ヒト神経の集合体のためのcGMP適用可能な展開法は、幹細胞および前駆細胞は、多能性幹細胞や胎児の脳組織由来

次の実験の全体的な目標は、培養細胞の寿命を通じて細胞間接触が維持されるように、ニューロスフェアを効率的に通過させることです。この技術は、ヒト神経前駆細胞に必要な増殖条件を作り出します。これは、同じ細胞の最大2つのT 1 75フラスコを組み合わせ、円錐管に移すことで、球体をペトリ皿に移すことができ、第2のステップとして球体をペトリ皿に移すことができ、浮遊神経球に凝縮されてペトリ皿上の扱いやすい塊になり、ブレードがH NPCを小さなクラスターに切断することができます。

次に、継代または刻まれたニューロスフェアを再懸濁して、細胞をペトリ皿から取り出し、新しいフラスコにクワットします。チョッピング技術が、標準的な酵素的アプローチを介して継代された細胞と比較して長期的な対数成長率を示す膨張曲線に基づく長期的な成長戦略を提供することを示す結果が得られます。この手法を視覚的に示すことは、球体として重要です。

結露のステップは、書面で説明するのが難しいです。このプロセスを支援するためのいくつかのトリックもあります。余分なメディアがペトリ皿から完全に除去されていない場合、球体は小さなクラスターに分割されるのではなく、メディア内で単に押し出されます。

この手順は、H NPCのフラスコの培地の色に対処することから始め、顕微鏡でフラスコを通し、細胞を観察します。可能であれば、ラジカルを使用して、いくつかの球のサイズを調べます。

直径が300マイクロメートル以上の球体が多い場合は、7〜10日ごとに細胞を刻むことで、チョッピングを進めます。次に、フラスコをインキュベーターに戻し、チョッパーをセットアップします。チョッパーの電源スイッチをオンにします。

BSCでは、チョッピング厚さを200マイクロメートルに、ブレードの力を180度または9時の位置に設定します。次に、自動速度ノブができるだけ反時計回りに回転していることを確認します。次に、テーブルリリースノブをできるだけ右に動かし、プレートホルダーが安定していることを確認します。

手動アームマニピュレーターを時計回りに回して、アームを最大レベルまで上げます。その後、滅菌済みの両刃チョッピングブレードをチョッパーアームボルトに無菌的に移します。一対の鉗子を使用して、鉗子を使用して留め金をブレードの上に置きます。

留め金の湾曲部分は、アームの上端より上にある必要があります。次に、留め金をアームに保持し、ナットをボルトに固定します。滅菌ナットドライバーがナットを四分の一回転させたまま、緩みます。

この手順では、推奨量のメンテナンスメディアを新しいフラスコに移します。その後、細胞をインキュベーターからBSCに無菌的に移します。フラスコをチューブラックに立てかけ、球体がフラスコに落ち着くまで待ちます。

1つは落ち着きました。最大12ミリリットルの上澄みを熱望した。10ミリリットルの血清ピペットで、フラスコの表面から緩く付着した球体をすべて洗い流します。

必要に応じて繰り返し、球体がレン間に落ち着くのを待ちます。次に、推奨量のコンディショニングされたメディアを新しいフラスコに移します。次に、残りのすべてのコンディショニングメディアと球体を新しい15ミリリットルの円錐管に移します。

球体が落ち着くのを待って、使用済みのフラスコを捨てます。その後、15ミリリットルの円錐管から60ミリメートルのペトリ皿またはシムディスクに細胞を最小の体積でゆっくりと移します。残りのコンディショニング培地は、ポストチョップのディッシュから細胞をすすぐために使用されるため、保管しておいてください。

皿の上のメディアと球体が覆う表面積を最小限に抑えるようにしてください。次に、スーパーナチンを15ミリリットルの円錐管に戻すことにより、球体プールの凝縮を開始します。エアロゾルバリアチップ付きマイクロピペッターを使用して、培地セルプールの上部からできるだけ多くの培地を取り除きます。

球体のないメディアを削除できなくなるまで、プールを広げます。ピペットチップの側面を使用して表面積を増やし、ペトリ皿を少し傾け、ピペットチップの側面を使用して、すべての球体をプールの片側にゆっくりとスライドさせます。すべての細胞が再配置されたら、ペトリ皿をゆっくりと反対方向に傾けて、培地が球体から分離できるようにします。

その後、クリアしたメディアを15ミリリットルの円錐管に戻します。ピペットチップの側面を使用して、すべての球をペトリ皿の中央にゆっくりとスライドさせて戻します。したがって、プールの直径は0.5〜2.4センチです。

球体プールの深さを浅く保つことが重要です。プールが深すぎると、チョッピング中に球体が脇に押しやられます。次に、ペトリ皿をプレートホルダーに移し、プレートホルダーフックの下に固定します。

テーブルリリースノブを使用してプレートホルダーを左にスライドさせ、ブレードが球体から離れてギアにロックされるようにします。次に、手動マニピュレーターノブを時計回りに回して、ブレードがペトリ皿に平らにカチッとはまるまでチョッパーアームを下げます。ナットを締めながらアームマウントを押し下げます。

次に、リセットボタンを押します。自動アームマニピュレーターノブを時計回りに90度または12時の位置に回しながら片手でペトリ皿を安定させ、すべての球が切り刻まれたら切り刻み始めます。プレートホルダーを90度回転させます。

次に、ボルトを緩め、アームを下げてナットを締め直します。チョッピング手順を繰り返します。その後、無菌的に、ペトリ皿をプレートホルダーからBSCの作業スペースに移します。

1ミリリットルのコンディショニングメディアを刻んだ球体に移します。次に、刻んだ球体を静かに再懸濁し、新しい15ミリリットルの円錐管に移します。気泡の形成を避け、刻んだ球を集めるのに必要な回数だけ繰り返してください。

コンディショニングされたメディアとチョップド球の体積を測定します。適切な量のメンテナンス メディアを追加して、表 2 列 E の推奨容量を達成します。その後、球体サスペンションを新しい各フラスコに Eloqua して、球体サスペンションを一度に 1 つのフラスコにのみ移し、転送間で球体を再懸濁します。各フラスコの最終容量は、表2列Fの推奨容量と等しくなければなりません。刻んだh NPCをインキュベーターに入れます。

この図は、継代19で凍結され、その後、酵素解離を使用して接着性単層として解凍および増殖したH NPCの投影細胞数を、チョッピング法で継代したニューロスフェアと比較して示しています。これは、10 倍の倍率で刻まれた球体と刻まれた球体の代表的な画像です。この画像は、1日間プレーティングされ、巣と発現のために染色された融解通路29 H NPCを示していますが、この画像は、成長因子なしで7日間プレーティングされ、GFAPおよびベータ3チューブリンについて染色された解凍通路29 H NPCを示しています。

このビデオを見れば、細胞と培養の寿命を通じて細胞間の接触を維持するHBCを継代するための自動チョッピング技術の使用方法を十分に理解できるはずです。この手順は、多能性細胞に由来する神経幹細胞やカーディオスフィアなど、多数の細胞タイプに適応させることができます。