Name: ヒト神経の集合体のためのcGMP適用可能な展開法は、幹細胞および前駆細胞は、多能性幹細胞や胎児の脳組織由来 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 学ぶ ヒト神経前駆細胞の機械的チョッピング法による増殖技術。細胞間接触を維持しながら40回以上の継代が可能で、長期的な対数成長を実現する革新的な培養手法です。

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我々は、この報告書の重要なレビューと編集のために博士Soshanaスベンセンに感謝します。この作品は、NIH / NINDS 1U24NS078370-01とCIRM DR2A-05320によって寄贈されました。

著者らは、開示することは何もありません。

<img alt="図6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51219/51219fig6highres.jpg" width="500" /> 図6。チョッピング回路図 。機械的なチョッピング法を用いて、培養中の回転楕円体幹/前駆細胞を拡大する。 重要なステップチョッピング膨張パラダイムの概要を図6に示す。HNPC球サイズがニューロスフェアを継代前に観察するための重要な基準の1つである。球体サイズの大きな分散があるが、球体の少なくとも30％が300ミクロンよりも大きい直径を有するべきである。球が通路に小さすぎると1-4日後に、単に新鮮なMM（25％-50％）でCMを交換し、再評価する。球体は直径が小さすぎるで継代したとき悪い膨張率が発生します。 HNPC膨...

A correction was made to <a href="/video/51219">A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue</a>. The corresponding author was changed from:
Brandon C. Shelley 
to:
Clive Svendsen

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Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

単層1-3または集約ニューロスフェア4-7のいずれかとして、培養中のげっ歯類の神経幹細胞を増殖の長い歴史があります。また、現像8-17中枢神経系の種々の領域から単離されたヒト神経前駆細胞（hNPCs）をインビトロで増殖されている。これらの細胞は、双方向性、強力、星状細胞及び神経細胞の両方に分化することができると神経の発達18,19及び疾患メカニズム20,21を研究する上で非常に有用なツールとなっている。 hNPCsまた、統合、生存および機能的効果22〜24種々のレベルの中枢神経系疾患の多くの異なる動物モデルに移植されている。 多くの場合、上皮成長因子（EGF）および/ ​​または線維芽細胞増殖因子-2（FGF-2）25-28 - - 、付着29、三両方伝統的には、齧歯類またはヒト胎児由来のNPCは、増殖因子に暴露される次元スフェロイドシステムは、典型的には単一細胞懸濁液30-34に酵素的解離を使用して継代する。研究や臨床用細胞を拡大する標準的な方法は、容易な操作のために接着単層としてある。しかし、我々は、酵素的または化学的溶液で継代単層およびニューロスフェアhNPCs、早期老化35をもたらしたことを示した。加えて、酵素的解離は、胚性幹細胞36〜38で実証されたデータに基づいて、分化および核型異常のレベルの増加をもたらし得る。継代hNPCsの標準的な方法は、現在の適正製造基準相に1臨床試験（細胞株、Neuralstem社幹細胞）行っている（cGMP）のグレードの製品を生産しているが、この方法では限界、細胞増幅のほんの数ラウンドを許可銀行の可能性。 明らかに、大規模な研究の実験と今後の臨床試験では、能力から利益を得ることができる大規模な増殖および細胞バンキングを可能にするためにバルク及び遅延された老化で細胞を伝播する。この必要性に対処するために、我々は細胞間接触を維持する小さなクラスターにそれらを「チョッピング」によって、新規かつ機械的に継代無傷の神経球の自動化された方法を開発した。この方法は、大幅に代替3Dバイオリアクター培養方法40で見られるようなそれらの寿命39および懸濁培養物は、単層培養物と比較して、インキュベータ·スペースのより効率的な使用を可能にする増加した。チョッピング設けプロトコルは、通路10よりも1つ大きい胎児試料、標準継代方法を用いて難い偉業から大規模銀行の産生を可能にする。継代hNPCsためのこの方法は、型破りであるが、人気が高まっており、最近では、ヒト胚性及び誘導多能性幹細胞由来の神経幹細胞のような他の細胞型、V INを含む様々な用途のための大規模拡大を可能にしてパブリッシュされた病気のモデリング41-46 itro。重要なことに、cGMPのグレードHNPC細胞バンクは、既に技術は、将来の臨床応用に向けて適用することができることを実証し、チ​​ョッピング方法で製造されている。

<table><tbody><tr><td>ビーカー、50 ml</td><td>フィッシャーブランド</td><td>FB-100-50</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>バイオセーフティ キャビネット、クラス II</td><td>ベーカー</td><td>SG-603A</td><td>4 フィートまたは 6 フィート モデルをお勧めします。複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>ブレード、ダブルエッジ プレップ</td><td>ペルソナ</td><td>74-0002</td><td>複数のメーカー/サプライヤー&nbsp;注意: シャープ</td></tr><tr><td>セル凍結培地</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6295-50ML</td><td>DMSO、無血清</td></tr><tr><td>遠心分離機、15mlインサート付きスイングバケット</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>コニカルチューブ、15 ml</td><td>フィッシャーブランド</td><td>S50712</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>コニカルチューブ、50 ml</td><td>BD ファルコン</td><td>352074</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>制御速度冷凍庫プレー</td><td>ナー</td><td>Kryo 750</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>クライオバイアル、2 ml</td><td>コーニング</td><td>430488</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>培養フラスコ、通気孔、T12.5</td><td>BD ファルコン</td><td>353107</td><td>複数のメーカー/供給</td></tr>業者 <tr><td>培養フラスコ、通気孔、T25</td><td>BD ファルコン</td><td>353081</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>カルチャーフラスコ、ベント付き、T175</td><td>BDファルコン</td><td>353045</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr>カル<tr><td>チャーフラスコ、ベント付き、T75&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353110</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>フィルター、0.22 & マイクロ;m、付属のカップ、1 L</td><td>ミリポア</td><td>SCGPU11RE</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>フィルター、0.22&マイクロ;m、付属のカップ、150 ml</td><td>ミリポア</td><td>SCGVU01RE</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>フィルター、0.22&マイクロ;m、付属のカップ、500 ml</td><td>ミリポア</td><td>SCGPU05RE</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>フィルター、0.22&マイクロ;m、付属カップ、50 ml</td><td>ミリポア</td><td>SCGP00525</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>濾紙、8.5 cm 円</td><td>Whatman/GE</td><td>1001-085</td><td></td></tr><tr><td>鉗子、標準パターン - 鋸歯状/湾曲/18 cm</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11001-18</td><td></td></tr><tr><td>冷凍室、イソプロピル アルコール</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>"Mr. Frosty"</td></tr><tr><td>インキュベーター、37 °;C/5% CO2</td><td>Forma</td><td>370 series</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>血球計算量計、Phase</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Lafayette Instruments</td><td>TC752-PD&</td><td>nbsp;ペトリ皿の改造が必要です。&nbsp;&nbsp;ご注意:&nbsp;動く、鋭い刃。</td></tr><tr><td>マイクロピペッター、1-10 &mu;l</td><td>ギルソン</td><td>F144562</td><td>複数のメーカー/供給者</td></tr><tr><td>マイクロピペット、100-1,000 &mu;l (スターターキット)</td><td>ギルソン</td><td>F167700</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>マイクロピペット、2-20 &mu;l (スターターキット)</td><td>ギルソン</td><td>F167700</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>マイクロピペッター、20-200 &mu;l (スターターキット)</td><td>ギルソン</td><td>F167700</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>ナットドライバー、オートクレーブ可能、5/16インチ</td> <td>ステリツール</td><td>10302</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット、綿目抜き</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-678-8B</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>ペトリ皿、ガラス、オートクレーブ可能</td><td>コーニング</td><td>3160-100</td><td></td></tr><tr><td>ピペットエイド</td><td>ドラモンド</td><td>4-000-101</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>シムディスク</td><td>マクマスター・カー</td><td>変数</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>滅菌バリアピペットチップ、10 &mu;l</td><td>AvantGuard</td><td>AV10R-H</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>滅菌バリア ピペット チップ、1,000 &mu;l</td><td>AvantGuard</td><td>AV1000</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>滅菌バリアピペットチップ、20 &mu;l</td><td>AvantGuard</td><td>AV20-H</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>滅菌バリア ピペット チップ、200 &mu;l</td><td>AvantGuard</td><td>AV200-H</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>滅菌済み使い捨てピペット、オールプラスチックラップ、10 ml</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-676-10J</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>滅菌済み使い捨てピペット、オールプラスチックラップ、2 ml</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-675-3C</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>滅菌済み使い捨てピペット、オールプラスチックラップ、25 ml</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-676-10K</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>滅菌済み使い捨てピペット、オール プラスチック ラップ、5 ml</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-676-10H</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>滅菌ポーチ、19 x 33 cm</td><td>Crosstex</td><td>SCL</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>ストレーナー、40 & マイクロ;m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>組織培養皿、60 mm</td><td>BD Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>チューブラック、インターロッキング 4 ウェイ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>03-448-17</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>フィッシャーブランド</td><td>S52602Q</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>神経前駆細胞 細胞特異的処理試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>神経幹細胞拡張媒体(ステムライン)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>S3194-500ML</td>ステ<td>ムラインブランドを使用する上で重要</td></tr><tr><td>組換えヒト上皮成長因子(EGF)</td><td>ミリポア</td><td>GF316</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>組換えヒト白血病抑制因子(LIF)</td><td>ミリポア</td><td>LIF1010</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>トリパンブルー(0.4%)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>T8154-100ML</td><td>複数のメーカー/サプライヤー</td></tr><tr><td>TrypLE Select (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>12563-011</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト神経の集合体のためのcgmp適用可能な展開法は、幹細胞および前駆細胞は、多能性幹細胞や胎児の脳組織由来

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

研究実験および臨床試験のための単一の試料から多数の細胞を蓄積するための細胞増殖技術が大幅に幹細胞のコミュニティに利益をもたらす。現在の多くの拡張方法は、労力を要し、高価であり、かつ完全な解離を伴うものは、いくつかの幹細胞および前駆細胞型の分化または早期老化を受ける可能性があります。これらの問題を克服するために、我々は、簡単かつ安価である「チョッピング」と呼ばれる自動化された機械的な継代方法を開発した。この手法は、単一の細胞に化学的または酵素的解離を回避し、代わりに一定の細胞/細胞接触を維持中断、スフェロイド培養の大規模な拡張が可能になります。チョッピング方式は、主に胎児脳由来の神経前駆細胞又はニューロスフィアのために使用されており、最近では、胚及び誘導多能性幹細胞由来の神経幹細胞で使用するために公開されている。プロシージャinvolvES組織培養ペトリ皿にニューロスフェアを播種し、その後効果的に手動で機械的に球を解離させる退屈なプロセスを自動化するセルを鋭い、無菌刃を通す。培養中で細胞を懸濁する良好な表面積対体積比を提供する。 50万の細胞は直径が0.5mm未満の単一神経球内で成長させることができるように。 1 T175フラスコ中に、5000万個以上の細胞でのみ1500万接着培養中に比べて懸濁培養で成長することができます。重要なのは、チョッピング手順は、臨床グレードの細胞産物の大量量産を可能とする、現在の適正製造基準（cGMP）の下で使用されています。

<img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51219/51219fig5highres.jpg" width="500" /> 図5。代表的なデータ。A）は、チョッピングメソッドを介して継代したニューロスフェアに比べて酵素的解離を使用して接着単層として解凍し、拡大し、P19で凍結hNPCsの細胞数を予測した。細胞はP20で解凍したとき、0日目に表しています。B）は球の代表的な画像を事前にチョップ、球後CHOP、10X、D）色見本は、メディアのコンディショニングの範囲を記述するために使用されるのcGMPの10倍。C）代表的な画像比較可能なプロトコルをサポートします。E）1日のためにプレーティングし、ネスチン（赤）の発現について染色した解凍されたP29のhNPCsの免疫細胞。ヘキスト核対比染色（青<strong...

このプロトコルは、単一の細胞懸濁液に解離することなく、球状の神経幹細胞および前駆細胞集合体の拡大を可能にする新たな機械的なチョッピング方法が記載されている。細胞/細胞接触を維持することは、40以上の継代するための迅速かつ安定的な成長を可能にします。

ヒト神経の集合体のためのcGMP適用可能な展開法は、幹細胞および前駆細胞は、多能性幹細胞や胎児の脳組織由来

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

本実験の全体的な目的は、培養細胞の寿命を通じて細胞間の接触を維持しながら、ニューロスフェアを効率的に継代させることです。この手法により、ヒト神経前駆細胞に必要な拡大条件が作成されます。具体的には、同一細胞を含む最大2本のT 175フラスコの内容物を合わせてコニカルチューブに移し、第2ステップとしてニューロスフェアをペトリ皿に転移させます。これにより、懸濁したニューロスフェアがペトリ皿上で管理可能な塊状に凝集するため、ブレードを用いてhNPCsを小さなクラスターに切断することが可能になります。次に、継代または細切（チョッピング）したニューロスフィアを再懸濁させ、ペトリ皿から細胞を回収して新しいフラスコに分注します。その結果、標準的な酵素法による継代細胞と比較して、細切法による拡大曲線が長期的な対数増殖率を示し、長期的な増殖戦略として有効であることが示されました。球体としてのこの手法の視覚的な実演は非常に重要です。凝縮の手順を文章で説明することは困難です。また、このプロセスを補助するためのいくつかのコツがあります。シャーレから過剰な培地が完全に除去されていない場合、球体は小さなクラスターに分割されず、単に培地の中で押し動かされるだけになります。まず、H NPCsが入ったフラスコの培地の色を確認することからこの手順を開始します。顕微鏡下でフラスコ内をスキャンし、細胞を観察します。可能であれば、ラジカルを用いていくつかの球体のサイズを検査してください。直径が300 µm以上の球体が多数認められる場合は、チョッピング工程に進み、7〜10日ごとに細胞をチョッピングします。その後、フラスコをインキュベーターに戻し、チョッパーをセットアップします。チョッパーの電源スイッチをオンにします。BSC内で、チョッピング厚さを200 micrometersに、ブレードフォースを180度または9時方向に設定します。次に、自動速度ノブが可能な限り反時計回りに回転していることを確認してください。その後、テーブルリリースノブを可能な限り右に動かし、プレートホルダーが安定していることを確認します。マニュアルアームマニピュレーターを時計回りに回転させ、アームを最大レベルまで上げます。その後、滅菌済みの両刃チョッピングブレードを無菌的にチョッパーアームボルトに取り付けます。ピンセットを用いて、ブレードの上にクラスプを配置します。クラスプの湾曲した部分をアームの上端に重ねます。次に、クラスプをアームに押し当て、ボルトにナットを固定します。滅菌済みのナットドライバーを使用し、ナットを4分の1回転分緩めた状態で保持します。この手順では、規定量の維持培地を新しいフラスコに移します。その後、インキュベーターからBSCへ細胞を無菌的に移動させます。フラスコをチューブラックに立てかけ、スフィアをフラスコ内で沈降

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神経科学

ヒト神経幹細胞を継代

捨てられた人間の胎児皮質組織から神経幹細胞の単離および培養上シンプルで信頼性の高い方法が記載されている。既知のヒト神経疾患から派生した培養物は、病理学、細胞及び分子過程の特性だけでなく、薬理学的有効性を評価するためのプラットフォームを提供するために使用することができます。...

廃棄されたヒト胎児脳組織から神経幹細胞の生成

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Multititreプレートフォーマットでヒト多能性幹細胞から神経細胞の迅速かつ効率的な生成

このビデオは、非トランスジェニックおよびトランスジェニックヒト多能性幹細胞(hPSC)から神経前駆細胞を生成する方法を示しています。hPSCは、ニューロン分化培地を使用して神経前駆細胞に分化されます。非トランスジェニック細胞では低分子を用いて分化が誘導されますが、トランスジェニックhPSCは、ニューロン分化特異的な転写因子のプロモーターを誘導する抗生物質を添加することで分化します。...

非トランスジェニックおよびトランスジェニックヒト多能性幹細胞の神経前駆細胞への分化

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ヒト多能性幹細胞から終脳のグルタミン酸作動性ニューロンの仕様

人工多能性幹細胞の生成は、自家移植の導出のための魅力的な展望を提供しています。しかし、多能性状態と面倒な再分化の進行はまだ臨床の翻訳を妨げます。ここでは、成人のヒト線維芽細胞の誘導および誘導神経前駆細胞への直接変換と神経系統へその後の分化を説明します。...

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

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ここで外傷に影響を与えるに関連するタイム スケール上の 96 ウェル形式でストレッチ損傷の人間の in...

人間の高速ストレッチ損傷法による 96 ウェル形式で多能性幹細胞由来神経細胞

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ひと多能性幹細胞からのニューロンとアストロ サイトの三次元共培養系によるシナプス局所回路におけるモデリング

このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞の制御されたサイズ凝集体を産生し、単一使用バイオリアクターを使用して化学的に定義されたフィーダーフリー条件下で小脳オルガノイドの分化をさらに刺激する動的培養システムを記述する。...

ヒト多能性幹細胞からの成熟小脳オルガノイドのスケーラブルな生成と免疫染色による特徴付け

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3次元浮遊バイオリアクターにおけるヒトニューロゲニン2誘導性ニューロンの生産

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ヒト神経の集合体のためのcGMP適用可能な展開法は、幹細胞および前駆細胞は、多能性幹細胞や胎児の脳組織由来

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