にチャンバー内に拘束しないでください(特に1日以内に複数の測定が行われる場合)。
EvF測定は、既存のCvF技術と比較して大幅な改善をもたらします。研究者は連続的な圧力を加えることができ、CvFフィラメント実験6で行われているように、さまざまな重量の先端を切り替える必要はありません。これにより、組織を突くことが少なくなり、特に炎症を起こしたり損傷したりした場合に関係します。CvF測定で使用される利用可能なフィラメント重量によっても制限される50%の引き抜き測定を使用して、引き抜きが発生する正確な圧力を測定できます13。合理的で均一な除外基準を実装できるため(上で説明したように)、実験の開始時にすべてのグループが同様の平均ベースラインを持つように、マウスを実験グループに割り当てることができます。EvF測定は、絶対的な反応自体ではなく、特定の刺激に対する行動反応 の変化 を評価します。したがって、侵害受容反応における各マウスの変化は、個々の実験離脱とベースライン離脱の差として測定され、行われたすべての測定の内部制御が提供されます。
おそらく、EvFの最も重要な制限は、手動の対応物と同様に、同じ研究者が特定の一連のベースライン測定と実験測定のすべての測定を行う必要があることです。そのため、時間、人員、設備の観点から、技術のスケールアップが困難になっています。一度に~20匹のマウス(アッセイチャンバーの構成に応じて)は、測定間に少なくとも45分ある場合、複数の時点で30〜45分以内に測定できることがわかりました。この点に関連する考慮事項は、個々の実験者の学習曲線です。個々の研究者が本格的な実験に着手する前に、内部の一貫性を確立する必要があり、これには、望ましい一貫性に達するまで、ベースライン応答測定を繰り返す何時間もの献身的な練習が必要です。さらに、ベースラインカットオフを使用することは、実験のためにベースライン化されたすべてのマウスを含めることができるわけではないことを意味します。実験ごとにベースラインされたマウスの25〜30%が通常除外されていることがわかりました。
変更と将来の応用の観点から、EvF行動測定は、炎症の病状の根底にある可能性のある付随する急性および/または慢性の痛みを分析するために、炎症の幅広いモデルに強力な次元を追加します。毒液化では、ND4雄マウスの後足における組織の腫れ、白血球動員、および肥満細胞の脱顆粒の期待される結果を伴う触覚感度の顕著で急速な変化が伴うことがわかりました。これらの発見は、ラットの熱感受性20およびCvF21を使用して測定されたND4スイスマウスのB.ジャララカ毒によって誘発される機械的感受性に対するマスト細胞メディエーターの寄与に関する以前の観察を裏付けています。EvFプロトコルは、後足以外の組織、例えばCvFが現在使用されている腹部7および肛門生殖器隆起8で使用するために簡単に変更することができます。アレルギー、創傷治癒、神経障害、その他の病状のげっ歯類モデルは、後足を含む組織およびそれ以外の組織における機械的感受性の測定を含むように簡単に適応できます。
要約すると、EvF は、げっ歯類の侵害受容を測定する古典的なアプローチを更新する有用で効果的な技術であり、幅広い疾患モデルにおける痛みの複雑な根底にあるメカニズムを調査するための重要な新しいツールです。

慢性非感染性疾患は、死亡率と罹患率1の人間の負担の不均衡な割合を占めています。慢性疼痛は、世界的な疾病負担の重要な要素としてますます認識されています2。これは、痛みの予防、管理、治療におけるイノベーションに大きな推進力をもたらしました。同時に、痛みの根底にある生物学が複雑であるという豊富な証拠があります3。防御的疼痛、不適応疼痛、慢性疼痛の根底にあるメカニズムは、免疫系と神経系の間の複雑な相互作用を指し示しています3,4。これらのメカニズムの解明には、分子解剖から行動解析まで、厳密で定量的で再現性のある実験的アプローチが必要です。
げっ歯類モデルは、炎症性疼痛および神経障害性疼痛の分子プレーヤーの特性評価において非常に貴重です5。有害な刺激に対する以前に指定された反応の時間と強度の減少は、げっ歯類の被験者が他の方法では痛みの感覚を報告することができないため、これらの動物の痛みの状態を測定するために使用されます6。感染7,8、化学物質曝露6、9,10、外科的切開11、神経結紮12によって引き起こされる神経障害性疼痛によって引き起こされる炎症性侵害受容のげっ歯類モデルでは、温度と圧力に対する反応の変化が組織感受性の指標として一般的に使用されています。
機械的感度、または圧力刺激に対する反応は、しばしば古典的なフォン・フレイ・フィラメント(CvF)を使用して測定されます - 一連の(例:0.4-15 g13)加重チップを試験組織に手動で適用し、対照群と実験被験者で痛みの行動が誘発されるまで連続的に行います。これらのヒントまたは髪の毛を使用して機械的感度を評価するためのさまざまな方法があります6,13。最も頻繁に使用される方法は次のとおりです。一定の圧力を持つチップ(シリーズ内;例えば、2g13)を出発点として選択し、ラットまたはマウスの50%の離脱閾値(先端が組織に適用される回数の50%の応答を生じさせるのに必要な刺激強度)は、以前に指定された応答挙動13の表示に基づいて先端重量を上下に移動することによって決定される。次に、治療群の絶対 50% 離脱閾値を、ベースライン時点と治療後の時点間で比較します。この手動の手法は、非常に時間がかかります。これにより、各被験者がフォン・フレイ室に閉じ込められる時間が長くなるだけでなく、さまざまな重量の試験チップが炎症組織に適用される回数も増加し、研究対象のげっ歯類に大きな不快感を与えることになります。さらに、50%の引き出し閾値が計算され、げっ歯類のグループ間で比較されます。実験被験者の個々の反応は、通常、私たちの知る限り、1つの例外を除いて、未治療の個々のベースライン反応に正規化されていません6。結果として、げっ歯類の被験者は通常、以前に決定された範囲内の一貫したベースライン反応に基づいて治療群に割り当てられたと報告されず、個々の被験者は、ベースライン反応を特定の研究およびアッセイのセットに対して標準化することを可能にする一貫して適用された一連の除外基準に基づいて評価されません。
ここでは、電子フォン・フレイ装置(EvF)を使用して、Bothrops jararaca毒への曝露後のマウス後足の触覚感度を測定するための代替方法を紹介します。Cunhaら6は、げっ歯類におけるEvF技術の使用を開拓し、CvFとEvFの有効性を系統的に比較して、EvFが炎症性疼痛のげっ歯類モデルにおける触覚感度の「より感度が高く、客観的で、定量的な」尺度を提供することを実証した。簡単に言うと、EvF測定では、試験対象の組織に適した剛性の均一な直径(0.8 mm)の非吸湿性ポリプロピレンフォンフレイチップを電子プローブに取り付けて、げっ歯類がチップから引っ込む力/重量を表示する読み出しを行います。CvF測定とEvF測定には、いくつかの重要な違いがあります。まず、EvFを使用してベースライン反応と実験的反応の両方を測定するプロセスは、後足への圧力を増加させる力を加えることができ、反応があり、CvFのように先端を変更する必要がないため、大幅に合理化されます。動物はアッセイチャンバーに閉じ込められる時間が短いため、実験中のストレスが少なく、より快適です。第二に、EvFは、許容可能なベースライン閾値の範囲という形で、研究対象者に対する合理的な除外基準を比較的容易に実施することを可能にします。これにより、治療群内および治療群間でのベースライン反応の標準化が可能になります。第三に、実験的治療後の被験者の反応は、常に被験者自身の個々のベースライン反応と比較され、測定のための重要な内部コントロールが作成されます。第四に、引き出し閾値の精度は、手動フィラメントのウェイトの形で利用可能な増分ではなく、圧力を連続的に加えることができるため、より高いレベルの分解能で記録されます。適切に設計されたCvFアッセイと同様に、EvFベースの実験も、同じ研究者(治療を受けていない)が力を加え、応答行動を記録することで実施されます。この手法では、測定の内部一貫性を確立するために研究者の側で時間と労力が必要であり、一貫性のないベースライン反応のために除外しなければならない可能性のあるマウスに対して適切な考慮がなされるように実験を計画する必要があることに注意することが重要です。
実装が簡単で、効果的で、適切に制御された機械的感度の評価は、毒物などの炎症イベントのモデルに行動評価を追加することを容易にします - 触覚感度の変化の測定におけるEvF測定の容量とパワーを説明するためにここで使用した例です。その結果、ND4 Swissマウスの雄は、南米のマムシBothrops jararaca由来の毒液を後足に注入した後、機械的感度が向上したことを発見しました。行動反応は、罹患組織における浮腫、好中球の流入、および肥満細胞の脱顆粒を伴いました。

<table><tbody><tr><td>ND4 スイスのオスマウス</td><td>Harlan</td><td>0-32</td><td>ここで使用したマウスは生後8-12週齢で、マカレター大学のIACUCガイドラインに従って飼育および使用されました。</td></tr><tr><td>3 ml / 100インスリンシリンジ、29 G 1/2インニードル</td><td>BD</td><td>入り</td><td>BD BD309301 使用後は、各使用後、適切な容器に廃棄してください。</td></tr><tr><td>B. jararaca毒</td><td>Sigma</td><td>V5625</td><td>注意:有毒物質。目と皮膚の保護具を着用してください。滅菌0.9%生理食塩水に溶解します。</td></tr><tr><td>電子フォン・フレイ装置; プローブ = 90 g 範囲</td><td>IITC</td><td>2394</td><td>静かに動かし、常に水平であることを確認してください。プローブをゼロにするには、「プログラム」と「クリア」を押します。セットアップモードから動作モードに切り替えるには、「ファンクション」(「MH」読み出しの場合)または「MAX」を押します。</td></tr><tr><td>メッシュスタンド + PMMAチャンバー</td><td>IITC</td><td>410</td><td>すべての側面にアクセスするために、安定したベンチトップまたは4つの車輪付きのカートに置きます。</td></tr><tr><td>電子フォンフレイ硬質チップのみ、90 g レンジ</td><td>IITC</td><td>2390</td><td>n/a</td></tr></tbody></table>

電子フォンフレイ装置を用いたマウス後肢の触覚感度の変化の測定

Measuring Changes in Tactile Sensitivity in the Hind Paw of Mice Using an Electronic von Frey Apparatus

炎症による後足の機械的圧力からの離脱閾値の変化を測定することは、げっ歯類の痛み知覚の変化を評価するための有用な手法です。離脱閾値は、最初にベースラインで測定でき、次に薬物、毒、損傷、アレルゲン、またはその他の誘発された炎症の後に、皮膚の非常に特定の領域に正確な力を加えることで測定できます。電子フォンフレイ装置は、従来のフォンフレイ測定とは対照的に、利用可能なフィラメントサイズに制限されないマウス後肢の離脱閾値を正確に評価することができます。測定の容易さと迅速さにより、短期間で複数の測定を行うことができるため、急速に発症する炎症性および神経因性疼痛の多様なモデルに触覚感度の結果の評価を組み込むことができます。個々のげっ歯類の被験者の実験測定値は、個々のベースライン反応に対して内部的に制御でき、実験グループ内および実験グループ間でベースライン応答を標準化するために簡単に確立できる除外基準。したがって、電子フォン・フレイ装置を用いた測定は、齧歯類の機械的異痛症に対する確立された古典的なフォン・フレイ・フィラメント・ベースのアッセイの有用な修正を表しており、これは他の非ヒト哺乳類モデルにも適用できる可能性がある。

B. jararaca毒の局所投与により、ND4 Swiss雄マウスの後肢足底の触覚感受性の変化および組織浮腫が誘発される。
45 µg/kgのB. jararaca毒を投与してから1.5時間後、ND4 Swiss系雄マウスは、ベースラインより3.0 g低い圧力で後肢を回収した（Figure 1A）。全群におけるベースラインの回収圧力は～4.5 gであったが、毒投与後、実験群のマウスは1-1.5 gの印加圧力で後肢を回収した（データは示さず）。生理食塩水を投与した対照群のマウスでは、テストしたすべての時点において、ベースラインと比較して圧力反応の低下はほとんど、あるいは全く見られなかった。投与マウスにおける反応閾値の低下は、毒注入後3時間および6時間において明確に維持されており（Figure 1A）、24時間までには対照群と区別がつかなくなった（データは示さず）。毒を注入したマウスの後肢には、炎症に特徴的な組織浮腫が認められた。毒投与1.5時間後、既報の手法10で測定したところ、投与群の後肢はベースラインより1.5 mm厚くなっており、この浮腫は3時間および6時間後まで持続した（Figure 1B）。対照的に、生理食塩水を投与した肢では、実験期間を通じて腫脹や厚みの変化は見られなかった。ここに示した代表的な実験では、ベースライン測定に合計21匹のマウスを用い、その中から14匹を実験対象として選出した。これらを治療群に割り当てる際、群全体のベースラインにおける平均回収反応が約4.5 gとなるように調整した。
B. jararaca毒によって誘導される触覚感受性の変化は、ND4 Swiss系雄マウスの後肢におけるマスト細胞の脱顆粒および好中球の浸潤を伴う。
触覚過敏および組織浮腫の増加に加え、毒液を注入したマウスと生理食塩水を投与したマウスの後肢における好中球の浸潤（図2A-B）および肥満細胞の脱顆粒（図2C-D）についても評価しました。好中球は、血中から病変部位に最初に動員される炎症細胞であり、炎症性侵害受容反応を媒介することが知られています10,16,17。肥満細胞は組織常在性のセンチネル細胞であり18、肥満細胞の脱顆粒はマウスの後肢10およびラットの硬膜19における侵害受容反応に関連しているとされています。
ここでは、安楽死させたマウスから毒注入1.5時間後に採取した、ヘマトキシリン・エオジン染色済みの4 µmパラフィン埋め込み矢状面足底組織切片10の計数により評価した結果、毒を注入した後肢への好中球の浸潤が、生理食塩水を投与した後肢と比較してほぼ1,000倍に増加していることがわかりました（図 3A）。
生理食塩水で処理した足では、後足組織の足底マスト細胞は大部分が維持されていたか、あるいは軽度の脱顆粒を示した（図3B）。対照的に、毒を注入した後足では、マスト細胞の15-20%に中等度および広範な脱顆粒が認められた（図3B）。上述の組織切片をトルイジンブルーで染色し、既報の通り10、脱顆粒の状態を確認するために観察されたマスト細胞あたりの可視顆粒数を計測した。
<img alt="B. jararaca venom effect graphs: A) Mechanical threshold, B) Paw width over time. Statistical data.
" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51212/51212fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
図1. 局所的な B. jararaca 毒素の投与により、ND4 Swiss系雄マウスの後肢足底における機械的感受性の変化および組織浮腫が誘発される。 ベースラインの逃避閾値およびベースラインの足幅を、足底内投与の48時間前および24時間前に測定した。 *B. jararaca* 毒液 (Bjv; 45 µg/kg) または溶媒（生理食塩水）投与（10 µl）。逃避閾値は、処置後1.5時間、3時間、および6時間で評価した（A). A足底中央領域における平均的な足幅（マウスの左右の足幅の平均値） 組織浮腫を判定するため、既報の手法に従い、ベースライン時、および処置後1.5時間、3時間、6時間においてデジタルノギスを用いて評価した。10 (B）。有意性はSal投与マウスと比較した（* = p &lt; 0.05, ** = p &lt; 0.01, *** = p &lt; それぞれ0.001）。治療群あたりのマウス数はn = 10-11匹。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51212/51212fig1highres.jpg" target="_blank">こちらをクリックして拡大画像を表示してください</a>.
<img alt="生理食塩水とB. jararacaの効果の組織学的比較（400倍および1000倍の拡大）" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51212/51212fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図 2"> 
図 2. B. jararaca 毒素によって誘発された機械的感受性は、ND4 Swiss系雄マウスの後肢におけるマスト細胞の脱顆粒および好中球の浸潤を伴う。処置後1.5時間にCO2により処置群あたり3匹のマウスを安楽死させ 、後肢を摘出し、10% formalinに24時間保存した後、70% ethanolに移行し、15% EDTAで1〜2週間脱灰し、パラフィンに包埋した。4 µmの矢状切片を、それぞれ好中球（A-B）およびマスト細胞（C-D）を可視化するため、ヘマトキシリン・エオジン染色（A-B）およびトルイジンブルー染色（C-D）で染色した。画像は、注釈にある通り400Xおよび1,000Xで取得した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51212/51212fig2highres.jpg" target="_blank">ここをクリックして拡大画像を表示</a>。
<img alt="Neutrophils and degranulation by B. jararaca venom; bar graph; venom impact analysis." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51212/51212fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
図3. B. jararaca 毒素誘発性の機械的感受性の亢進は、ND4 Swiss系雄マウスの後肢における肥満細胞の脱顆粒レベルの有意な上昇および好中球の浸潤を伴う。 染色した組織切片上の好中球およびマスト細胞を、Olympus CX21LED顕微鏡を用いて計数した。好中球については、治療群ごとに後肢3本の踵から趾までの領域を、400倍の倍率で隣接する視野ごとに計数した。 (A）。マスト細胞を処理群ごとに3つの足底で計数し、細胞境界外に見られる顆粒の数に基づいて脱顆粒状態を、既報の通り、正常（0）、軽度（0-10）、中等度（10-20）、高度（21以上）としてスコア化した。10 (B).  後肢の切片における好中球数およびマスト細胞の脱顆粒レベルを評価する際、同一の細胞を二重にカウントすることを避けるため、研究者は接眼レンズのレチクルに刻まれたグリッドを使用した。研究者は治療群を盲検化して評価を行った。s. 有意差はSal投与マウスと比較して算出している（* = p &lt; 0.05, ** = p &lt; 0.01, *** = p &lt; （それぞれ0.001）。各治療群につきn =3匹のマウス。  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51212/51212fig3highres.jpg" target="_blank">ここをクリックして拡大画像を表示してください</a>.

Electronic von Frey測定は、炎症イベントの前後に連続的に加えられる圧力刺激に対するげっ歯類の機械的離脱閾値の変化を迅速かつ正確に測定できるため、従来のフォンフレイフィラメントに代わる効果的で改良された方法です。

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain ...

本手順の全体的な目的は、マウスの後肢における機械的圧力に対する感受性反応の欠如を測定することです。まず、動物をワイヤーメッシュの床の上に置き、準備が整うまで慣らせます。その後、後肢の足底にポリプロピレンチップを当て、徐々に圧力を高めていきます。適切な行動反応が認められた時点で、刺激を取り除きます。ベースライン値を収集した後、動物に実験的介入を行い、さらに検査を実施します。最終的に、後肢の逃避閾値の変化を治療群間で比較し、特定の治療が圧力に対する触覚感度の変化に及ぼす影響を判定します。痛みは炎症の主要な構成要素です。さまざまな状況において痛みを測定し、特性を明らかにすることは重要です。この比較的簡便な痛み評価法は、多くの異なる炎症モデルに適用することができます。手順の実演は、私の研究室のリサーチテクニシャンである Tiana、この研究に学部生として関わった Madison Mack、および現在私の研究室の学部生である Akila Sykes が行います。まず、後肢に容易にアクセスできるよう、試験装置をセットアップすることから始めます。個別のチャンバーをメッシュフロアの上に設置します。メッシュフロアは、扱いやすい高さの、安定した表面の上に配置してください。次に、電子式Von Frey装置をベンチトップに設置します。プローブとケーブルがディスプレイユニットに適切に接続されていることを確認し、セットアップモードで装置の電源を入れます。読み取り値をゼロに設定し、付属のテストウェイトをVon Freyプローブのコーン上にそっと置きます。読み取り値を記録し、テスト終了時にもう一度この手順を繰り返してください。2つの値の間に不一致がある場合は、装置の再校正が必要な可能性があります。検査する組織に適したサイズのポリプロピレンチップを選択します。感度が低く、より硬い後足の組織には、硬いチップが適しています。チップをプローブのコーン部分にゆっくりと装着します。次に、セットアップモードからオペレーションモードに切り替えます。これにより、プローブが後退した際の最大印加圧が表示されます。後肢の逃避閾値を測定するには、2人の研究者が必要です。バイアスを軽減するため、装置を操作して測定を行う者と、それらの測定値を記録する者の2名体制で実施します。麻酔装置を操作する研究者は、処置内容および記録された逃避閾値について盲検化されている必要があります。さらに、測定間の整合性を確保するため、すべてのベースライン値および逃避閾値は同一の人物が記録してください。処置の48時間前に、1回目のベースライン測定を行います。排泄物を回収するため、スタンドの下に吸収材を敷いてください。チップを取り付け、プローブのゼロ点調整を行った後、測定担当者はマウスを個別のチャンバーに入れてください。チャンバーに穴あき蓋を被せ、その上に重い物を置きます。マウスの脱走を防ぐため、操作を開始する前にマウスをチャンバーに15分間慣らしてください。一般的に、この手法に不慣れな者は、圧力を徐々に増加させる操作や、測定値の内部一貫性を確立することに苦労するため、再現性のある結果を得るには練習が不可欠です。準備ができたら、両手でプローブをゆっくりと持ち上げ、左右いずれかの後肢の足底を刺激します。侵害受容行動が観察されるまで、徐々に圧力を高めてください。これらの行動は、後肢の後退、後肢の舐め動作、または足でのジャンプによって識別されます。もう一人の研究者に、観察された行動を誘発した圧力を記録するよう指示してください。測定中は、チャンバーのすぐ外に餌を置いたり、測定前に軽く叩くなどの小さな音を立てたりして、マウスを静止させるように促すと有用です。各個体が1回ずつテストされるまで次のマウスへと進み、この手順をさらに4回繰り返してください。5つのベースライン値を収集した後、マウスごとの平均値を算出します。24時間後にベースライン測定を繰り返し、これらの値を用いて別の平均値を算出します。すべてのマウスが一貫したベースライン反応を示すことを確認するため、ベースラインの平均逃避閾値が3.5 g未満である個体、またはベースライン閾値の差が2 g以上ある個体は除外してください。最後に、各群の平均的な撤退ベースラインが可能な限り等しくなるように、マウスを個別の処理群に割り当てます。ここでは、後肢への毒素投与後、撤退閾値を測定しました。生理食塩水を投与したコントロールマウスでは、すべての時点でベースラインと比較してほとんど変化が見られませんでした。処置後のマウスにおける侵害受容反応の検証点では、6時間後まで明らかに維持されていました。さらに、炎症に特徴的な組織浮腫が、生理食塩水投与群ではなく、毒素投与群の後肢に認められました。毒素によって誘発された触覚感受性の変化に伴い、好中球がほぼ1000倍の規模で浸潤していました。生理食塩水で処理した後肢の対照群と比較して、生理食塩水で処理した後肢組織の足底マスト細胞は、大部分が完全なままであったか、あるいは軽度の脱顆粒を示しました。対照的に、交配させた後肢では、マスト細胞の15〜20%に中等度から高度の脱顆粒が認められました。この手法は、後肢以外の幅広い組織において、機械的感受性や触覚感受性を評価するために応用することが可能です。したがって、この手法は炎症および疼痛のさまざまなげっ歯類モデルに組み込むことが可能です。

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JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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