骨肉腫細胞における光線力学療法の細胞毒性有効性

次の実験の全体的な目標は、骨肉腫細胞における光線力学療法の細胞毒性を示すことです。これは、まず、骨肉腫細胞による光増感剤M-T-H-P-Cの細胞内取り込みを測定することによって達成されます。第2ステップでは、レーザー光を細胞に印加してM-T-H-P-Cを活性化し、細胞毒性酸素ラジカルを生成します。

最後に、細胞代謝と細胞数は、水溶性四胞子体1またはWST Oneアッセイによって測定されます。最終的には、WST one assay と直接細胞計数を使用して、骨肉腫細胞に対する光線力学療法の細胞毒性を測定できます。この技術の意味は、in vitroでの光線力学療法の有効性の測定を可能にし、現在患者に使用されている技術に似ているため、骨肉腫の治療にまで及びます。

骨肉腫細胞株間のM-T-H-P-C取り込みを比較するには、まず、ウェルあたり6番目のHessおよび143個のB細胞に10の0.2倍をプレーティングすることから始めます。6つのウェルプレートで三重に細胞を80〜90%coの流暢さで一晩接着させ、翌日、暗所で異なる期間、固定濃度のM-T-H-P-Cで細胞をインキュベートして、細胞による光増感剤の時間依存的な取り込みを評価します。インキュベーション後、培地を吸引し、細胞をPBSで3回洗浄し、0.5ミリリットルのトリプシンEDTAで細胞を剥離してカウントします。

次に、細胞をGの400倍、室温で5分間スピンダウンします。培地を吸引し、ペレットをPBSに再懸濁して、最終密度が10の2倍から5番目の細胞/ミリリットルになるまでです。細胞懸濁液の100マイクロリットルを96の各ウェルにピペットで移します。

ウェルプレートを作成し、417ナノメートルの励起と652ナノメートルの発光に設定された蛍光分光光度計で細胞の蛍光を測定します。次に、100マイクロリットルの0〜4ミリグラム/ミリグラムのM-T-H-P-C濃度を三重にめっきすることにより、標準曲線を準備します。96ウェルプレートで蛍光を測定し、先ほど示したように蛍光を測定し、前述したプレートからウェルを含む各細胞の相対蛍光単位を計算するための標準曲線を生成する。

光増感剤の光毒性を測定するには、まず、96ウェルプレート内の各M-T-H-P-C濃度ごとにウェルあたり3000細胞を三重に播種し、各PHOTOSENSITIZER濃度の暗毒性制御細胞を含む。細胞を一晩接着させて、翌日に50〜60%coの流暢さにします。インキュベーション後5時間、暗所でさまざまなM-T-H-P-C濃度の細胞をインキュベートします。

培地を吸引し、PBSで細胞を2回洗浄し、M-T-H-P-Cを含まない新しい培地を追加し、次にM-T-H-P-C吸収スペクトルに特異的で、適切な眼の保護具を着用します。652ナノメートルのダイオードレーザーを、13.5センチメートルの高さで21.88ミリワット/平方センチメートルの出力に設定します。細胞からの距離で、1平方センチメートルあたり5ジュールのエネルギー量を得ます。

その後、暗色毒性制御細胞以外の細胞を照射後230秒間照射します。細胞を摂氏37度の暗闇に24時間保管します。続いて、10マイクロリットルのwstを添加し、100マイクロリットルの培地ごとに1つの試薬を添加し、wstの添加から3時間後に1つの試薬を添加し、415ナノメートルで個々のウェルの吸光度を測定する。

最後に、WST One Assayに加えて、生存細胞の数を計算します。細胞の直接カウントは、細胞毒性を測定するための2番目の方法です。生細胞の割合を計算するには、2 24ウェルプレートでウェルごとに10の2倍から4番目の細胞に播種し、それらを一晩接着させます。

翌日、M-T-H-P-Cを使用して暗所で細胞を5時間インキュベートし、示したようにそれらを照らします。24時間後に暗闇の制御細胞を保って下さい、上清を集めて下さい、PBSおよびトリプシン目と細胞を一度洗浄し、それらは最終的に細胞を回転させ、数えるための新しい媒体の200マイクロリットルの餌を再懸濁します。このグラフに示されている結果は、上部パネルにM-T-H-P-Cの取り込みを時間依存的に示しており、細胞懸濁液の蛍光強度はM-T-H-P-Cの細胞内レベルを表しています。

下部パネルにあります。用量依存的なM-T-H-P-Cの取り込みは、蛍光分光光度計でM-T-H-P-Cの蛍光を測定することで評価できます。このグラフは、M-T-H-P-Cの細胞内レベルを表す細胞懸濁液の蛍光強度とともに、時間依存的にM-T-H-P-Cの固定濃度の取り込みを示しています。

このグラフでは、5時間のインキュベーション後のHaass細胞と143個のB細胞における用量依存的なM-T-H-P-Cの取り込みが示されています。高転移性細胞株143Bにおける取り込みは、低転移性親宿主細胞株におけるものよりも有意に高かった。骨肉腫細胞の用量依存的な暗色毒性が実証されています。

143個のB細胞を異なるM-T-H-P-C投与量で処理し、未処理の細胞と比較すると、wst 1アッセイで測定された代謝活性と細胞数の用量依存的な減少が観察されました。細胞生存率の低下は、M-T-H-P-C濃度が1ミリリットルあたり2.5マイクログラム以上で認められました。下のグラフには、M-T-H-P-Cの用量依存毒性

細胞を異なるM-T-H-P-C用量で処理し、その後、1平方センチメートルあたり5ジュールで照明しました。その結果、細胞代謝活性の低下と細胞数の減少が観察されました。この技術の開発により、がん生物学の分野の研究者が、この手法を骨肉腫のin vivoモデルや他の前臨床研究に適用するための道が開かれました。