電子クラ​​イオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化

この手順の全体的な目標は、C 2のミトコンドリアタンパク質の構造と組織を決定することです。これは、最初にサンプルを含む凍結水和電子顕微鏡グリッドを生成することによって達成されます。次に、サンプルの線量制限チルトシリーズを電子クライオ顕微鏡で記録します。

次に、チルトシリーズが処理されて断層撮影ボリュームが生成されます。最後に、タンパク質密度を平均化してタンパク質の構造を決定し、膜をセグメント化してその3D構造を明らかにします。タンパク質の平均をトム・グラハムスに再配置することにより、膜内のタンパク質の構造と構成が明らかになります。

そこで、ミトコンドリアの電子線トモグラフィーを行うのは、ミトコンドリアが分子レベルでどのように機能するかを理解したいからです。この手法が、薄いプラスチック切片の電子顕微鏡などの他の方法よりも優れている主な利点は、分解能が高いことです。材料は化学的に固定されておらず、タンパク質の分子詳細が保存されています。

電子暗号法の技術は習得するのに時間がかかる場合がありますが、経験豊富なユーザーは、セッションごとに5〜6個の高品質のTOMグラウンドを取得できます。手順の最も困難な部分は、最適な氷の厚さの凍結水和グリッドを生成することです ミトコンドリアを単離し、ペレットした後、テキストプロトコルに従って、10ミリモルのHEPA緩衝液中に250ミリモルのTトリオースを使用して、ペレットを総タンパク質グロー放電のミリリットルあたり約5ミリグラムの濃度に再懸濁します。完全にカーボンEMグリッドは、製造元の指示に従って真空装置内でカーボン側を上にし、液体窒素冷却アルミニウム容器の内側にエタンガスの流れを向けることにより、数ミリリットルのエタンを液化します。

ピンセットを使用してグロー放電DMグリッドをピックアップし、ミトコンドリア懸濁液と1対1でベンチミックスタンパク質、共役金基準懸濁液に置き、すぐに3マイクロリットルの溶液をグリッドに適用します。次に、ピンセットを自家製ギロチンなどのガラス化装置に置き、濾紙のくさびでグリッドから余分な液体を吸い取り、トリガーを放してグリッドをすぐに液体エタンに突入させます。次に、グリッドを液体エタンから液体窒素に移します。

新しい濾紙のくさびの先端を液体エタンに配置して、グリッドから余分なエタンを取り除きます。液体が上昇するにつれて、グリッドを濾紙の上にゆっくりと引きずり上げ、液体の前面の下に保ち、すぐに液体窒素に移して後で使用するために保管します。グリッドをグリッドボックスに入れ、液体窒素充填ドーアーに保管して、断層撮影の傾斜シリーズを記録します。

まず、液体窒素処理者が満杯になっていることを確認し、試料ステージとグリッド転送装置の温度が100ケルビン未満であることを確認します。テストグリッドの画像を取得し、とげのリングの品質を確認して、電子顕微鏡が適切に位置合わせされていることを確認します。次に、凍結した水和ミトコンドリアのグリッドを挿入します。

次に、検索モードで、適切な氷の厚さと標本の品質の領域を検索します。有望なエリアの 6 秒間の検索画像を撮影して、データ収集の適合性を判断します。良好な試料領域を見つけたら、ステージを±60度傾けて、グリッドバーや近くの氷で満たされた外観の穴にある氷の結晶によって露出または焦点領域を遮ることなく利用可能な最大傾斜範囲を決定し、露光モードに変更して、ビーム強度または画像取得時間を調整します。

したがって、記録された各画像の電子線量は、CCDの場合はピクセルあたり30〜50電子、またはピクセルあたり毎秒6〜8電子です。直接電子検出器の場合、0 度で取得した 1 秒間の画像の平均電子カウントを空のホール上の 60 度画像の平均電子カウントで割ることにより、線量分布比 (I ゼロ オーバー I 60) を計算します。露光モードで1秒間の画像を取得し、オングストロームの2乗あたりの電子数に注意してください。

線量分布比を考慮し、適切な自動データ収集ソフトウェアを使用して、特定の全電子線量について記録できる画像の総数と傾斜間隔を計算します。Tom Agramをセットアップして録音し、一般的なトモスを決定したパラメーターを使用します。これらのサンプルでは、プラスマイナス20度から始めて、0度を経て高傾斜に達します。

トモスを作成してセグメント化するには、チルトシリーズを再構築ソフトウェアに適したファイル形式に変換します。Im modのようなTom Graham再構築プログラムを使用して、金の基準マーカーの位置をマークして画像を位置合わせします。整列したら、Tommo Grahamを生成します。

IM oで分散された非線形等方拡散フィルターなどの画像フィルターを使用して、tommo Grahamのコントラストを高めます。市販のプログラムを使用して、トムを手動でセグメント化します。インナーメンブレンとアウターメンブレンに対応するボクセルを別々のレイヤーに割り当てたら、メンブレンを可視化するためのサーフェスを作成します。

emiraのEMパッケージプラグインのクリッカーオプションを使用して、マークされた粒子を入力として使用し、粒子推定などの適切なソフトウェアパッケージを使用して、TPシンターゼ粒子の位置をマークします。電子線トモグラフィープログラムの場合、分解能推定のためにアグラム平均を計算します。無料の可視化プログラムを使用して、独立して決定された2つのサブトンモ平均間のホワイエシェル相関を計算します。

キメラは、既知のX線構造を最初に手動でサブトムアグラム平均にフィットさせ、次にこの図に見られるように自動的にコマンドフィットで、ミトコンドリアの電子叫びの膜を手動でセグメンテーションすると、ミトコンドリアのクリスティの構造が明らかになります。特定のタンパク質を欠く酵母ノックアウト株のミトコンドリアをイメージングします。これらのタンパク質がChristiの形態に及ぼす影響を評価することができます。

ここに示されているのは、TP合成二量体の形成に必要なTP合成サブユニットEを欠く酵母株のミトコンドリアです。野生型ミトコンドリアの通常のララクリスティとは異なり、これらの細胞小器官には、クリスティが存在しないか、小さなバルーン型の膜陥入を含む多数の内膜構造が含まれています。コントラストの良いイングラムでは、A TP Synthesダイマーは黄色の矢印で示されているように簡単に見えます。

膜をセグメント化することにより、黄色の球で表されるA TP合成の位置を、Christiの形態に関連して視覚化できます。この場合、A TP合成は、Lo Meer Christi Sub tommo平均化の高度に湾曲したエッジに沿って二量体の列を形成することで、タンパク質の構造を4ナノメートル以上の分解能で決定することができます。既知のX線構造をサブトモグラハムに当てはめることにより、天然環境のタンパク質複合体の平均原子モデルを見られるように組み立てることができます。

この例では、平均体積をトモグラハムに戻すことで、個々の複合体の互いに、および膜内の他のタンパク質複合体に対する組織化を補助してもよい。私たちのプロトコルは、電子クライオトモグラフィーを使用して、ミトコンドリア内膜内のタンパク質複合体の構造と組織を決定する方法を示しています。このプロトコルは、異なる細胞コンパートメント内の他の膜結合タンパク質の構造および組織を決定するためにも使用できます。

サンプル調製は、優れたサーモグラムを取得するための鍵です。凍結された水和グリッドには、厚さ70〜150ナノメートルの完全なガラス質の目が含まれている必要があります。通常、最適な氷の厚さと試料の品質の領域が見つかるまで、5〜6つのグリッドをスクリーニングします。

グラムの収集には、専用のクライオステージとエネルギーフィルターを備えた300キロボルトの透過型電子顕微鏡と、直接電子検出器を備えたカメラが最適ですが、サイドエントリーのクライオステージとCCDカメラを備えた200キロボルトの装置も使用できます。このビデオを見た後、あなたはcry mグリッドを準備する方法をよく理解しているはずです。傾斜列を収集し、サーモグラムを再構築し、サブトモ平均を計算します。

これらは、細胞内のタンパク質の組織化が、効率的なA TP合成などの生物学的機能を実行するその細胞の能力にどのように影響するかを調査するために必要な基本的なスキルです。液体窒素と液体イーサンでの作業は非常に危険であり、安全メガネと手袋を常に着用する必要があることを忘れないでください。