Name: 電子クライオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 学ぶ電子クライオトモグラフィーによるミトコンドリアのATP合成酵素二量体の構造解析手法。凍結含水グリッド調製からチルトシリーズ記録、トモグラム再構成までの詳細なプロトコルを解説し、生体内タンパク質の高解像度可視化を実現します。

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この作品は、マックス·プランク協会（KMD、BD、AWM、結核、TBB、DJM、およびWK）、ドイツ学術振興（WK）とポスドクEMBO長期の資金優秀フランクフルト「巨大分子複合体」のクラスタによってサポートされていましたフェローシップ（VAMG）。

ディファレンシャル遠心分離によって細胞または組織からのミトコンドリアの調製ここでは、さまざまな真核生物から無傷ミトコンドリアの単離のための一般的な手順を説明します。正確な緩衝成分および遠心分離速度は、試験した各組織/種のために最適化される必要がある。 <ol><li>単一の等張緩衝液（ 例えば 、250mMスクロース、10mMのHEPES pH7.4）中、ガラスビーズミル（真菌の菌糸体）28を用いて、細胞壁（ サッカロミセス·セレビシエ ）29の酵素消化、ボールベアリングホモジナイザー（中の細胞を破壊-cell真核生物/培養細胞/線虫）30、またはブレンダー（動物または植物組織）31。 </li><li>低速遠心分離（2,000×gで、4℃、10分）、続いて、モスリンを通して濾過することにより細胞破片を除去。 </li><li> 9,000×gで、4℃（高速遠心分離によって上清とペレットミトコンドリアを集め、10分）。 </li><li>必要な場合には、ミトコンドリア分画32の追加的な精製の ​​ために等張濃度ステップ勾配を使用しています。 </li></ol>電子クラ​​イオトモグラフィーのためのミトコンドリアの調製次のセクションでは、クライオ-ETのために凍結水和サンプルを取得する方法について説明します。注：この方法は、重篤な皮膚の薬傷を引き起こす可能性が非常に冷たい液体窒素及びエタンの使用を含む。安全ゴーグルと低温保護手袋を着用する必要があります。また可燃性液体エタンは、ドラフト内で処理する必要があります。 <ol><li> 250mMのトレハロース、約5 mg / mlの全タンパク質の濃度pH7.4の10mMのHEPES緩衝液中でペレットを再懸濁ミトコンドリア。 </li><li>グロー放電穴あきカーボンEMグリッド、製造業者の説明書に従って、真空装置中の炭素面を上に、。 </li><li>液体窒素クールの内側にエタンガスの流れを導くことによりエタンの数ミリリットルを液化アルミニウム容器を編</li><li>ミトコンドリア懸濁液を1、すぐにピンセットで開催されたグロー放電のEMグリッドに3μLを適用します。プロテインAコンジュゲート金基準サスペンション1を混ぜる。 </li><li>ガラス化装置、 例えば 、自家製ギロチンでピンセットを置きます。濾紙のウェッジ（〜5秒または液体の拡散が停止するまで）、すぐにトリガーを解放することによって、液体エタンにグリッドプランジ過剰な液体を吸い取る。 </li><li>液体窒素中に液体エタンからグリッドを転送します。転送中、濾紙でグリッドから余分なエタンを削除します。液体エタンにろ紙のくさび状片の先端を置きます。液体エタンが上昇すると、静かにろ紙までグリッドをドラッグして、液体前面の下に保管してください。液体エタン、毛管作用によってグリッドから除去し、すべての液体エタンを除去した後、直ちに液体窒素中にグリッドを転送している。 </li><li> 、グリッドストレージボックスにガラス化したグリッドを配置しますND必要に応じて、後で使用するために液体窒素下で保管してください。 </li></ol>断層傾斜シリーズの3。録音次のセクションでは、設定およびポストカラムエネルギーフィルタとCCDカメラを搭載したPolara型電子顕微鏡でミトコンドリアの断層傾斜シリーズを収集する方法について説明します。同様のプロトコルは、CCDまたは直接電子検出カメラを装備した全ての電子低温顕微鏡とともに使用される。 <ol><li>顕微鏡の位置を合わせます<ol><li>穴あきカーボン膜上に試験試料例えばグラファイトと金の島を挿入します。 </li><li>顕微鏡の低用量システムで検索モードを選択します。 </li><li>ユーセントリック高さにサンプルを持参してください。試料ホルダーを傾けたときには、最小限のXY移動の見所です。 Z高さを変更することにより、ポイント、0°、チルトで注目点を中心に20度にステージを傾け、再中心地。 0°に戻って、横方向のオフセットが最小になるまで繰り返します。 </li><li>選択する露出モード。断層画像を収集するための所望の倍率を選択してください（検出器上で、 たとえば 25,000Xを≈0.6 nmの試料ピクセルサイズ）。 </li><li>小さ ​​なコンデンサー絞り（50〜70ミリメートル）を選択し、ビームが撮像素子よりもわずか広く、60 Eの画素読み出し与えるようにスポットサイズとビーム強度を選択- /ピクセル（CCD）または14のE - /ピクセル/秒（直接電子検出器、計数モード）。 </li><li>センターコンデンサー絞り。 </li><li>ガウスフォーカスなど、最低限のコントラストのポイントを検索します。製造業者の指示に従って顕微鏡デフォーカス読み取り、正しいピボット点と回転中心をリセット。 </li><li>断層像を記録するために必要なデフォーカスにダイヤルします。注：低いデフォーカス（2-4μm）は、コントラストを犠牲にして解像度が向上し、一方、ハイデフォーカス（8μm）は、コントラストを向上しますが、解像度を低下させる。 </li><li>空孔上に、新たな利得参照を生成し、製造業者のに従って、エネルギーフィルタを揃える指示。 </li><li>検索と露出モードを合わせます。露出モードでは、注目点を中心とモードを検索して切り替えます。セレクト1,500Xの倍率（検出器上の標本の0.033ミクロン/ピクセル）および（増加コントラスト）100μmのデフォーカス。イメージシフトコイルを使用してバック中心までの注目点を持参してください。 </li><li> /ピクセル（CCD）または〜8の電子- -ビームは、撮像装置よりもわずかに広いと〜20の電子の画素読み出し与えるように検索モードでは、スポットサイズ、ビーム強度を調整/ピクセル/秒（直接電子検出器を、モード）を数える。 </li></ol></li><li>グッド標本エリアを見つける<ol><li> （EMの製造元の説明書を参照）、液体窒素温度で電子顕微鏡に凍結した水和ミトコンドリアでグリッドを挿入します。 </li><li>検索モードでは、適切な氷の厚さ及び試料の品質の領域に対してグリッドを検索する。断層収集のための適合性を判断するために有望な分野の6秒の探索画像を取る。ボットhは内側と外側のミトコンドリア膜は、この倍率で表示されるはずです。 </li></ol></li><li>断層傾斜シリーズの録画<ol><li>良い標本領域が見つかると、暴露の障害物なしで使用可能な最大傾斜範囲を決定したり、グリッドバーや氷の塊によって領域を集中する60°±ステージを傾ける。 </li><li> CCDのための/ピクセルまたは6-8電子- -似た外観の近くの氷で満たされた穴には、露出モードに変更し、ビーム強度や画像取得時間を調整して、各記録された画像は、30〜50の電子の電子線量を持って/ピクセル/モードをカウントし、直接電子検出器だ。 </li><li> 60°画像の0°で取得された1秒の画像の平均電子数で割ることにより線量分布比（I 0 / I 60）を計算する。この比率は、（露光時間= 1 / cの傾斜角の増加に伴って、画像当たりの一定の電子数を維持するために必要な露出時間の増加を説明し経口（α）nは （I 0 / I 60）= 2 n）である 。比率も氷の厚さを示す目安となります。ミトコンドリアの良い断層像は通常、I 0 / I 60 = 2.3から2.6で記録されている。 </li><li>空の穴の上に、露光モードでは1秒の画像を取得し、Å2あたりの電子数に注意してください。考慮線量分布比率を考慮して、特定の全電子用量について記録できる画像の総数を計算する（ 例えば 、&lt;40電子-構造決定のための/Å2＆〜160電子-形態のための/オングストローム2）。 </li><li>総チルト範囲を分割することにより断層像収集のための適切な傾斜区間を決定する（ 例えば 、±60°、120°）3.3.4で計算された画像の総数による。 </li></ol></li><li>設定し、適切な自動データ収集ソフトウェア3を使用して、上記決定されたパラメータを持つ断層像を記録3、34。傾斜シリーズは、通常、±20°で開始し、電子線量を増加させることによって破壊された低チルト画像の情報内容を最大化するために高い傾きに到達する前に0°を通過している。 </li></ol> 4。作成と断層ボリュームのセグメンテーションこのセクションでは、ミトコンドリアの断層ボリュームがチルトシリーズとボリュームは、一般的な視聴のため存在しているかから生成される方法について説明します。 <ol><li>適切なディレクトリに、断層傾斜シリーズを保存します。画像スタックを生成し、MRCのスタックに.dm3、.dm4または.TIFファイルを変換するようなdm2mrcやtif2mrc（IMODパッケージ）などのオープンソースソフトウェア、適切なファイル形式に変換します。 MRCスタックは、IMOD 35断層再構成のために必要とされる。その他のパッケージは異なるフォーマットを必要とします。 </li><li> （画像を位置合わせし、IMODのチュートリアルで説明する手順に従うことによって断層画像を生成する<ahref=&quot;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html&quot;&gt;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ). </li><li> IMODと一緒に配布され、非線形異方性拡散フィルタを用いて、断層像のコントラストを高める。このフィルタは、ATP合成酵素などの膜および膜会合粒子に適しています。 </li><li>可視化のために、商業的に利用可能なプログラムを使用して手動でセグメント断層は、アミラを例えば 。内側または外側の膜に対応するボクセルを割り当て、表面を生成します。 AMIRA 36 EM-パッケージのプラグインでのクリッカーオプションを使用すると、ATP合成酵素粒子の位置をマーク。 </li></ol> 5。SubtomogramのATP合成酵素二量体の平均化とX線構造のフィッティング次のセクションでは、ATP合成酵素二量体のsubtomogramの平均を得ることができる方法について説明します。 <ol><li>このような「一部として入力し、適切なソフトウェアパッケージとしてマークされた粒子を使用したエレクトロントモグラフィー」プログラムのICLE推定、subtomogram平均を計算します。 </li><li>解像度の見積もりでは、フーリエシェル相関37で2つの独立して決定さsubtomogram平均を比較します。 </li><li>剛体によるsubtomogramの平均に可能な場合は、ドック既知X線構造手動で、またはそのようなプログラムキマイラ38のものと自動シーケンシャルドッキングルーチンを使用して、フィッティング。 </li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。

ここで紹介するプロトコルは、ミトコンドリアのsubtomogram平均-ETをクライオために紹介していますが、本質的に同じ手順が、他の細胞区画又は膜に適用することができます。可能な限り最良のデータを取得するには、手順の間の重要なステップは、サンプル調製、プランジ凍結プロセスとデータ·アクイジション戦略である。成功のために重要であるサンプルの品質は、良好な画像コントラストのために最も重要である適切な氷の厚さを確保するために最適化された凍結プロトコールに依存する。最適なデータ買収戦略は、機器およびサンプルに依存します。最適化すべきパラメータは、画像ごとに電子線量、チルト方式やデフォーカスなどがあります。良いサンプルの良い断層画像を取得すると、すべてのさらなる処理工程が容易になり、良好な最終結果を保証します。 クライオ-ETは、タンパク質複合体が目に配置されている方法の詳細を提供subtomogram平均と原子モデルフィッティングと組み合わせEIRネイティブ細胞環境。技術は、呼吸鎖supercomplexes（1.7値、MDa）、ATP合成酵素の二量体（2x500 kDa）の、または核膜孔複合体（〜120値、MDa）8、9、17のような大規模な膜タンパク質複合体の構造を調査するために等しく適しています。ダイマー行が分離に必要な工程である界面活性剤抽出によって破壊されるため、行にATPシンターゼ二量体の組織は、このようなX線結晶学、NMR又は単一粒子低温電子顕微鏡などの高解像度化技術によって観察することができないおよび膜タンパク質複合体の精製。 クリステの尾根に沿って二量体の行のATP合成酵素の配列は、すべての種におけるミトコンドリアの普遍的な組織原則である。特に、複合体中の電子伝達鎖のプロトンポンプ複合体I（NADHデヒドロゲナーゼ）は、膜面積行8のいずれかの側に配置されている9。呼吸鎖のこの組織は、ミトコンドリアの生体エネルギーに大きな影響を持っています。ダイマー列による二量体特異的タンパク質サブユニットの不在に形成することができない場合、セルは図3の 41に示されている酵母変異株で観察されるように、より長い世代時間を示し、細胞の適応度を減少させた。ミトコンドリア病への関心の高まりにより、詳細なミトコンドリアの超微細構造と機能を支配する分子基盤を理解することが最も重要である。クライオ電子断層撮影法は、タンパク質の高分解能の方法によって決定された構造、およびナノメートルのスケールでの膜におけるこれらのタンパク質の分布や配置の間のリンクを提供する。これはクライオ-ETの健康と病気にミトコンドリアの構造と機能を理解するために不可欠なツールになります。 クライオ-ETにおける更なる技術開発や改良がproteiの位置を特定するために、タンパク質標識戦略を含める高分子複合体中のnサブユニットまたは細胞内のより小さい以下の異なるタンパク質の位置（&lt;0.5 MDA）があります。さらに、単一粒子分析又はヘリカル再構成で平均化subtomogramを組み合わせるハイブリッドEM処理方法は、最近〜8オングストローム42,43にタンパク質の構造を決定した。これらの処理方法は、現在だけでなく氷で分離又はヘリカルアセンブリを形成しており、現在、ミトコンドリアとクリステ膜のような混雑した細胞環境には適用されませんされて精製されたタンパク質に制限されています。データ収集のために、新たなコンピューティングおよびハードウェアツールは、自動化された断層像の取得を可能にする画像のコントラストを向上させ、総所要の電子線量を低減するために開発されている。クライオ-ETにおける唯一の根本的な制限は、電子ビームによる試料への放射線障害である。これは、非常に低い電子線量が悪い信号対tの結果として、断層の傾斜系列の各画像を記録するために使用することができることを意味最終的に達成可能な分解能を制限オルト雑音比。一年前よりも低いリリースされた新しい直接電子検出器は、現在、単一粒子低温電子顕微鏡44、45の分野に革命をもたらしている。これらの新しい検出器は、高コントラストと低電子投与量で良好な分解能を提供します。クライオ電子断層撮影の場合、これは過度の放射線損傷（1つのCCDイメージは5直接電子検出器画像に電子線量で同等である）についての懸念なしに収集することができるより小さなステップサイズあるいは二軸断層像とその傾斜シリーズを意味する。これらの検出器によって生成される膨大な量のデータが克服されなければならないデータの取り扱い、処理および記憶で自分の課題を作成します。 また、位相コントラストを高めるために光学顕微鏡で日常的に使用されるものと同様の原理で動作する位相差板は、現在、透過型電子顕微鏡46、4のために開発されている7。これは同時にアライメント断層ボリュームの解釈のために必要な低解像度の特徴を維持しながら断層像は、高解像度で、したがって焦点を合わせにより近い収集することを可能にするべきである。まとめると、これらの技術の進歩は非常にクライオ-ETによって対処することができる生物学的な質問の範囲を拡大していきます。

ミトコンドリアは、細胞のパワー·ハウスである。化学結合エネルギーにミトコンドリア内膜を横切る電気化学的プロトン勾配を変換することにより、ミトコンドリアATP合成酵素は、細胞プロセスを駆動するATPの大部分を生成する。ミトコンドリアのエネルギー変換の背後にあるメカニズムを理解するためには、in situでの ATP合成酵素の構造を決定するために、それが配置され、ミトコンドリア内膜に分布しているかを知る必要がある。全体錯体4のミトコンドリアATPシンターゼのコンポーネント1-3と低解像度のマップのほとんどの高分解能構造が利用可能であるが、それは、膜に加工酵素の構造およびコンフォメーションを確立することが重要である。ミトコンドリア内膜でのATP合成酵素の分布は広く、ランダムであると仮定されているが、5を見つけ早期に私たち自身の最初の結果図6は、これがtではないことが示された彼の場合。電子伝達鎖のプロトンポンプがいずれかの側に位置するように見える一方、当社グループとその他の7からの後続の研究は、ATP合成酵素が、ミトコンドリア内膜のクリステ8のきつく湾曲した隆起部に沿って二量体の長い列に配置されていることを確認した行9の。この配置は、ミトコンドリアのエネルギー変換のメカニズムの重要な意味を持つ。 私たちはこの配置を決定するために使用した手法は、電子クライオトモグラフィー（クライオ-ET）である。クライオ-ETは、現在、分子分解能で細胞、細胞区画または小器官の正確な3次元（3D）ボリュームを提供する唯一の方法です。膜は、良好なコントラストで表示され、3次元断層体積でトレースが容易であるためクライオ-ETは、生体膜に大きな複合体を研究するために特に適している。 細胞またはorganellの三次元構造を研究するための他の方法ESは、分子の詳細を提供しない。超解像光学顕微鏡10、図11は、数十nmの精度で目的のタンパク質に付着した発光ラベル間の位置や距離を明らかに優れているが、それは、低解像度で、タンパク質自体の構造を明らかにしない。プラスチック包埋された生物学的サンプルの電子顕微鏡13を走査して、連続切片12またはブロック顔画像の透過型電子顕微鏡は、細胞容積の低解像度のビューを提供するが、同様の分子の詳細を明らかにしない。原子間力顕微鏡14は、原理的には 、分子あるいは原子分解能を提供するが、唯一の原子レベルで平坦な、固体支持体上の物体の表面にすることができる。最後に、X線断層撮影法15または自由電子レーザーからの強いX線パルスの散乱16は、mにおける全細胞または細胞小器官などの、大規模で複雑 ​​な、非周期的なオブジェクトの構造を明らかにしにくい予見可能な将来にolecular解像度。したがって、現時点で、ナノメートル分解能での細胞または細胞小器官の3D構造の研究のために、ETをクライオする代替はありません。 クライオ-ETは、核膜孔複合体17を含む膜結合タンパク質集合体の構造とコンフォメーションを調べるために選択される方法である、インフルエンザスパイクは18と錯体を形成すると、鞭毛モータータンパク質22、23だけでなく、細菌細胞全体19の組織化細胞20-23にログインHIV等の病原性ウイルスの侵入。クライオ-ETは、アクチンフィラメント24または軸糸25を含む繊維状タンパク質や細胞内のそれらの相互作用を、可視化するための非常に貴重です。解像度が繰り返される、規則的な特徴のサブボリュームは、単一粒子画像プロ断層ボリュームから切り出し、平均化されることによりsubtomogramは、26を平均化することにより2nm程度以上に向上させることができるcessing技術。 クライオ-ETは、透過型電子顕微鏡（TEM）で異なる傾斜角度で撮影された薄い試料（&lt;250nmで）の投影画像の系列を取得することを含む。物質と強く相互作用する電子は、一度以下で散乱されないように、試料が薄くなければならない。多重散乱は解釈が得られる画像を困難にし、コントラストを低下させる。選択された標本領域の画像がそれぞれ互いに対して位置合わせされ、検体の3次元ボリュームを生成する、適切なコンピュータプログラムによって、3D空間に投射される。画像の位置合わせは、冷凍前にサンプルと混合された金基準マーカによって補助される。理想的には10又はより均一に分布基準マーカは、良好なアラインメントを達成するために、各画像に存在すべきである。 分子細部を観察するために、試料はプランジ凍結液体エタン中で、それらの天然の水和状態を維持している。液体中にフリーズエタンは、水が結晶化しないことを（〜10 5℃/秒）27非常に高速ですが、ガラス化し、ガラスのような状態のままになります。氷晶形成損傷敏感生物学的構造。生物学的サンプルは、放射線損傷に苦しむように、試料が耐えられる散乱事象の合計数には限界がある。画像は、このように低線量モードで取得されています。関心領域は、1電子以下の電子線量を低倍率（1,500X）で識別されている- / nm 2で（サーチモード）。画像は、関心（フォーカスモード）の面積から、高倍率で結像される。画像が取得された場合にのみ、関心領域は、より高い電子線量（撮影モード）を照射する。 ここでは、例として、ミトコンドリア内膜でのATP合成酵素二量体を使用して、クライオ電子断層像を収集し、処理する方法の概要を提示する。以下のプロトコルを設定する方法を、クライオ-ETのためにミトコンドリアを準備する方法について説明します特定の総電子線量で傾斜シリーズを収集し、どのように関心領域の3Dボリュームを得るために、傾斜シリーズを処理する。手順の概要は図1に示されている。

<table><tbody><tr><td>スクロース</td><td>ロス</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>トレハロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9449</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>ザイモラーゼ</td><td>バイオモール</td><td>Z1000.1</td><td></td></tr><tr><td>密度勾配 媒体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556 または P1644</td><td></td></tr><tr><td>プロテイン A 金</td><td>オーリオン</td><td>810.111</td><td>10 nm</td></tr><tr><td>エタン</td><td>エア リキード</td><td>P0502S02R0A001</td><td></td></tr><tr><td>窒素</td><td>エア リキード</td><td>I4150RG</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Consumables</strong</td></tr><tr><td>>Filter paper</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1004 090</td><td>Nr 4</td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Dumont</td><td>T506</td><td>非磁性、パターン #5</td></tr><tr><td>EM 複合テストグリッド</td><td>Plano GmbH</td><td>S142</td><td>穴の開いたカーボンフィルムにグラパイトと金の島</td></tr><tr><td>ホーリーカーボングリッド</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbHまたはC-flat</td><td></td><td>R2/2 300 Cuメッシュ</td></tr><tr><td>クライオグリッドボックス</td><td>Plano GmbH</td><td>160-42</td><td>代替自家製金属ボックス</td></tr><tr><td>ポッター</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P7984</td><td></td></tr><tr><td>ブレンダー</td><td>ワーリング</td><td>8011S</td><td></td></tr><tr><td>ガラスビーズミル - ビーズビー</td><td>ターBioSpec製品</td><td>1107900-105</td><td>0.5 mm ビーズを含む</td></tr><tr><td>ボールベアリング (バルチ) ホモジナイザー</td><td>isobiotec</td><td>H8</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>46915</td><td>Sorvall RC6+</td></tr><tr><td>グロー放電装置</td><td>Bal-Tec A.G.</td><td>CTA 010</td><td></td></tr><tr><td>グリッドガラス化装置</td><td>FEI、GatanまたはLeica</td><td></td><td>代替自家製プランジャー</td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td>FEIまたはJeol</td><td></td><td>300 keV</td></tr><tr><td>直接電子検出器</td><td>Gatan</td><td>K2 summit</td><td>4k x 4k pixels, counted</td></tr><tr><td>mode 電荷結合素子 (CCD)</td> <td>Gatan</td><td>US4000</td><td>4k x 4k ピクセル (直接電子検出器の代替品</td></tr><tr><td>)エネルギーフィルター</td><td>Gatan or Jeol</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>Image acquisition software</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tomogram acquisition software</td><td>Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder</td><td></td><td>4 alternatives</td></tr><tr><td>Tomogram processing software</td><td>FEI, UCSF or UC-Boulder</td><td></td><td>3 alternatives</td></tr><tr><td>サブトモグラム平均化ソフトウェア</td><td>UC-Boulder, or University of Basel</td><td></td><td>2 alternatives</td></tr><tr><td>トモグラム可視化ソフトウェア</td><td>UC-Boulder, FEI, or University of Utah</td><td></td><td>3 alternatives</td></tr><tr><td>可視化ソフトウェアプラグイン</td><td>ゲーテ大学</td><td></td><td>http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/</td></tr> <tr><td>Structure 可視化ソフトウェア</td><td>UCSF</td><td></td><td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td></tr> <tr><td>数値計算ソフト</td><td>MathWorks</td><td></td><td>http://www.mathworks.de/academia/</td></tr></tbody></table>

電子クラ​​イオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるatp合成酵素二量体の可視化

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

クライオ電子断層撮影は、このような分子細部の細胞、細胞小器官、膜小胞、またはウイルスなどの生体試料の三次元構造を可視化することが可能な構造生物学における強力なツールです。これを達成するために、水性サンプルが急速に近いからネイティブ、凍結水和状態に保存し、液体エタン中にガラス化される。電子顕微鏡では、傾斜シリーズは、3次元断層像を再構成され、そこから液体窒素温度で記録される。断層ボリュームの信号対雑音比は、本質的に低い。認識可能な、定期的な機能には、個別のサブボリュームは、切り出さ整列し、ノイズを低減するために平均化されることでsubtomogram平均、によって強化されています。このように、2波長以上の解像度を持つ3Dマップを得ることができる。 3Dボリュームに利用可能な高解像度構造のフィットは、その後、それらの天然環境におけるタンパク質複合体の原子モデルを生成する。ここで私たちは、電子クライオtomograpを使用する方法を示してHYは、ミトコンドリアの大きな膜タンパク質複合体のin situで組織を研究する。私たちは、複雑な私はランダムに行のいずれかの側にメンブレン領域に分布しているのに対し、ATP合成酵素は、内膜クリステの高度に湾曲した頂部に沿って二量体の列に編成されていることがわかります。 subtomogram平均することにより、私たちはクリステ膜内ミトコンドリアATP合成酵素二量体の構造を得た。

ミトコンドリアの電子クライオ断層像を明確にします（ 図2）オルガネラの3次元形態を明らかにする。断層量における膜の手動セグメンテーションは、ミトコンドリア内クリステの構造を示す図である。特定のタンパク質成分を欠く異なる酵母ノックアウト株からミトコンドリアを撮像して、クリステ形態に対するこれらのタンパク質の効果を評価することによってできる。3は ATPシンターゼサブユニットe を欠く酵母株由来のミトコンドリアを示す。 ATP合成酵素複合体のこの成分は、ミトコンドリアATPシンターゼの二量化に必要とされる。この株からミトコンドリア（ 図2）野生型ミトコンドリアの正常なラメラクリステを欠き、代わりに内膜区画の番号が含まれています。これらの区画はクリステのいずれかを欠いているか、小さな風船状の膜の陥入（ 図3）を含有する。 トムにはogramsこの場合、ATP合成酵素二量体における良好なコントラスト、大型ミトコンドリアタンパク質複合体で、簡単に表示されている（ 図4;ムービー1）。 （; キャプター図5）複合体の構造はsubtomogram平均化により2-3 nmの分解能で決定することができる。 （; ムービー3、図6）の平均体積は、膜内の互いに対して及び他のタンパク質複合体への個別の複合体の組織化を評価するために、断層像に戻してもよい。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" width="500" /> クライオ電子断層撮影の段階を示す、図1のフロー· ​​チャート 。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください。</a> 野生型のS。セレビシエ由来のミトコンドリアを図2形態。野生型Sの断層ボリュームを介して中央のスライスcerevisiaeのミトコンドリア（左）と対応する表面レンダリングボリューム（右）。外膜のセグメント化されたボリュームは、グレーとライトブルーの内側境界とクリステ膜の容積に示されている。 Davies ら 8より改変。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig2highres.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" width="500" /> に必要なサブユニットを欠いS。セレビシエ株から図3ミトコンドリアATP合成酵素の二量体化。スライス断層ボリューム（左）を通り、ATP合成酵素の二量体化に必要なタンパク質サブユニットEを欠いSからのミトコンドリアの表面ボリュームレンダリング（右）。 セレビシエ株に付随する。 図2と比較すると、変異株からミトコンドリアは、野生型ミトコンドリアの正常なラメラクリステを欠いている。その代わりに、ミトコンドリアなしクリステまたはバルーン状のクリステのいずれかと、多くの内膜コンパートメントを持っています。このように電子クライオトモグラフィーは、遺伝子欠失に起因した膜の形態の変化を強調しています。 Davies ら 8より改変。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" width="500" /> Figur真菌P.からのE 4ミトコンドリアanserina。糸状菌Pからミトコンドリアの断層容積（左）と（右）添付表面ボリュームレンダリングをスライスanserina。この断層では、10 nmの粒子（黄矢印）の行は内膜クリステにおいて高度に湾曲した膜尾根上に位置する（ 動画1を参照）。これらの粒子はsubtomogram平均化によるATPシンターゼ二量体として同定された。デイヴィスら 9。から<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください。</a> <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig5highres.jpg" width="500" /> ミトコンドリアATPシンターゼの図5の構造と組織。側面及びSからATPシンターゼ二量体の電子密度を示す上面図C言語<html>あてはめた原子モデル（左）との平均化subtomogramによって決定されるerevisiae。行（右）でのATP合成酵素二量体の組織を示すミトコンドリア内膜小胞。図は、平均化の際に計算された座標を用いて、膜小胞のセグメント化されたボリュームにATPシンターゼ二量体のsubtomogram平均を位置決めすることによって作製した。 Davies ら 8から適応した。原子モデル：F 1 /ローターリング[PDB：2WPD] 39（青と紫）;敏感与えるタンパク質-OSCP [PDB：2BO5]オリゴ40（緑）;周辺茎断片[PDB：2CLY] [PDB：2WSS]からのN末端 ​​残基と1。2（黄色と赤）（ 動画2参照） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig6highres.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください。</a> <html> _upload / 51228 / 51228fig6highres.jpg &quot;幅=&quot; 500 &quot;/&gt; Pから図6絶縁型稜小胞anserinaミトコンドリア。スライスPから稜小胞の断層量（左）と（右）添付表面レンダリングボリュームからanserina。膜から突出したタンパク質の濃度がはっきりと見える。 subtomogram平均によって識別されるように、黄色の矢印で示された密度は、ATP合成酵素二量体である。緑矢印は、NADHデヒドロゲナーゼとして抗体標識により識別密度を指す（1複合体;詳細は9を参照）。タンパク質濃度のセグメンテーション（参照行のいずれかの側上の膜領域において高度に湾曲したクリステの尾根に沿って列を構成（赤と黄色）、ATP合成酵素二量体およびNADHデヒドロゲナーゼ複合体（緑色）で、クリステにある組織を明らかにするムービー3）。 Davies ら 9から。28 / 51228fig7highres.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください。 Pの作品1。電子クライオ断層anserinaミトコンドリア。映画は糸状菌Pからミトコンドリアを撮影した断層体積を連続したスライスを示しているanserina。 ATPシンターゼの行は黄色矢印で示されている。表面レンダリング、セグメント化されたボリュームは、3Dクリステ構造との関係でATP​​合成酵素（黄色の球）の位置を示しています。外膜、灰色;内側境界膜、透明な青;クリステ膜、不透明な青。 Davies ら 9から。また、 図4を参照してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie1.mp4" target="_blank">ビデオを見るにはここをクリックしてください。</a> ムービーSからのミトコンドリアATP合成酵素二量体の2 Subtomogram平均。あてはめた原子モデルとセレビシエ 。平均した121サブボリュームから計算。密度は3等高線のレベルで表示されます：1秒は - メッシュ、2秒 - ライトグレーと3S - 濃い灰色。原子モデルは、キメラシーケンシャルフィットルーチンを使用して密度に適合させた。原子モデル：F 1 /ローターリング[PDB：2WPD] 39（青と紫）;敏感与えるタンパク質-OSCP [PDB：2BO5]オリゴ40（緑）;周辺茎断片[PDB：2CLY] 1 [PDB：2WSS]からのN末端 ​​残基を持つ。2（黄色と赤） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie2.mov" target="_blank">のビデオを見るにはここをクリックしてください。</a> Davies ら 8から適応した。 図5をも参照してください。 ムービー3 Pから分離されたクリステ小胞anserinaミトコンドリア。連続スライス断層ボリュームスルーをセグメント化された表面ボリュームレンダリング、続いて表示されます。 membranから突出タンパク質密度eは、はっきりと見える。赤と黄色の密度は、ATP合成酵素二量体である。抗体標識によって決定されたグリーン密度は、NADHデヒドロゲナーゼ（複合体I）である。 Davies ら 9から。また、 図6を参照してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie3.mpg" target="_blank">ビデオを見るにはここをクリックしてください。</a>

私たちは、収集する方法のプロトコル全体ミトコンドリアのプロセス電子クライオ断層像を提示する。技術はネイティブ生体膜に大きな膜タンパク質複合体の構造、機能、および組織への詳細な洞察を提供しています。

電子クラ​​イオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

本手順の全体的な目的は、C twoにおけるミトコンドリアタンパク質の構造と組織を明らかにすることです。まず、サンプルを含む凍結含水電子顕微鏡グリッドを作製します。次に、クライオ電子顕微鏡を用いて、サンプルの線量制限傾斜シリーズを記録します。次に、ティルトシリーズを処理してトモグラフィーボリュームを生成します。最終的に、タンパク質密度の平均化を行うことでタンパク質の構造を決定し、膜をセグメンテーションしてその3D構造を明らかにします。平均化したタンパク質のデータをトモグラムに再配置することで、膜内におけるタンパク質の構造と組織化が明らかになります。ミトコンドリアが分子レベルでどのように機能しているかを理解するために、クライオ電子トモグラフィーを用いて解析を行います。薄いプラスチック切片を用いた電子顕微鏡観察などの他の手法に対する本手法の主な利点は、解像度が高いことです。試料に化学的な固定処理を一切行わないため、タンパク質の分子レベルの詳細な構造が保持されます。電子クライオグラフィーの技術を習得するには時間がかかる場合がありますが、熟練したユーザーであれば、1回のセッションで5〜6枚の高品質なTOM用グリッドを作成することが可能です。この手順で最も困難なのは、最適な氷の厚さを持つ凍結含水グリッドを作製することです。テキストプロトコルに従ってミトコンドリアを単離しペレット化した後、10 millimolar HEPA buffer中の250 millimolar T triosesを用いて、全タンパク質濃度が約5 mg/mLになるようにペレットを再懸濁し、グロー放電を行います。メーカーの指示に従い、真空装置内でカーボンEMグリッドをカーボン面を上にして処理します。液体窒素で冷却したアルミニウム容器の内側にエタンガスを噴射し、数ミリリットルのエタンを液化させます。ピンセットを用いてグロー放電処理したDMグリッドを取り出し、ベンチ上に置きます。共役金フィデューシャル懸濁液をミトコンドリア懸濁液と1:1の割合で混合し、直ちにその溶液を3 µL分グリッドに滴下します。次に、自作のギロチンなどのガラス化装置にピンセットをセットし、フィルターペーパーのくさびを用いてグリッドから余分な液体を吸い取った後、トリガーを放してグリッドを直ちに液体エタンにプランジさせます。その後、グリッドを液体エタンから液体窒素へと移します。新しいフィルターペーパーのくさび形チップを液体エタンに浸し、グリッド上の余分なエタンを除去します。液体が上昇するのに合わせ、グリッドを液面に浸したままフィルターペーパーに沿ってゆっくりと引き上げ、直ちに液体窒素に移して保存します。グリッドをグリッドボックスに入れ、液体窒素を満たした容器に保存し、後でトモグラフィーティルトシリーズを記録します。まず、液体窒素ドーザーが満たされていることを確認し、試料ステージとグリッド転送装置の温度が100 kelvin以下であることを確認します。テストグリッドの画像を撮影し、ソーンリングの品質を確認することで、電子顕微鏡のアライメントが適切になされているかを確認してください。ソーンリングは円形であり、画像の端まで伸びている必要があります。次に、凍結水和ミトコンドリアを載せたグリッドを挿入します。次にサーチモードで、適切な氷の厚さと試料品質を持つ領域を探索します。有望な領域のサーチ画像を6秒間撮影し、データ収集に適しているか判断します。良好な試料領域を特定した後、ステージをプラスまたはマイナス60度まで傾け、グリッドバーや、同様の外観を持つ近接した氷充填孔内の氷結晶によって露光領域やフォーカス領域が遮られることなく利用可能な最大傾斜範囲を確認します。その後、露光モードに切り替え、ビーム強度または画像取得時間を調整します。したがって、記録される各画像のエレクトロンドーズは、CCDの場合は1ピクセルあたり30〜50電子、または1ピクセルあたり1秒間に6〜8電子となります。直接電子検出器の場合は、空孔上の0度で取得した1秒間画像の平均電子数を、60度で取得した1秒間画像の平均電子数で割ることで、ドーズ分布比（I 0/I 60）を算出します。露光モードで1秒間の画像を取得し、1 Å²あたりの電子数を記録してください。線量分布比を考慮し、適切な自動データ収集ソフトウェアを用いて、特定の総電子線量で記録可能な総画像数とチルト間隔を算出します。決定したパラメータを用いて、典型的なトモグラムをセットアップし、記録します。これらの試料については、±20度から開始し、高チルト角に達する前に0度を経由するように設定してください。トモグラムを作成しセグメンテーションを行うには、ティルトシリーズを再構成ソフトウェアに適したファイル形式に変換します。ImmodのようなTom Graham再構成プログラムを使用して、金フィデューシャルマーカーの位置を指定して画像をアライメントします。アライメント後、Tommo Grahamを生成します。可視化のために、IMODに付属している非線形異方性拡散フィルターなどの画像フィルターを使用して、トモグラムのコントラストを向上させます。市販のプログラムを用いて、手動でトモグラムのセグメンテーションを行います。内膜と外膜に対応するボクセルをそれぞれ別のレイヤーに割り当て、割り当て完了後、膜を可視化するためのサーフェスを作成します。emira用のEMパッケージプラグインのクリッカーオプションを使用して、TP合成酵素粒子の位置をマークし、マークした粒子を入力として、粒子推定などの適切なソフトウェアパッケージを用いて解析します。電子トモグラフィープログラムで、分解能推定のためのアグラム平均を算出します。フリーの可視化プログラムを使用して、独立して決定された2つのサブトモグラム平均間のフーリエシェル相関を算出します。まず手動で、次にこの図に示すようにfitコマンドを用いて自動的に、Chimeraを用いて既知のX線構造をサブトモグラム平均に適合させます。ミトコンドリア電子クライオ電子断層撮影における膜の手動セグメンテーションにより、ミトコンドリア内のクリステの構造が明らかになります。特定のタンパク質を欠損した酵母ノックアウト株のミトコンドリアをイメージングすることで、これらのタンパク質がクリステの形態に及ぼす影響を評価できます。ここに、TP合成サブユニットEを欠損した酵母株のミトコンドリアを示します。このサブユニットは、TP合成ダイマーの形成に必要です。野生型ミトコンドリアに見られる正常なラメラクリステとは異なり、これらのオルガネラには、クリステを欠くか、あるいは小さな風船状の膜陥入を持つ内膜構造が多数含まれています。コントラストの良い画像では、黄色の矢印で示すように、TP合成ダイマーが容易に確認できます。膜をセグメント化することで、黄色い球体で示されたATP合成酵素の位置を、クリスティの形態に関連付けて可視化することができます。この例では、ATP合成酵素はクリスティの高度に湾曲した縁に沿って二量体の列を形成しています。サブトモグラム平均化により、タンパク質の構造を4 nm以上の分解能で決定することが可能です。既知のX線構造をフィッティングさせることで、図に示すように、天然環境におけるタンパク質複合体の平均原子モデルを構築することができます。この例では、個々の複合体とお互いの位置関係、および膜内の他のタンパク質複合体との位置関係の整理を容易にするため、平均ボリュームをTomo Grahamに書き戻すことができます。本プロトコルでは、電子クライオトモグラフィーを用いて、ミトコンドリア内膜におけるタンパク質複合体の構造と組織化を決定する方法を説明します。また、このプロトコルは、異なる細胞内コンパートメントにおける他の膜結合タンパク質の構造と組織化の決定にも利用可能です。良好なサーモグラムを取得するためには、試料調製が極めて重要です。凍結水和グリッドには、厚さが70〜150 nmの完全に非晶質（ビトリアス）な氷の領域が含まれている必要があります。通常、最適な氷の厚さと試料品質を備えた領域が見つかるまで、5〜6枚のグリッドをスクリーニングします。グラム収集には、専用のクライオステージ、エナジーフィルター、および直接電子検出器を備えた300 kilovolt透過電子顕微鏡が最適ですが、サイドエントリークライオステージとCCDカメラを備えた200 kilovoltの装置でも使用可能です。このビデオを視聴することで、クライオグリッドの調製方法について十分に理解できるはずです。ティルトシリーズを収集し、トモグラムを再構成して、サブトモグラム平均を算出してください。これらは、細胞内におけるタンパク質の組織化が、効率的なATP合成などの生物学的機能を遂行する細胞の能力にどのように影響するかを調査するために必要な基本スキルです。液体窒素および液体エタンの取り扱いは非常に危険であるため、常に保護メガネと手袋を着用することを忘れないでください。

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電子クラ​​イオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化

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