骨 - インプラントアンカレッジ評価するために改良された機械的試験方法

この手順の全体的な目的は、新しく形成された修復骨の候補インプラント表面への定着性と安定性を評価することです。これは、まず2つのカスタムチタンインプラント群を作成することで達成されます。一方の群には、下地のマイクロトポグラフィーを形成するための標準的なグリットブラスト処理を施し、もう一方の群には、同じグリットブラスト処理に加えて、リン酸カルシウムナノ結晶を積層させます。

第2ステップでは、雄のWistarラットの大腿骨遠位部にインプラントを植え込み、9日間経過した時点で大腿骨を回収します。次に、大腿骨を洗浄し、インプラントの両側に皮質骨のアーチを残すように、周囲の骨をインプラントの幅に合わせてトリミングし、力学的試験用の試験片を作成します。最終ステップでは、カスタムブレイクアウェイモールドを用いて、試験片を流動性歯科用コンポジットに埋め込みます。これにより、インプラント周囲骨を0.5 mm分だけ分離させ、これらの試験片を用いて力学的試験を実施します。

最終的に、機械的試験の結果は、候補となるインプラント表面が、新しく形成された修復骨の固定面として機能する能力を評価するものです。この手法を用いることで、ナノスケールの骨結合から粗いミクロンスケールの骨進入に至るまで、インプラント表面トポグラフィーの異なるスケール範囲が、骨固定の様々なメカニズムに及ぼす重要性を実証することが可能です。本技術は、新しく形成された修復骨のための固定面など、候補となる表面設計の効果を測定するのに特に適しています。

これにより、機械的試験領域をインプラント表面から0.5 mm以内に限定することができます。本手法は、インプラント表面の設計に応じた骨形成への影響について知見を得ることができ、また他の金属、セラミック、ポリマー製インプラント材料にも適用可能です。本手順を開始するには、純チタンを用いて長方形のチタンインプラントを作製し、長軸方向に沿って中心に穴をドリルで開け、付属のテキストプロトコルに記載されている通りにインプラント用の表面処理を行います。その後、部分的なランダム化により、インプラントを左大腿骨と右大腿骨にそれぞれ1つずつ割り当てます。

これにより、各種類のインプラントが1つずつ同一の個体に配置されることが保証され、統計解析の最適化が可能になります。すべての動物実験と同様に、本手順の実験を開始する前に、地域の動物ケア委員会からプロトコルの承認を得てください。手術時に体重が200から250gとなる若いWistarラットを用意します。

導入には吸入麻酔を用い、ラットを1匹ずつ鎮静させます。まず、1 L/minの流量の酸素中で4% isof fluorineを投与します。その後、1 L/minの一酸化二窒素と0.6 L/minの酸素の混合気の中で2% isof fluorineを使用します。

鎮静状態を維持するため、処置を継続する前に標準的な足指でのピンチテストを行い、効果的に鎮静されているかを確認します。完全に鎮静された後、両眼に人工涙液軟膏を塗布し、ブプレノルフィンを0.01〜0.05 mg/kgの用量で皮下注射し、術前鎮痛薬を投与します。次に、各後肢の前外側を剃毛し、10% Betadineと70% ethanolを交互に3回使用して手術部位を消毒します。

処置中の低体温症を防ぐため、ラットを温水循環パッドの上に置く。15番の手術用メスを用いて、皮膚を切開し、大腿部の外側面に沿って切開して筋肉を露出させる。次に、鈍的剥離を用いて低侵襲に筋腹を退け、大腿骨遠位端を露出させる。

次に、骨膜エレベーターを使用して大腿骨を覆っている薄い骨膜層を掻き取り、穿孔のための皮質骨を完全に露出させます。鈍的に剥離する際や骨膜を除去する際に、成長板や膝関節の関節軟骨を損傷しないよう注意してください。大腿骨の洗浄と確認が完了したら、大腿骨を外側に回転させ、遠位大腿骨の前面を露出させます。

また、ドリリング中の組織の過熱を防ぐため、組織を洗浄するための十分な滅菌生理食塩水を用意しておいてください。ドリリング前に、キャリパーを用いて大腿骨の中線に沿って2.5 millimeters間隔で2つの穴の位置を測定します。次に、1.3 millimeterの歯科用バーを歯科用ハンドピースに取り付け、前方の皮質骨を穿孔して穴を作成します。続いて、1.3 millimeterのツイスト歯科用バーをハンドピースに取り付け、大腿骨の反対側の皮質骨まで穴を貫通させ、双皮質的な平行穴を作成します。

最後に、ツイストバーをカスタムサイドカッティングバーに交換し、近位から遠位方向に向かって穴を連結させ、インプラントの埋設部位を形成します。欠損部の形成が完了したら、付属の針を使用して生分解性縫合糸を開口部に通し、大腿骨の外側皮質に沿って戻します。その後、縫合糸の自由端にインプラントをに通し、欠損部へと導いて圧入します。

術後の回復期および治癒の初期段階においてインプラントの安定性を確保するため、大腿骨の外側に縫合糸を縛ります。残りの縫合糸を用いて筋肉組織を閉鎖し、その後、外科用ステープラーを使用して皮膚組織を再配置します。最後に、皮下注射により術後鎮痛剤を投与します。

手術部位に感染の兆候がないかを確認し、動物を毎日観察する。歩行機能が完全に回復しなかった動物、および安楽死時に大腿骨骨折が認められた動物は除外する。安楽死後、大腿骨を取り出し、周囲の軟組織を除去して骨を洗浄する。組織の水和状態を維持するため、直ちに15% sucrose緩衝液に保存する。

機械的試験の準備として、識別のために外側のアーチに油性マーカーで細い黒線を引きます。次に、高速回転システムに取り付けた円筒形ダイヤモンドバーを用いて、インプラントの幅に合わせて骨を削り出します。最終的な試験片は、インプラントの両面に固定された2つの骨アーチで構成されます。

すべての試験において、ロードセルを備えた機械的試験装置を使用し、動作速度を30 millimeters per minuteに設定します。準備中または試験片への運搬中に脱落したアーチには、試験値として0 newtonを割り当てます。まず、試験片をカスタムメイドのブレークアウェイモールドに配置し、モールドの後面に安定化プレートを置いて固定します。

次に、皮質骨アーチをフローアブル歯科用コンポジットで囲み、サファイアプラズマアーク高強度キュアリングライトを使用してコンポジットを60秒間光重合させます。この設計により、一貫した試験を行うためにインプラント周囲骨の0.5 millimeterの領域を単離することが可能になります。重合後、型を開き、硬化した試料ブロックを取り出します。

次に、あらかじめ作製した試験片のレプリカを万力に固定し、ユニットをインストロンのベース中央に配置します。その後、試料を万力のネジ部に配置し、10ポンドのナイロン製釣り線をインプラントに通して、緩んだ末端を可動クロスヘッドに取り付け、システムに試料を固定します。一貫性を保つため、常に外側からラベルを貼り、先に試験してください。次に、前述と同様に、破損するまでクロスヘッドを分速30 millimetersで試料から遠ざかるように移動させます。

骨がインプラント表面から剥離したら、この工程を内側アーチでも繰り返し、その後、解剖顕微鏡を用いてインプラント表面を観察します。ここでは、リン酸カルシウムナノ結晶を添加した場合と添加しなかった場合の、グリットブラスト処理済みインプラント表面のSEM画像を示しています。修飾されたナノ表面は10,000倍では対照群の表面と同様に見えますが、100,000倍で観察すると、リン酸カルシウムナノ結晶によって形成された重ね合わせのナノトポグラフィーが非常に明確になります。

代表的な強制変位曲線がここに示されています。赤線は微小地形的に複雑な表面を、黒線はリン酸カルシウムナノ結晶を積層させたインプラントを表しています。リン酸カルシウムのサブミクロン地形的特徴を追加した表面は、未修飾の微小地形を持つ表面よりも、破壊力が有意に高い結果となりました。

機械的試験後の破断面を分析したところ、流動性歯科用コンポジットで骨を封入したサンプルの92%が、目的のインプラント領域内で破断しました。この手順を行う際は、試験片が極めて小さく軽量であるため、ポッティング時に細心の注意を払うことが重要です。正確に配置することが困難であるため、歯科用コンポジットを適用する前に、すべてを適切に整列させる必要があります。

本手順の後、走査電子顕微鏡による後方散乱電子像などの高度なイメージング手法を用いることで、骨とインプラントの相互作用に関するさらなる疑問に対し、著しく高い倍率で解析を行うことが可能です。