Name: マウスにおける急速な非侵襲腰椎髄腔内注射を経由して生体内 siRNAトランスフェクションと脊髄における遺伝子ノックダウン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: 学ぶマウス腰椎髄腔内注射による非侵襲的siRNAトランスフェクション法。脊椎内局所的な遺伝子ノックダウンを実現し、神経科学研究や遺伝子治療への応用が期待される技術です。

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すべての動物に使用する手順は、ローカルの管理組織（Regierungspräsidiumカールスルーエ、カールスルーエ、ドイツ）が定める倫理指針に従った。 1。のsiRNA / PEI複合体の調製 以下のようなsiRNA / PEI複合体溶液を製造業者の指示を用いて調製される。 <ol><li>溶液A：端体積の四分の一までの無菌水を有するsiRNAの所望の量（必要な場合）で希釈し、端体積の半分まで10％グルコース溶液を上にして、さらにこれを希釈する。ボルテックス優しく上下にピペッティングにより混和する。 siRNAの最適量は、経験的に決定される必要があるが、動物あたり10μlの複合体溶液中の1μgのsiRNAは、最適化のための良い出発点である。 </li><li>溶液B：エンドボリュームの4分の1に滅菌水を上にして、PEI試薬の必要な量を希釈し、最終体積の半分、10％グルコース溶液を上にしてこれをさらに希釈する。渦GEntlyまたは上下にピペッティングにより混和する。 注意：PEI試薬の量は、トランスフェクションの効率に影響の複合体中のイオンバランスを決定します。同様に、PEI溶液の最適量は、経験的に決定されなければならない。私たちの手では、最適量は1μgのsiRNAのあたりのPEI溶液を0.12μLです。 </li><li>溶液Bと溶液Aを混合一斉に、穏やかにボルテックス。 </li><li>使用前にRTで15分間混合液をインキュベートする。この複合体は、4℃でRTで2時間および24時間安定である</li></ol> 2。髄膜注射<ol><li>それが正向反射の兆候を示していないまで、3％イソフルランでマウスを麻酔。加えて、さらなる麻酔の状態を確実にするために、テールおよび/または足のピンチレフをチェック。 </li><li>針挿入時に良好な視覚化を容易にするために、尾の付け根付近の動物の後方端部に毛皮の約2 cm 2とを剃る。 </li><li>マウスを所定の位置に手順の間に継​​続的なイソフルランの投与のためのノーズコーン、1.5％イソフルランを削減し、目の潤滑剤で、マウスの目をカバーしています。 </li><li>針に30のG 0.5に添付25μlのハミルトンシリンジを使用したsiRNAの混合溶液を使用する準備が準備します。 </li><li>最も顕著な1であること、静かにそれを押すことで、この領域を中心に、脊椎動物の列を修正する必要のある、L6の棘突起の位置を確認します。 </li><li>慎重にL5およびL6椎骨の溝との間に針を挿入し、このサインが硬膜内空間での針の成功エントリを示すのでテールフリックを観察。 ヒント：指の爪を使用して、1が同様に溝を見つけることができるはずです。 </li><li>テイルフリックが観察されたら、すぐに、しかし慎重に、一方の手で針位置を固定し、他方をゆっくりと物質の所望量を注入する。 ヒント：5〜10μlの間のボリュームがボリュームとして最適である5未満＆＃181、Lは信頼性が低く、10μLよりも大きなボリュームがあまりにも多くの圧力につながる。 </li><li>噴射が行われた後、麻酔から回復するためにケージに戻ってマウスを移動します。 </li><li>標的遺伝子の最適なダウンレギュレーションを達成するために、この注射を少なくとも2回以上24時間毎に繰り返します。 </li></ol>

<ol><li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+morphine+in+mice%3A+a+new+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> Eur. J. Pharmacol. 67, 313-316 (1980).</li>
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<li>Bourinet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+the+Cav3.2+T-type+calcium+channel+gene+in+sensory+neurons+demonstrates+its+major+role+in+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Silencing of the Cav3.2 T-type calcium channel gene in sensory neurons demonstrates its major role in nociception.</a> EMBO J. 24, 315-324 (2005).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+to+dorsal+root+ganglia+by+intrathecal+injection%3A+effects+on+regeneration+of+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene transfer to dorsal root ganglia by intrathecal injection: effects on regeneration of peripheral nerves.</a> Mol. Ther. 12, 314-320 (2005).</li>
<li>Wigdor, S., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+and+systemic+morphine-induced+antinociception+in+mice%3A+contribution+of+descending+serotonergic+and+noradrenergic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Central and systemic morphine-induced antinociception in mice: contribution of descending serotonergic and noradrenergic pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 242, 90-95 (1987).</li>
</ol>

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

従って、髄腔内注射針の上記の技術は、有効な高速、特異的に局在し、かつ非破壊的である。技術的には、この手順の最も重要な側面は、溝に針の挿入のポイントです。それは、この手順は非常に穏やかに手と忍耐で行われていることが重要です。多くの外科的処置と同様に、トレーニングが成功した注入速度を向上させます。実際の実験中に、この手法は、直接注射が成功したか否かを確認するために、明白な指標を提供しないので、これもまた重要である。正しい針の挿入の唯一の目に見える指標は、バスレフとして観測されるテールフリックです。 この方法は、完全にそのような投与量および低減を制限する副作用を可能にする脊椎変調の特異性のような他のsystemical送達経路（ 例えば 、経口、静脈内、腹腔内等 ）、上髄腔内送達の利点を保持する。ファーthermore、髄腔内注射は、通常、髄腔内注射の際ので、血液脳関門を通過しないれる物質の送達を可能にする、針が硬膜と脊髄の間に挿入される。しかし、重要なことに、髄腔内送達の他の方法と比較して、髄腔内注射針注入法は、任意のかなりの組織損傷を引き起こしたり...

脊髄は加工や痛みを伴う（侵害受容性）の入力4-7の送信を含む主要な生物学的プロセスおよび生理的機能の様々な非常に重要な中心地です。様々な実験技術は、髄腔内カテーテル8、脊髄マイクロインジェクション、および髄腔内注射針9の慢性的注入として、脊髄の薬理学的調節を容易にするために開発されてきた。それぞれの手法には独自の利点と欠点があり、実験パラダイムによっては一つの技術は、他よりも適しているかもしれません。髄内へのカテーテルの慢性的注入はラットにおいて容易に実現可能であるのに対して、この方法は、サイズの制限が指定され、マウスでは非常に困難である。成功率は非常に低く、運動障害は、しばしば、マウスにおいて厳しく限定さ硬膜下腔カテーテルのかさばる存在に起こる。また、薬の長期的な配信が頻繁な血液凝固にレ​​ンダリングされる慢性的に注入されたカテーテルの。最後に、免疫反応が一般的です。 これらの問題は、マウスの脊髄への薬物および試薬の迅速かつ解剖学的に制限されたアプリケーションを可能にしますpreimplantedカテーテルの非存在下で針を介して急性髄腔内注射の方法を使用して回避することができる。この方法は、完全に脊椎低減投与量および制限副作用を可能にする調節、ならびに物質がない送達する能力の特異性のような他の全身送達経路（ 例えば 、経口、静脈内、腹腔内等 ）上の髄腔内送達の利点を保持する髄腔内注射の間、針が硬膜と脊髄の間に挿入されているため、通常は血液脳関門を通過しない。しかしながら重要なことには、髄腔内送達の他の方法と比較して、髄腔内注射針注入法では、多数のアプリケーションを可能にする、最小侵襲性で任意のかなりの組織損傷を引き起こしたり、異物の移植による免疫反応を惹起せずに同じ動物。ただし、有効性を可能にするために、針の非​​常に正確な標的化のための技術的なスキルが必要です。 ここでは、視覚的に具体的に腰部脊髄を標的化するための最適な成功率を達成するための方法を示す。この実験で選択される注射部位は、脊髄脊椎を損傷する可能性を最小限にするために、終了に近いところ、L5およびL6脊椎動物列間の溝である。また、我々は、siRNAを用いた脊髄中の遺伝子をノックダウンするために、この技術の使用を示す。

<table><tbody><tr><td>In Vivo-jetPEI</td><td>Polyplus</td><td>201-10G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>WAVE1 siRNA</td><td>サンタクルーズ</td><td>sc-36832</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>コントロールsiRNA-A</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-37007</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>抗抗体-チューブリンIII抗体</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>抗WAVE1抗体</td><td>R&Dシステムズ</td><td>AF5514</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ファストグリーン染料</td><td>Sigma</td><td>F-7252</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>バクスター</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>イソフルランセットアップ</td><td>Dr&auml;ger L&uuml;ベック</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>シェーバー</td><td>・ウェラ</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ハミルトンシリンジガスタイト1702</td>ハ<td>ミルトン</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>30 G 1/2 in 13 mm ニードル</td><td>BD Microlance</td><td>304000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロスコープ ライカ MS5</td><td>ライカ</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>qRT-PCR用WAVE1フォワードプライマー</td><td>Sigma</td><td></td><td>cacagagcctcaggacagg</td></tr><tr><td></td><td>qRT-PCR用WAVE1逆プライマー</td><td>cttttcaccaacggcatctt</td>FastStart Essential DNA Green Master Roche 6402712001&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウスにおける急速な非侵襲腰椎髄腔内注射を経由して生体内 sirnaトランスフェクションと脊髄における遺伝子ノックダウン

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

このレポートでは、カテーテル注入のすなわち独立した非侵襲的な方法で、急性くも膜下針注射技術に関するステップバイステップガイドを、説明しています。この手術法の技術的な制限は、手のフィネスにある。注射は、特に訓練された実験のために、迅速であり、この技術では、組織破壊が最小であるので、反復注射が可能であり、外来ツールにさらに免疫反応が起こらず、それによってより良く読み出すより具体的に与えること（ 例えばカテーテル）。脊髄変調の。物質の適用は、主として脊髄の標的領域に制限されるので、薬物は、大用量で適用する必要はなく、他の組織でのより重要なのは望ましくない効果は、全身送達で観察されるように、1を回避することができる2。また、我々はpolyethylenimの助けを借りて、核酸のin vivoトランスフェクションで、この手法を組み合わせるINE（PEI）の薬理学的薬剤の配信だけでなく、遺伝子、RNA、およびタンパク質モジュレーターを経由して 、脊椎の機能を研究するための多大な汎用性を提供し、試薬3、。

成功した注入を例証するために、我々は成体のC57Bl6マウス（8〜10週齢）にファストグリーンFCF染料を使用してこの手法を行った。動物は、染料が拡散し、次いでCO 2過剰投与により殺しするのに十分な時間を提供するために、注入後数分間回復させた。その後、脊椎動物の列には、解剖し脊髄を露出させた。拡散色素に対応する青色の斑点は、注射部位をマーク。脊髄への損傷の兆候は、この手法（ 図1A）の最小限の侵襲性を確認した、見られなかった。注入された色素は、わずか数分の注入（ 図1B）の後に、脊髄の胸部領域まで到達し、吻側注射部位から拡散。また硬膜外腔の染料の成功注入は、内部（ 図1C）、脊髄の染色表面によって証明ではなく、可能性があります。 ビボトランスフェクションのに非常に有効なsiRNAを可能にしました。 siRNAを髄腔内送達した後（3回、一回ごと...

このレポートでは、短い持続軽麻酔下マウスにおける腰椎脊髄におけるsiRNAのローカライズされたトランスフェクションのための髄腔内針穿刺の簡便かつ迅速な技術が記載されている。

マウスにおける急速な非侵襲腰椎髄腔内注射を経由して生体内 siRNAトランスフェクションと脊髄における遺伝子ノックダウン

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

この手順の全体的な目的は、脊髄への髄腔内投与によりiRNAを局所的に適用することです。まず、最適なI-R-N-A-P-E-I複合体試薬を調製します。次に、マウスを髄腔内注射に向けて準備します。少なくとも15分間のインキュベーション後、siRNA混合液をハミルトンシリンジで吸引します。最終ステップとして、慎重に髄腔内注射を行い、最適なダウンレギュレーションを確実にするため24時間ごとに注射を繰り返します。最終的に、イムノブロッティングおよび定量リアルタイムPCRにより確認します。INAトランスフェクションによるタンパク質およびmRNAレベルのダウンレギュレーションが成功したことを示すために、PCRが用いられます。この手法の主な利点は、カテーテル内注入や脊髄注入よりも侵襲性が低いことです。一般的に、この方法に不慣れな者は、脊髄を損傷することなく脊柱の小さな隙間から注入するために必要な、極めて高度な技術を習得する必要があります。SIR A溶液を調製するには、まず所定量のSIR Aを滅菌水で希釈します。次に、これを10% glucose溶液でさらに希釈し、ピペッティングにより混合します。PEI溶液を調製するには、必要な量のPEI試薬を滅菌水で希釈し、さらに10% glucose溶液で希釈して、ピペッティングにより混合します。次に、Irna溶液をPEI溶液に一度に加え、軽くボルテックスした後、混合液を室温で15分間インキュベートします。インキュベーションの間に、マウスの髄腔内注射の準備を行います。3%イソフルランでマウスを麻酔し、尾の付け根付近の被毛を約2平方センチメートル分刈り取り、注射部位をアルコールで清浄します。その後、処置中のイソフルラン投与を継続させるため、マウスをノーズコーンに固定し、イソフルラン濃度を1.5%に下げます。30ゲージの1/2インチ針を装着した25 µLハミルトンシリンジを用いて、5〜10 µLを注射するのに十分な量のIrna PEI溶液を吸い上げます。次に、最も突出した棘突起である L6 を特定します。L6 の直上を軽く押し、体全体を圧迫せずに棘突起を感じられる程度の圧力をかけて、この領域の脊柱を固定します。その後、爪を用いて、L5 と L6 椎体間の溝を特定します。次に、第5腰椎（L5）と第6腰椎（L6）の間の溝に慎重に針を刺入し、尾がピクッと動く（テールフリック）ことを確認します。これは、針が硬膜下腔に正常に到達したことを示しています。テールフリックが観察されたら、すぐに片手で慎重に針の位置を固定し、もう一方の手で5 µLから10 µLの物質をゆっくりと注入します。注入が完了したら、マウスをケージに戻し、麻酔から回復させます。標的遺伝子の最適なダウンレギュレーションを達成するために、この注入を24時間ごとに少なくともあと2回繰り返します

in-vivo-sirna-transfection-gene-knockdown-spinal-cord-via-rapid

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生物学

マウス脊柱を安定させ、繰り返し実行するために低侵襲プロトコル...

二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

出典: Tadokoro, T., et al.成体マウスにおける軟膜下アデノ随伴ウイルス9(AAV9)ベクター送達J. Vis. 経験。(2017年)このビデオは、マウスの脊髄への遺伝子送達のための軟膜下注射技術を示しています。この手順には、硬膜を露出させ、軟膜に穿刺し、蛍光タンパク質発現遺伝子を運ぶ組換えアデノ随伴ウイルス (rAAV)...

遺伝子発現を評価するためのマウス脊髄における軟膜下遺伝子送達

出典: Li, D., et al.成体マウスにおける組換アデノ随伴ウイルスの直接髄腔内注射J. Vis. 経験。 (2019年)このビデオは、覚醒マウスの脳脊髄液(CSF)にアデノ随伴ウイルス(AAV)を髄腔内注射する手順を示し、注射器の準備、脊椎のアライメント、および正確な針の挿入をカバーしています。この方法は標的遺伝子送達を検証し、CNS...

中枢神経系疾患を治療するためのマウスモデルにおけるウイルスのくも膜下腔内送達

ウイルスベクターは、標的遺伝子操作が可能になります。我々は、脊髄後角へのウイルスベクターの定位注射、一次体性感覚求心性および中枢神経系の神経細胞間のシナプスの接触の著名なサイトを使って、条件付き遺伝子発現やマウス脊髄におけるアブレーションのための方法を示しています。...

マウス脊髄における条件遺伝子操作のためのウイルスベクターの定位注射

ここでは、げっ歯類の坐骨神経のシュワン細胞(SC)への遺伝子導入のためのin...

エレクトロポレーションによる齧歯類坐骨神経内のシュワン細胞へのインビボ遺伝子導入で

シュプリンガー依存組換えアデノ随伴ウイルス (下さい rAAV) の脊柱の注入は、脊髄内の任意の遺伝子組み換えラベル セル型を操作する使用できます。ここで我々...

アデノ随伴ウイルスを介する遺伝子発現により脊髄のニューロンを遺伝的に定義されています。

小動物に効率的なアデノ随伴ウイルス配信しているし、中央に伝達効率を予測するスコアリング システムを確立するウイルス ソリューションで 1%...

成体マウスの遺伝子組換えアデノ随伴ウイルスの直接髄腔内注入

ここでは、脊椎の腰部内腔にカテーテルを移植してラット中枢神経系に薬物を送出する方法について説明する。私たちはアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達に焦点を当てていますが、この方法は他の治療モダリティの送達にも適しています。...

ラット中枢神経系におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの子宮内送達

幼若ラットの腰椎槽に注射を行うための外科的処置が記載されている。このアプローチは、遺伝子治療ベクターの髄腔内送達に使用されてきましたが、このアプローチは、細胞や薬物を含むさまざまな治療に使用できることが期待されています。...

腰椎貯水槽注射による幼若ラットの髄腔内ベクター送達

腰椎髄腔内注射は、中枢神経系に遺伝子治療を実施するための翻訳的に関連する投与経路を表しています。新生児、若年、成体のマウスおよびラットにおける腰椎髄腔内注射のためのこの包括的な標準化されたプロトコルは、研究者がこの技術を前臨床遺伝子治療研究に採用する際の指針となることを目的としています。...

マウスおよびラットにおける中枢神経系を標的とした遺伝子治療ベクターの腰椎髄腔内注射

本記事では、成マウスにおけるCNS標的治療薬の鞘内投与方法を詳述し、プロトコルの精度と繰り返し注射の可能性に焦点を当てています。この研究には、反センスオリゴヌクレオチドがSOD1-ALSモデルマウスにおける変異SOD1発現を低減させた検証研究の結果が含まれており、神経変性疾患の前臨床研究におけるこのアプローチの有用性を支持しています。...

ヒトSOD1-G93AALSマウスにおける中枢神経系の正確な標的化と予測効果のためのSOD1-ASOsの腰椎鞘内注射

学ぶマウス腰椎髄腔内注射による非侵襲的siRNAトランスフェクション法。脊椎内局所的な遺伝子ノックダウンを実現し、神経科学研究や遺伝子治療への応用が期待される技術です。

マウスにおける急速な非侵襲腰椎髄腔内注射を経由して生体内 siRNAトランスフェクションと脊髄における遺伝子ノックダウン

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